肿瘤增殖型腺病毒介导的shRNA干扰结肠癌细胞HT-29 Survivin基因的时效性研究

目的探讨携带针对人Survivin的shRNA的肿瘤增殖型腺病毒Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP介导的RNA干扰对结肠癌细胞HT-29中Survivin基因的时效性。方法用Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP转染结肠癌细胞株HT-29(以携带相同shRNA的增殖缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照),于转染后1d、7d、14d、28d分别检测其携带的外源性EGFP基因的表达及被转染HT-29细胞中Survivin mRNA和Survivin蛋白的表达。结果在转染后第7d,实验各组的外源性EGFP基因均有较高表达,Survivin mRNA及Survivin蛋白的表达被抑制,Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP组的EGFP基因表达明显高于其他两种载体;在转染后第14d,后二者EGFP基因表达、Survivin mRNA及Survivin蛋白表达的抑制作用显著下降,而Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP组的上述作用仍然很强;转染后28d,后二者EGFP基因表达、Survivin mRNA及Survivin蛋白表达的抑制作用基本消失,而Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP组仍然保持很高的EGFP表达率和RNA干扰效率。结论Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP介导RNA干扰能长时间高效沉默结肠癌细胞HT-29中的Survivin基因。

肿瘤特异增殖型腺病毒穿梭质粒pAd-delE1b55kD的构建

目的:构建一种对肿瘤细胞有特异靶向性的高效载体-肿瘤特异增殖型腺病毒的穿梭质粒pAd-delE1b55kD。方法:利用二步法PCR等基因重组技术,将质粒pXC1编码E1B-55kD蛋白的基因区域缺失,并保留一个BglII酶切位点,以便插入外源性基因;利用凝胶图像分析和基因测序验证所构建质粒的正确性。结果:质粒pXC1的基因序列中,编码E1B-55kD蛋白的基因区中的2279～3326bp区域缺失,该区域上游的序列中第2024位碱基C点突变为T,第2252位碱基C点突变为T及第2261位碱基G点突变为T,从而在该区域上游插入了终止密码子TGA、TAG和TAA。在终止密码子下游,保留了一个BglII酶切位点。结论:成功构建了肿瘤特异增殖型腺病毒穿梭质粒载体pAd-delE1b55kD,为肿瘤的基因治疗提供了一种对肿瘤细胞有特异靶向性的高效载体的穿梭质粒。

腺病毒介导PTEN基因对胶质瘤血管生成和肿瘤生长的影响

目的 :探讨 PTEN 对人脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长的抑制作用。 方法 :用含 PTEN基因的重组腺病毒载体Ad PTEN,体外转染人胶质瘤细胞 U87,Western印迹分析检测其表达 ,采用鸡胚绒毛尿囊膜实验检测其对血管生成的作用 ,体内实验检测腺病毒对肿瘤体积的影响 ,同时以免疫组化法检测 因子相关抗原和基质金属蛋白酶 (MMP- 2 )的表达 ,并与U87组 (不予任何处理 )和 Ad X- gal转染组相比较。结果 :U87转染 Ad PTEN腺病毒后 PTEN表达上调 ,U87组的血管指数、体内肿瘤体积、 因子相关抗原和 MMP- 2的表达病理指数均显著多于 Ad X- gal和 Ad PTEN组 (P<0 .0 5 ,P<0 .0 1 )。结论 :PTEN可抑制肿瘤血管生成 ,并抑制体内肿瘤的生长。提示

重组腺病毒介导IL-2、TNF-α抗肿瘤实验研究

目的 研究腺病毒介导的细胞因子基因hIL 2、hTNF a对人肺腺癌细胞系的生物学特性的影响 ,探讨重组腺病毒的体内抗肿瘤作用。方法 将分别携带有hIL 2基因、hTNF a基因的重组腺病毒 (rAd hIL 2、rAd hTNF a)感染人肺腺癌Anip973细胞系 ,通过细胞生长实验、克隆形成实验等观察其对肿瘤细胞的作用 ;利用PCR技术对转染后的细胞进行检测并应用ELISA试剂盒检测转染后的细胞IL 2、TNF a的分泌量 ;通过肿瘤局部注射rAd hIL 2、rAd hTNF a的方法观察其在小鼠体内的抗肿瘤作用。结果 rAd hIL 2、rAd hTNF a经纯化后 ,滴度可达 10 1 0 PFU ml,当病毒为 30MOI时 ,对Anip973细胞的转染率达 90 %以上。体外转染的肿瘤细胞生长能力、克隆形成率等无明显变化。 2 4h细胞培养上清IL 2的分泌量为 5 0pg 2× 10 5细胞 ,TNF a的分泌量为 2 0pg 2× 10 5细胞。体内实验表明注射rAd LacZ、rAd hIL 2、rAd hTNF a的小鼠肿瘤生长缓慢 ,体积明显小于对照组 (P <0 0 5 ) ,生存期显著延长。结论 腺病毒介导的细胞因子基因hIL 2、hTNF a转染的肿瘤细胞形态学未见明显变化。转染hIL 2、hTNF a基因的肿瘤细胞可表达IL 2及TNF a。rAd hIL 2、rAd hTNF

腺病毒介导M-CSF,IFN-γ基因转染的腹腔巨噬细胞对体外抗肿瘤免疫功能影响的研究

巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)-IFN-γ是两种与单核巨噬细胞密切有关的细胞因子．M-CSF除了准持骨髓巨噬祖细胞增殖、分化、存活之外，对于成熟的Mφ也有一定的调节作用。IFN-γ是一种较强的巨噬细胞激活因子(MAD，除了激活Mφ外，也可刺激NK，LAK细胞的活性．刺激B细胞增殖、分化，T细胞增殖等，

腺病毒介导的uPAR反义核酸转移抑制肿瘤细胞的侵袭

为了观察尿激酶受体(uPAR)反义核酸对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用,用PCR方法扩增uPARcDNA 5′端 -4 6bp～ +45 4bp一段长 5 0 0bp的序列,利用DNA重组技术将其克隆到病毒载体pAdeno X中,构建出重组腺病毒载体pAdeno X uPAR( - )和pAdeno X uPAR( +).线性化后的重组腺病毒载体转染HEK2 93细胞 7天后,可以获得滴度分别为 1 5× 10 8pfu/ml和 0 5× 10 8pfu/ml的uPAR反义和正义核酸表达重组腺病毒,分别命名为Ad uPAR( -)和Ad uPAR( +).以不同的病毒感染指数(MOI)感染人肺巨细胞癌高转移株 95D肿瘤细胞,3天后用RNA印迹法可以检测肿瘤细胞uPAR正义和反义核酸表达水平,随着MOI的升高,Ad uPAR( - )感染的肿瘤细胞uPAR蛋白水平逐渐下降,肿瘤细胞的体外侵袭能力也明显下降,而感染Ad uPAR( +)的肿瘤细胞无明显变化.结果表明,重组腺病毒可以表达uPAR正义和反义核酸,uPAR反义核酸可以明显抑制人肺巨细胞癌高转移株 95D肿瘤细胞在体外的侵袭能力.

腺病毒介导RNA干扰抑制人结肠癌VEGF受体表达及肿瘤生长

目的:观察腺病毒介导的RNA干扰抑制人结肠癌中血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)表达及肿瘤生长的作用。方法:将RNA干扰pAd-Easy/VEGFR腺病毒载体用Lipofectamine 2000转染293细胞,制备携带人VEGFR的腺病毒,转染CW2细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察转染效率,通过RT-PCR和蛋白质印迹法检测VEGFR mRNA的表达;以MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线。同时,制备裸鼠CW2细胞移植瘤模型,注射腺病毒后,每天观察肿瘤生长情况。应用免疫组化法检测微血管密度(MVD)。结果:pAd-Easy/VEGFR重组腺病毒成功构建,转染效率为99.7%。RT-PCR、Western印迹实验结果显示转染pAd-Easy/VEGFR后,VEGFR的表达明显被抑制。细胞生长曲线表明,重组载体转染后细胞生长明显减缓。体内实验表明,pAd-Easy/VEGFR治疗后肿瘤生长慢并伴有较低的MVD。结论:pAd-Easy/VEGFR介导的VEGFR shRNA能有效抑制CW2细胞中VEGFR的表达,并能抑制肿瘤生长。

一种由腺病毒介导的两种p53更好地检测肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的体内实验方法

【摘要】p53通过调节细胞周期和诱导细胞程序性死亡中起重要作用的药物反应。p53蛋白的C-末端具有负性调节作用；但是，它是否会影响肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，目前尚不清楚。在这项研究中，

腺病毒介导肿瘤坏死因子样弱凋亡因子转染对大鼠骨髓基质干细胞内皮分化的影响

目的研究转染腺病毒介导的肿瘤坏死因子样弱凋亡因子（tumor necrosis factor like weak inducer of apoptosis，TWEAK）对大鼠骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，MSCs）内皮分化功能的影响。方法用密度梯度离心法培养纯化扩增大鼠MSCs细胞，将实验细胞分为转染Ad5CMV-TWEAK的实验组和未经转染的对照组，转染后用生长因子诱导其分化，用CD34和Ⅷ因子相关抗原染色鉴定其分化能力；细胞计数法观测转染TWEAK后MSCs内皮分化细胞增殖的影响；

过继回输腺病毒介导的白细胞介素10基因转染CTL对机体抗肿瘤免疫功能的增强效应(英文)

本研究探讨了白细胞介素10(IL-10)对小鼠体内抗肿瘤免疫功能的影响。鉴于C26结肠癌细胞转染了IL-10基因后在体内的致瘤性明显下降,本研究构建了一株对C26结肠癌细胞具有杀伤活性的CD8^+CTL并观察了IL-10基因转染的该细胞株对肿瘤的治疗作用。携带IL-10基因的重组腺病毒能有效介导小鼠淋巴细胞的基因转染并使之分泌较高水平的IL-10。IL-10基因转染的CTL过继回输荷瘤小鼠体内能明显增强荷瘤小鼠的体内抗肿瘤免疫功能,使实验性肺转移小鼠肺部转移结节数明显减少,这表明,IL-10对于过继回输的肿瘤特异性CTL的免疫功能具有明显的增强作用。

腺病毒介导的CD/5FC自杀基因疗法对小鼠结肠腺癌的治疗作用及相关免疫机理的研究

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶CD可以将前体药物5FC代谢为毒性产物5FU,具有抗肿瘤作用.本课题我们观察了腺病毒介导的CD/5FC自杀基因疗法对小鼠结肠癌生长的治疗作用并探讨其作用机理.结果表明,首先,CD/5FC自杀基因疗法小鼠结肠癌CT26体内外生长均具有显著的抑制作用,4O%的荷瘤小鼠经过治疗后长期存活;其次,我们还研究了自杀基因疗法治疗肿瘤时可能涉及的免疫机理.结果发现在以CD/5FC系统治疗结肠腺癌小鼠过程中能在一定程度上诱导出机体的抗肿瘤免疫反应,包括脾脏CT6L活性的增高、肿瘤局部浸润免疫细胞表达,DEC-205、B7-2、I-A^(b,d)分子增加等.本实验结果提示虽然CD/5FC系统可以诱导机体产生一定的抗肿瘤免疫反应,但其程度不够显著.

高效腺病毒介导的抗ras核酶致肿瘤细胞逆转

高效腺病毒介导的抗ｒａｓ核酶致肿瘤细胞逆转ＦｅｎｇＭ，ＣａｂｒｅｒａＧ，ＤｅｓｈａｎｅＪ，ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ１９９５；５５：２０２４～２０２８本文采用策略为消除显性癌基因的异常表达以达到根除靶肿瘤细胞。该作者曾证明用锤头状核酶在激活的Ｈ┐ｒ...

高效腺病毒介导的抗ras核酶致肿瘤细胞逆转

高效腺病毒介导的抗ｒａｓ核酶致肿瘤细胞逆转ＦｅｎｅＭ，ＣａｂｒｅｒａＧ，Ｄｅ－ｓｈａｎｅＪ，ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ１９９５；５５：２０２４～２０２８本文采用策略为消除显性癌基因的异常表达以达到根除靶肿瘤细胞。该作者曾证明用锤头状核酸在激活的Ｈ－...

腺病毒介导HSV-TK/GCV系统治疗口腔鳞癌机制的研究

【目的】研究腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (AdCMVHSV TK) /丙氧鸟苷 (GCV)系统治疗口腔鳞癌细胞的作用机制。【方法】HSV TK/GCV系统治疗口腔鳞癌细胞 (Tca 8113细胞株 )后分别应用3 H TdR掺入法、流式细胞仪(FCM )、TUNEL(TdT mediateddUTPNickEndLabeling)法和透射电镜等方法进行检测。【结果】HSV TK/GCV系统治疗后 :3 H TdR掺入法显示掺入率下降 ,GCV为 5× 10 -4 mol/L时掺入率随感染复数 (MOI)的上升而显著下降 (P <0 0 0 1) ;与对照组比较 ,FCM显示S期比率显著升高 (P <0 0 0 1) ,G2 +M期比率下降为 0 (P <0 0 0 1) ,G1/G0 期的改变不明显 (P>0 0 5 ) ;透射电镜及TUNEL法检测均未见凋亡细胞。【结论】口腔鳞癌细胞经HSV TK/GCV系统治疗后DNA的合成受抑制 ,细胞周期阻滞于 S期 ,但无明显诱导细胞凋亡作用。

腺病毒介导的p21基因联合顺铂对胃癌细胞的影响

目的 :探讨腺病毒介导的 p2 1WAF1/CIP1基因 (p2 1基因 )在人胃癌细胞系SGC 790 1中的表达及其联合顺铂化疗对胃癌细胞生长和荷瘤小鼠的作用。方法 :采用腺病毒载体携带p2 1基因感染人胃癌细胞系 ,用流式细胞仪测定 p2 1基因对SGC 790 1细胞周期的影响 ,并与DDP联合应用 ,观察p2 1基因和 (或 )DDP对SGC 790 1细胞系和荷瘤小鼠的作用。结果 :腺病毒介导的 p2 1基因可在胃癌细胞系SGC 790 1中过度表达 ,使胃癌细胞系S期含量下降 ,抑制其生长 ,并可诱导胃癌细胞的凋亡 ;p2 1基因联合DDP作用使SGC 790 1细胞G2 /M含量明显下降 ,并可抑制荷瘤小鼠肿瘤细胞的生长 ,且联合作用比单一用药作用更明显。结论 :腺病毒介导的p2 1基因可抑制人胃癌细胞系的生长 ,抑制瘤体的生长 ,结合化疗药物其作用更强 。

重组腺病毒介导的细胞因子基因疗法的实验研究

IL-4是一种较强的巨噬细胞激活因子。将IL-4基因转染巨噬细胞可使其表达较高水平的IL-4并可使其抗肿瘤活性明显增强。M-CSF在体外能促进单核／巨噬细胞的生长。研究表明，重组IL-4及M-CSF在体外具有协同维持巨噬细胞生长的作用。因此，将IL-4基因及M-CSF基因同时转移至巨噬细胞，将有可能对其抗肿瘤活性产生一定的影响。

腺病毒介导外源性p16基因对人膀胱癌细胞系RT112的作用

目的 通过包装腺病毒介导外源性 p16基因 ,导入内源 p16基因缺失的膀胱癌细胞系 RT112 ,观察对膀胱癌细胞的生长抑制作用 ,并探讨其作用机制 .方法 构建 p16腺病毒表达载体 ,通过 2 93细胞包装 ,产生假病毒 ;应用打点杂交技术及免疫细胞化学检测外源 p16基因的表达 ;流式细胞仪检测细胞周期 ;透射电镜观察细胞凋亡情况 .结果 p16基因克隆入腺病毒载体中 ,并经包装后产生腺病毒 .感染外源性 p16基因的肿瘤细胞生长速率明显下降 ,出现 G1期阻滞 ,并使部分细胞出现凋亡 .结论 外源性 p16基因重表达可抑制膀胱肿瘤细胞的恶性生长 .

重组腺病毒介导的TNF基因转染对巨噬细胞功能影响

肿瘤坏死因子(TNF)是迄今为止所发现的抗肿瘤作用最强的一种生物活性因子。它除了直接的杀伤或抑制肿瘤细胞外还介导单核／巨噬细胞发挥强有力的细胞毒效应。但TNF的半衰期短且毒负作用严重。已有学者研究了逆转录病毒介导的TNF基因转染TIL的抗肿瘤作用。

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因治疗大肠癌的实验研究

目的 观察腺病毒介导下CD/5 -FC对小鼠结肠癌C2 6细胞体外、体内的治疗作用。方法 先构建通过细菌内同源重组法制备CD腺病毒 ,用Ad -CD感染体内、体外小鼠结肠癌C2 6 ,并给予前药 5 -FC ,观察其杀伤肿瘤效果。结果 Ad -CD体外感染小鼠结肠癌C2 6 ,给予前药 5 -FC后 ,可有效杀伤肿瘤细胞 ,并有明显的旁观者效应。AdCD瘤内注射腹腔给前药 5 -FC对BALB/C皮下荷瘤小鼠C2 6大肠肿瘤有较好的治疗作用 ,尤其在早期能使肿瘤生长明显减慢 ,但是未能完全消除肿瘤 ,在后期还观察到肿瘤明显生长。结论 体外腺病毒介导CD/5 -FC可以有效杀伤肿瘤细胞 ,并具有明显的旁观者效应。腺病毒介导CD/5 -FC对皮下荷瘤小鼠早期有一定的治疗作用 ,但是它不能以绝对的优势控制肿瘤的生长 ,更难以长期维持其疗效。说明这一腺病毒介导的自杀基因系统对C2 6皮下肿瘤的抑制作用是有限的。