缺氧诱导胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成体外初步研究

目的通过体外研究初步探讨缺氧可以诱导胶质瘤细胞逆分化形成肿瘤干样细胞。方法1采用CD133+细胞免疫磁珠分选法分离胶质瘤细胞得到CD133-细胞群。2缺氧处理CD133-细胞48 h后行免疫荧光染色鉴定肿瘤干细胞样标记蛋白(SOX2,OCT-4,KLF-4,Nanog,CD133)表达情况,并分别缺氧处理0、3、6、9、12、24 h及0、12、24、48、72 h行qRT-PCR及Western blot检测。流式细胞术检测胶质瘤细胞缺氧培养后CD133+细胞比例变化,检测时间为缺氧培养1、3、5、7 d。3缺氧处理胶质瘤细胞1、3、5、7 d后流式分析细胞周期及凋亡改变。结果 1荧光检测结果表明,肿瘤干细胞样标记蛋白在CD133-胶质瘤细胞缺氧处理48 h后高表达;qRT-PCR及Western blot检测结果表明,缺氧处理胶质瘤细胞可以明显上调肿瘤干细胞样蛋白表达(P<0.05),其中qRT-PCR显示SOX-2,OCT-4及Nanog最高表达在缺氧后9 h,KLF-4及CD133在缺氧后12 h表达最高。Western blot蛋白检测显示OCT-4最高表达在缺氧后12 h,CD133表达最高在缺氧24 h后,KLF-4及Nanog最高表达则在缺氧48 h后,SOX-2在缺氧72 h后表达量最高。另外随着缺氧时间的延长,CD133+细胞数比例逐渐升高(P<0.05)。2细胞周期结果提示缺氧处理肿瘤细胞后,G0/G1期延长,G2/M+S缩短(P<0.05);凋亡结果提示常氧培养组更易凋亡(P<0.05)。结论缺氧可以诱导CD133-胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成。

胃癌肿瘤干样细胞上Trop2基因的表达情况

目的:探讨Trop2基因在无血清悬浮培养法诱导的胃癌肿瘤干样细胞上的表达情况。方法:无血清悬浮培养胃癌细胞系MGC803,观察肿瘤细胞球形成情况;流式细胞仪检测肿瘤细胞球中CD44+、CD54+、Ep CAM及Trop2所占比例;检测肿瘤细胞球的细胞周期变化情况;定量PCR检测肿瘤细胞球中肿瘤干细胞调控基因Oct4、Snail、Nanog及Trop2基因含量。结果 :胃癌细胞系MGC803在无血清悬浮培养的条件下,约14 d能形成肿瘤细胞球且数量较多,肿瘤细胞球中CD44+、CD54+、Ep CAM及Trop2含量明显高于正常培养条件下的MGC803细胞组(P<0.05);肿瘤细胞球中的细胞周期G1期明显低于正常培养组,S期明显高于正常培养组(P<0.05);肿瘤细胞球中肿瘤干细胞调控基因Oct4、Snail、Nanog及Trop2基因的表达明显高于正常培养组(P<0.05)。结论:胃癌细胞系MGC803在无血清悬浮培养条件能形成细胞球,这类细胞具有肿瘤干细胞的特征,出现高增殖状态,高表达肿瘤干细胞调控基因,并能高表达促癌基因Trop2。

小鼠三阴性乳腺癌干样细胞对EMT发生及其生物学行为的影响

目的:探讨TA2小鼠三阴性乳腺癌中乙醛脱氢酶1^+(ALDH1^+)和CD133^+表型的乳腺癌干样细胞在上皮间充质转化(EMT)发生中的作用,及对其生物学行为的影响。方法:使用流式细胞术分析TA2小鼠三阴性乳腺癌组织中ALDH1及CD133的表达量并分选出具有ALDH1^+、ALDH1-、CD133^+、CD133-表型的乳腺癌细胞,将其分别接种于TA2小鼠,根据细胞表型不同设置为ALDH1^+、ALDH1-,CD133^+、CD133-组,观察肿瘤生长情况,并制成组织切片,行三阴性乳腺癌中乳腺癌干细胞表面标记物ALDH1、CD133与EMT相关蛋白Twist1、E-cadherin和VE-cadherin的免疫组织化学检测,分析其表达差异。结果:乳腺癌干细胞标记物ALDH1及CD133在TA2小鼠三阴性乳腺癌中表达率分别为31.2%和6.5%。ALDH1^+、CD133^+组肿瘤生成能力明显强于ALDH1-、CD133-组。免疫组织化学结果显示ALDH1、Twist1、VE-cadherin在ALDH1^+组的表达明显高于ALDH1-组(均P<0.05),E-cadherin在ALDH1^+组的表达低于ALDH1-组(P<0.05)。CD133、Twist1、VE-cadherin在CD133^+组的表达明显高于CD133-组(均P<0.05),Ecadherin在CD133^+组的表达低于CD133-组(P<0.05)。结论:TA2小鼠三阴性乳腺癌中ALDH1^+和CD133^+表型的乳腺癌干样细胞可影响EMT相关蛋白的表达,并促进三阴性乳腺癌的形成。

胃癌干样细胞向内皮细胞分化的研究

目的:研究胃癌肿瘤干样细胞(cancer stem like cells,CSLC)向内皮细胞的分化,以期发现抗肿瘤血管治疗新靶点,并降低抗血管靶向治疗的耐药性。方法:用长春新碱(VCR)筛选胃癌低分化腺癌SGC7901细胞系,加生长因子无血清培养的方法诱导胃癌CSLC,并对其在血管内皮细胞生长因子(VEGF)的刺激下向内皮细胞分化的生物学行为进行观察。结果:成功诱导绿色荧光蛋白(GFP)标记的胃癌CSLC。Western blot、immunofluorescence检测证实:内皮细胞的分子标记物CD31,CD34在经血管内皮细胞生长因子刺激后的CS-LC中呈阳性表达。成管实验结果显示CSLC在内皮环境中培养后较SGC7901细胞和无刺激的CSLC具有明显的成管能力。SGC7901和CSLC分别裸鼠皮下成瘤后,移植瘤免疫组化分析检测证实,肿瘤干样细胞移植瘤的组织切片用人源性血管内皮标志CD31、CD34抗体行免疫组化染色,可明确观察到人源性微血管形成。结论:胃癌CSLC具有向内皮分化的潜能;裸鼠移植瘤中含有人源性内皮细胞,提示胃癌CSLC可能参与胃癌肿瘤血管生成过程。

盆腔浆液性肿瘤患者腹水中侧群(SP)细胞及乙醛脱氢酶阳性(ALDH^+)细胞比例高于原发灶

目的探讨盆腔浆液性肿瘤干样细胞(cancer stemlike cells,CSC)比例与腹腔转移的关系。方法 2011年7月至2013年7月共采集17例未行化疗的女性盆腔浆液性肿瘤患者的肿瘤原发灶及腹水标本,分别采用Hoechst33342拒染法检测侧群(side population,SP)细胞、乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)标记法检测ALDH+细胞,观察两者间SP细胞及ALDH+细胞的表达比例差异,并分析其与盆腹腔转移之间的关系。结果在可检测的标本中,73.3%(11/15)的患者肿瘤原发灶或腹水中SP细胞检测阳性(SP细胞比例>0.15%),100%(10/10)的患者原发灶或腹水中检测到ALDH+细胞。比较患者不同部位SP细胞和ALDH+细胞比例,可见73.3%(11/15)的患者腹水中SP细胞明显高于原发灶(P=0.01),90%(9/10)的患者腹水中的ALDH+细胞比例高于原发灶(P=0.03),且腹水与原发灶中SP细胞及ALDH+细胞均高的患者与仅SP细胞或ALDH+细胞高的患者发生肿瘤盆腹腔转移的比例差异无统计学意义(P>0.05),但其盆腹腔转移部位数明显较后者多(P<0.05)。结论盆腔浆液性肿瘤患者腹水中CSC比例明显高于原发灶,推测CSC与肿瘤盆腔种植转移和进展有关。

人肺腺癌A549干样细胞富集及其自噬表达水平研究

目的肿瘤干细胞一直都是肿瘤研究领域的热点,但其分离鉴定方法尚未成熟,关于肿瘤干细胞生物特性与自噬表达相关性研究较少。因此,本研究通过无血清悬浮培养法富集肺腺癌干样细胞,鉴定其生物特性并初步检测其自噬表达水平。方法将人肺腺癌A549亲本细胞(A549monolayer,A549-MN)作为对照组,A549干样细胞(A549stem-like cells,A549-SC)作为实验组。其中,A549-SC通过将A549-MN置于含有诱导因子重组人表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、重组人碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和B27的无血清悬浮培养基中富集得到。采用流式细胞术检测A549-MN及A549-SC的"CD44+"和"CD133+"标记细胞比例,分化实验检测其分化能力;Transwell迁移和侵袭实验检测其迁移侵袭能力,实时荧光定量PCR及蛋白质印迹实验检测肿瘤干细胞干性基因OCT4、Nanog、Bmi 1和自噬相关因子Beclin1、LC3B的mRNA及蛋白表达水平,透射电子显微镜观察分析A549-MN及A549-SC自噬小体形成情况。结果无血清悬浮培养法可从A549-MN中富集干样细胞且能稳定传代;A549-SC中"CD44+"及"CD133+"标记细胞比例(14.2%,7 111/50 231)高于A549-MN(1.2%,680/54 858)。分化实验表明,A549-SC在含血清的培养基中又可分化成形态学上与A549-MN无差异的贴壁细胞。Transwell实验示,A549-MN与A549-SC的迁移细胞数分别为(96±3)及(121±2)个/视野,t=9.78,P<0.01;侵袭细胞数分别为(22±1)及(52±3)个/视野,t=11.72,P<0.01,差异均有统计学意义。与A549-MN相比,A549-SC的干性基因OCT4 (t=2.41,P<0.05)、Nanog (t=13.84,P<0.01)、Bmi 1(t=14.56,P<0.01)及自噬因子Beclin 1(t=7.44,P<0.01)、LC3B (t=10.59,P<0.01)的mRNA表达水平均升高,干性基因Nanog (t=11.55,P<0.01)、Bmi 1(t=4.37,P<0.01)及自噬因子Beclin1(t=9.69,P<0.01)、LC3B (t=15.7,P<0.01)的蛋白表达水平也升高。同时,电镜观察显示A549-SC的自噬小体较A549-MN增多。结论应用无血清悬浮培养法可富集得到人肺腺癌A549干样细胞,其具有干细胞生物特性且存在高水平自噬表达现象。