人结肠癌HCT116细胞系肿瘤干细胞特性研究

目的探讨结肠癌HCT116细胞系的肿瘤干细胞相关特性,为结肠癌干细胞功能研究奠定基础。方法取HCT116细胞在无血清条件下培养,观察细胞在无血清培养基中的增殖分化情况,采用限量稀释法计数细胞的克隆球形成率,并观察细胞及克隆球的生长、增殖、分化情况。取HCT116细胞(5×103、5×104个)接种4周龄雌性NOD-SCID小鼠,观察3～8周,分析其致瘤性和病理学特征。采用流式细胞仪和免疫荧光染色法分别检测HCT116细胞CD133、CD44、ABCG2的表达,RT-PCR和Western blotting检测CD133的mRNA和蛋白表达。采用免疫组化法检测分化过程中HCT116克隆球上CK20的表达。结果41.47%±1.28%的HCT116细胞能在无血清培养基中形成克隆球,第二代克隆球形成率仍保持在较高水平(32.53%±2.32%)。HCT116细胞在无血清条件下培养72h可形成克隆球,且至少可传15代以上。5×103个HCT116细胞接种至小鼠皮下5～6周后即可形成移植瘤。大部分HCT116细胞为CD133+CD44+,并表达ABCG2蛋白。HCT116细胞的克隆球分化至第4天即可检测到CK20表达。结论大部分HCT116细胞具有肿瘤干细胞特性,可作为肿瘤干细胞研究的理想对象。

肿瘤干细胞鉴定方法研究进展

有学者认为肿瘤是由少数能促发癌变的肿瘤干细胞和占绝大多数的普通肿瘤细胞组成的,从而提出了肿瘤干细胞假说。肿瘤干细胞被认为是恶性肿瘤转移复发的原因。因此,鉴定出肿瘤干细胞并研究其耐药、耐放射机制,将为治愈肿瘤提供新的希望。本文综述了肿瘤干细胞分选方法的最新进展。

肿瘤干细胞在实体肿瘤放射治疗中的意义

在肿瘤形成学说中有随机学说与阶层学说两种。阶层学说认为肿瘤起源细胞即为肿瘤干细胞。在白细胞以及部分实体肿瘤中的一小部分肿瘤细胞具有无限增殖的能力,并可形成新的肿瘤灶,称之为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞是肿瘤转移、复发的根源。肿瘤是干细胞长期自我更新过程中,由于多基因突变导致其生长失去了正常调控而停止在分化的某一阶段无限制增殖所形成,所处的微环境通过某些信号通道以及分泌多种细胞因子来发挥调控作用,而微环境的改变致使干细胞的分化方向发生改变可能是肿瘤发生的基础。目前,利用细胞不同表面抗原标记及侧群细胞分选是肿瘤干细胞分选的两种常用方法。侧群细胞分选更为方便、经济,并可表面标记未知肿瘤干细胞的分选。肿瘤干细胞的鉴定只能用功能学方法,即对其自我更新能力与分化潜能两个主要特征进行评价。肿瘤干细胞放射抗拒的机制可能与损伤DNA的修复,影响细胞周期调控、细胞凋亡、增殖等转导通路改变有关。将肿瘤干细胞作为放射治疗的切入点,针对其放射生物学行为制订对策,才能从根本上解决问题。

子宫内膜癌中肿瘤干细胞的研究进展

子宫内膜癌是妇科常见的三大恶性肿瘤之一,严重影响女性的生活和健康。现行的治疗手段主要包括手术、放射治疗(放疗)和化学治疗(化疗),但对放疗或化疗后复发病例的治疗,仍是极大的挑战。肿瘤干细胞是一类存在于肿瘤组织中具有自我更新能力和多向分化潜能的肿瘤细胞亚群,目前肿瘤干细胞的研究方兴未艾。在子宫内膜癌发病机制的研究中,大量研究证实具有干细胞潜能的稀有的子宫内膜癌肿瘤细胞在疾病发生、发展、转移和复发中起关键作用。就肿瘤干细胞的性质、来源做一总结,并对子宫内膜癌中肿瘤干细胞存在的证据及其标记物的研究进展作一综述。

胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性

背景:5-氟尿嘧啶是一种常用的胃癌化疗药物,但临床治疗过程中较易出现耐药现象,影响治疗效果。研究表明肿瘤干细胞对化疗药敏感性较低,可能是导致化疗耐药的重要原因。目的:体外环境下分析胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性,了解胃癌化疗耐药相关机制。方法:基于克隆形态的分选策略,从人胃癌AGS细胞系内分离胃癌干细胞克隆,采用免疫细胞化学染色分析不同克隆CD44和胸苷酸合成酶的表达,克隆形成实验评估不同类型克隆的自我更新能力,CCK-8法检测不同浓度5-氟尿嘧啶作用下人胃癌AGS细胞克隆生长抑制率。结果与结论:人胃癌AGS细胞经低密度接种培养后,可形成32个不同形态的克隆,其中,副克隆、次克隆、全克隆所占比例分别为19%(6/32)、66%(21/32)、16%(5/32)。全克隆高表达CD44和胸苷酸合成酶,接种后可再次形成大量二代克隆;次克隆弱表达CD44和胸苷酸合成酶,接种后形成少量的二代克隆;副克隆不表达或弱表达CD44和胸苷酸合成酶,接种后未形成二代克隆。在不同浓度5-氟尿嘧啶的作用下,次克隆以及人胃癌AGS细胞的生长抑制率均显著高于全克隆(P均<0.05)。结果表明,在体外条件下,胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶敏感性较低,推测其可能为临床化疗耐药的重要机制。

骨巨细胞瘤干细胞的分离鉴定

目的探索从骨巨细胞瘤(giant cell tumor of bone,GCTB)中分离肿瘤干细胞的方法。方法对临床GCTB患者的手术标本进行原代培养,并对获得的细胞株进行特定条件下的培养获得球体细胞,在此基础上对球体细胞进行自我更新能力和干细胞相关基因检测,并通过免疫缺陷小鼠对该亚群致瘤能力进行评价。结果从GCTB中分离出表达干细胞相关基因的球体细胞群,该球体细胞群高表达干性基因OCT4、NANOG、SOX2,具备更强的侵袭性,动物实验表明球体细胞致瘤能力比原代细胞更强。结论 GCTB中存在肿瘤干细胞,可成功进行分离鉴定,在此基础上对该亚群的生物学特性进行的初步探索,为将来进一步的研究和寻找临床治疗方法提供了理论基础。

肺癌细胞株侧群细胞的分选及干细胞特性的鉴定

目的肺癌细胞株侧群(side poulation,SP)细胞的分选及干细胞特性的鉴定。方法选择肺癌细胞株SK-MES-1和NCI-H460,采用流式细胞仪分选SP和非SP(non-SP,NSP)细胞,分别接种于正常培养液和干细胞培养液中培养并传代,观察细胞表型和分化能力。电子显微镜观察细胞的超微结构。免疫荧光检测干细胞标志物CD44的表达。Cell counting kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖能力。集落形成、transwell侵袭实验和裸鼠成瘤实验明确细胞的恶性程度。结果初次分选SK-MES-1和NCI-H460细胞株SP和NSP百分比以及再纯化百分比之间比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。2种细胞株的SP和NSP细胞在干细胞培养液中均不能形成干细胞球,但增殖速度加快。SP细胞呈集聚生长,NSP细胞呈接触抑制的单层生长。SP细胞培养至第5代时,细胞表型变化不明显;NSP细胞第5代出现混杂表型。电子显微镜下SP细胞核质比较高,NSP细胞核质比低。SK-MES-1和NCIH460细胞株SP细胞可高表达CD44,组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。CCK-8法检测显示,SK-MES-1和NCI-H460细胞株SP细胞第2、5和7天的吸光度均高于NSP细胞,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。SKMES-1和NCI-H460细胞株SP细胞克隆数和克隆形成率高于NSP细胞,侵袭过膜的细胞数增加,裸鼠成瘤数增多(均P<0.05);均无转移灶,瘤体HE和免疫组织化学染色证实为典型肺癌细胞。结论肺癌细胞株SP细胞具有干细胞特性,参与肿瘤的增殖、分化、侵袭和成瘤过程。

胶质瘤干细胞及其标志物研究进展

尽管神经显微外科技术高速发展,肿瘤的切除率不断上升,放疗及化疗的敏感性也大幅度提高,但胶质瘤的预后并没有提高。随着肿瘤干细胞的提出,给胶质瘤的研究带来新方向;对胶质瘤干细胞的研究可能是未来对胶质瘤研究的一个主导方向,而胶质瘤干细胞标志物的研究是该研究的基础。

关于肿瘤坏死因子及γ干扰素体外协同抑制鼻窦癌裸鼠移植瘤的初步研究

用肿瘤细胞集落测定法分析了基因工程肿瘤坏死因子(TNF)和γ干扰素(IFN-γ)对两株人鼻窦癌裸鼠移植瘤的抑制作用。TNF的抑癌效应呈剂量依赖性,肿瘤间的敏感性不同。TNF和IFN-γ具有协同抑癌效应。本实验为晚期头颈癌生物治疗进行了有益探索。

肺腺癌细胞系A549肿瘤始发细胞的测定

目的通过克隆形成及致瘤能力研究肺腺癌细胞系A549肿瘤始发细胞的比例。方法采用有限稀释法,检测细胞单克隆形成的数量及大小;收集来自于1个细胞形成的克隆细胞,种于BALB/C裸鼠皮下,观察其致瘤能力;采用CD133磁珠分选A549细胞,测定CD133+、CD133-细胞的克隆形成能力,测定Hoechst33342染色对非SP细胞的增殖能力和单克隆形成能力的影响。结果45%以上的A549细胞能够形成大于100个细胞的大克隆,其传代后又能形成新的克隆,来源于1个大克隆的细胞种植到BALB/C裸鼠身上,10d左右能形成肉眼可见的肿瘤;CD133+、CD133-细胞克隆形成能力相同;Hoechst33342染色能够明显干预细胞的克隆形成及增殖能力。结论45%以上的A549细胞是肿瘤始发细胞。

胃癌侵袭转移中的胃癌干细胞鉴定价值及其分子机制

目的探究胃癌侵袭转移中的胃癌干细胞鉴定价值及其分子机制.方法采用成球培养法将胃癌干细胞成功分离或者富集,鉴定其生物学特性,分析胃癌干细胞在多药耐药、侵袭转移中的作用,通过基因芯片对可能参与胃癌干细胞生物学行为的重要分子和信号通路进行筛选,发现炭疽热毒素受体2(ANTXR2)在胃癌细胞侵袭转移、成球、成瘤中发挥重要作用,同时分析其分子机制.结果SGC7901、MGC803细胞球细胞在Sox2和Bmi1表达上明显比单层培养细胞高,为15.39±3.23;SGC7901、MGC803细胞球细胞在Oct4表达上明显比单层培养细胞高,为4.19±0.62.SGC7901-SC细胞中干性相关基因Bmi1、Sox2和Oct4表达水平分别为(3.29±0.52)、(3.12±0.49)、(2.58±0.35),高于SGC7901-MN细胞的(1.41±0.39)、(2.04±0.33)、(1.39±0.32),差异均有统计学意义(t=5.392、7.316、6.449,均P<0.05).在原代细胞XN0422-SC和SGC7901-SC细胞中miR-638呈现高表达(0.69±0.11),miR-181b、miR-181a呈现低表达(0.12±0.05)、(0.15±0.07).SGC7901-SC细胞中ANTXR2的miRNA表达水平明显高于SGC7901-MN细胞,差异有统计学意义(t=6.216,P<0.05).SGC7901-SC中ANTXR2阳性细胞增加比例达到85.48%,而在SGC7901中为4.98%.受PLVT713作用,胃癌细胞XN0422和SGC7901的ANTXR2蛋白表达水平下降.结论ANTXR2通过激活Src/ERk信号通路发挥调控作用.

人肺腺癌肿瘤细胞免疫表型CDl33、CD34、CD44的实验研究

目的拟验证CDl33、CD34、CD44作为人肺腺癌肿瘤干细胞表面标记物的合理性。方法采集新鲜肺腺癌组织标本，利用两种体外培养方法扩增出贴壁细胞和悬浮细胞球两种肿瘤细胞，采用免疫荧光检测比较CDl33、CD34和CD44在两种培养细胞中表达的差异。结果悬浮球肿瘤细胞培养较贴壁肿瘤细胞生长速度慢、维持时间长且成功率高（72．5％VS47．5％，P〈0．05）。CDl33、CD34和CD44在悬浮细胞球中表达率和表达量明显高于贴壁肿瘤细胞（68．97％，82．76％，93．10％VS5．26％，15．79％，5．26％，P〈0．01）。结论CDl33、CD34和CD44可能作为分离人肺腺癌肿瘤干细胞的表面蛋白表标记组合。

CIK细胞分泌因子对肝癌干细胞凋亡的影响

目的:探讨细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer,CIK)细胞的分泌因子对人肝癌干细胞(hepatic cancer stem cells,HCSCs)凋亡的影响。方法:采用无血清悬浮细胞培养法富集人肝癌细胞Hep G2获得HCSCs;用FCM法检测HCSCs表面标志物CD90及CD133的表达情况;通过对裸鼠致瘤能力的观察,鉴定HCSCs的致瘤性。以干扰素γ(interferonγ,IFNγ)、CD3单克隆抗体和重组人白细胞介素-2(recombinant human interleukin-2,rh IL-2)诱导肝癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)产生CIK细胞。采用Transwell小室将不同细胞密度的CIK细胞与HCSCs接种在同一培养体系内,分隔培养24与48h后,用FCM法检测HCSCs的凋亡情况。分别采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法和蛋白质印迹法检测凋亡相关基因caspase-3 m RNA与蛋白表达的变化。结果:富集培养获得的HCSCs表面高表达干细胞标志物CD90和CD133。裸鼠致瘤能力观察表明,该HCSCs具较强的致瘤性。凋亡检测结果提示,CIK细胞的分泌因子可诱导HCSCs的凋亡,与对照组相比,凋亡率差异有统计学意义(P<0.01)。对caspase-3 m RNA与蛋白的检测结果显示,CIK细胞的分泌因子可上调HCSCs中促凋亡相关基因m RNA及蛋白的表达。结论:CIK细胞的分泌因子可诱导HCSCs发生凋亡,这可能与上调其促凋亡相关基因caspase-3的表达有关。

有限稀释法分选人骨肉瘤143-B干细胞及鉴定

目的:探索人骨肉瘤143-B干细胞的分选及鉴定方法。方法:采用有限稀释法对143-B细胞进行干细胞的分选,并检测所获取细胞表面干细胞标志物Nanog和OCT4的表达水平;对所获取的细胞进行成骨及成脂诱导分化,以检测其是否具有多向分化的潜能;动物成瘤实验鉴定细胞的成瘤能力,耐药实验检测顺铂对细胞半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)的影响。结果:分选获得的单克隆143-L细胞具有较高的成球能力;143-L细胞表面Nanog和OCT4 m RNA和蛋白的表达水平均明显高于亲代143-B细胞;对其进行成骨及成脂多向诱导分化成功。143-L细胞的成瘤能力及耐药能力(顺铂对143-B及143-L细胞的IC50值分别为0.83和2.51μg/m L)均明显高于143-B细胞。结论:有限稀释法可以用于143-B细胞干细胞的分选。

胆管癌干细胞的分离、培养及鉴定

目的:从人胆管癌细胞系QBC-939中分离具有干细胞特征的肿瘤细胞,为后续胆管癌干细胞的研究提供材料。方法:用无血清培养法及流式细胞分选法从QBC-939细胞中分离得到具有干细胞特征的CD133+Ep CAM^(high)干细胞样细胞,继续在无血清培养基中培养,观察其成球能力,并比较CD133+Ep CAM^(high)干细胞样细胞与QBC-939细胞单克隆形成率、耐药性,增殖能力,干细胞相关核转录因子OCT-4、Bmi-1、E-cadherin蛋白表达情况,以及BALB/c小鼠皮下移植后的成瘤能力。结果:在无血清培养基中,CD133+Ep CAM^(high)干细胞样细胞具有较强的成球能力。与QBC-939细胞比较,CD133+Ep CAM^(high)干细胞样细胞克隆形成率、洛铂耐药性、增殖明显增加;干细胞相关核转录因子OCT-4、Bmi-1表达明显增加,而E-cadherin表达明显降低;皮下移植瘤形成率明显增加。以上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:从人胆管癌QBC-939细胞中分离的干细胞样细胞具有肿瘤干细胞特性,可用于胆管癌干细胞的研究。

胃癌端粒酶活性临床研究

本研究采用TRAP-银染色和PCR-ELISA二种方法检测端粒酶活性.研究中共对68例胃癌组织和68份相应的癌旁组织,25例胃溃疡组织、3份肿瘤细胞克隆株进行了检测,胃癌组织端粒酶阳性率为86.8%(59/68),明显高于癌旁组织7.3%(5/68)和胃溃疡组织4%(1/25)(P<0.01).肿瘤细胞克隆株阳性率为100%(3/3).结果显示,端粒酶活性增高,与胃癌的发生发展相关,可作为胃癌标志物用于临床诊断.

胃癌及癌前病变的克隆性分析及其与Ki-67表达的相关性

目的通过人雄激素受体基因位点克隆性分析技术对胃癌及其癌前病变进行克隆性分析，探讨胃癌发生发展过程中单克隆发生率的变化趋势及与Ki-67表达之间的关系及其意义。方法肠型胃癌根治标本24例，胃镜活检标本150例。采用激光显微切割技术准确获取病变腺上皮细胞，基因组DNA经甲基化敏感的HpaⅡ限制性内切酶消化后，PCR扩增人雄激素受体基因，采用基因扫描技术对PCR产物进行分析。应用免疫组织化学EnVision二步法检测Ki-67在以上病变组织中的表达，并探讨其与克隆性分析结果的相关性。结果单克隆发生率在胃黏膜肠上皮化生（15．63％，5／32）、低级别上皮内瘤变（22．22％，10／45）、高级别上皮内瘤变（69．44％，25／36）及肠型胃癌（100．0％，20／20）中逐渐增加，除胃黏膜肠上皮化生和低级别上皮内瘤变之间的差异没有统计学意义（P=0．47），其他各组之间差异均有统计学意义（P〈0．01）。Ki-67的阳性表达率随着病变的发展而不断升高。低级别上皮内瘤变组织中单克隆病例的Ki-67的阳性表达率显著高于多克隆病例（P〈0．01），且克隆性与Ki-67的阳性表达率之间存在显著相关性（P〈0．01）。结论单克隆的发生率及Ki-67的阳性表达率在胃癌发生发展过程中逐渐增加。且单克隆病变的发生与Ki-67的表达存在一定的相关性，两者的联合可用于胃癌的早期诊断及易感性的预测。