两个改造后的肿瘤抑素抗肿瘤活性肽活性研究

为了研究改造后的肿瘤抑素2个抗肿瘤活性肽的作用机制,明确其不同的抗肿瘤活性,采用基因工程技术原理,人工合成肿瘤抑素中185～203位氨基酸所对应的19肽和T7肽(74～98位氨基酸)基础上改造的21肽碱基序列,将其与融合蛋白表达载体pTYB2重组后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,用几丁质亲和层析柱一步纯化,直接获得19肽和21肽,利用MTT法、细胞生长曲线、TUNEL法、流式细胞仪早期细胞凋亡检测和细胞周期检测,小鼠H22腹水型转移型肝癌实体瘤抑瘤实验并结合组织病理学切片,来研究19肽和21肽单独应用或联合应用对肿瘤细胞和内皮细胞生长和凋亡的影响以及对体内肿瘤的抑制情况.体内外实验表明:获得的19肽抗肿瘤活性以直接作用肿瘤细胞为主,也有抑制新生血管生成的作用.基因重组21肽抗肿瘤作用是通过抑制肿瘤组织新生血管生成实现的.19肽、21肽联合应用对肿瘤细胞、内皮细胞生长抑制和促凋亡作用明显增强,抗肿瘤活性大大提高.联合用药弥补了单独用药不足,产生协同抗肿瘤作用,可能会成为今后肿瘤治疗的一个主要方向.

新型肿瘤抑素对C6神经胶质瘤细胞抑制作用的影响

目的探讨新型肿瘤抑素对C6神经胶质瘤细胞增殖及Caspase-3蛋白表达的影响。方法采用CCK-8检测不同浓度的新的肿瘤抑素对C6神经胶质瘤细胞增殖并用Western印迹检测对Caspase-3蛋白的表达。结果新的肿瘤抑素作用C6胶质瘤24 h空白对照组与卡莫司汀组比较差异有显著性(P<0.05),与其他实验组比较差异均无统计学意义(P>0.05);48 h空白组与卡莫斯汀组、1 500、2 000μg/ml组比较有统计学差异(P<0.05);72 h时空白对照组与卡莫斯汀组、1 500、2 000μg/ml组比较有统计学差异(P<0.05)。空白对照组与卡莫司汀组、1 500、2 000μg/ml组比较Caspase-3蛋白表达有统计学差异(P<0.05)。结论新型肿瘤抑素可能通过调控Caspase-3蛋白表达抑制C6肿瘤细胞增殖。

肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

肿瘤抑素抗肿瘤相关肽-19肽是由肿瘤抑素185～203住氨基酸组成,具有直接抑制黑色素瘤细胞生长作用,但其对肝癌细胞增殖和凋亡是否有影响,对肝癌是否具有治疗作用还需进一步研究。本研究中采用基因工程技术将合成19肽基因与载体pTYB2重组后进行蛋白表达、纯化获得19肽。通过MTT法、生长曲线观察19肽对人肝癌细胞生长抑制作用;TUNEL标记法、流式细胞仪细胞周期检测法、透射电镜观察19肽对肝癌细胞凋亡的影响:小鼠H22腹水型转移型肝癌实体瘤抑瘤实验证明其体内的抑瘤作用。MTT实验和生长曲线实验表明随着19肽浓度的增加肝癌细胞的存活率下降。在相同19肽浓度下,随着作用时间延长存活细胞逐渐减少。电镜观察治疗组细胞出现明显凋亡,流式细胞仪可检测到前G1峰,TUNEL标记法也证实治疗组可见明显的凋亡细胞,体内19肽作用的小鼠H22腹水型转移型肝癌的抑瘤率达48.46%。可见,肿瘤抑素19肽可抑制肝癌细胞生长,促进肝癌细胞凋亡,对肝癌具有一定的治疗作用。

肿瘤抑素相关肽T42肽的纯化及抗肝癌细胞Hepg2活性的测定

目的:利用已成功构建的肿瘤抑素相关活性肽T42肽高效表达基因工程重组菌pTYB2-T42,提取纯化T42肽,检测其抗肿瘤活性,为研究T42肽抗肿瘤作用机制及新型抗肿瘤药物研发提供实验基础。方法:将pTYB2-T42大肠杆菌进行培养,IPTG诱导其产生融合蛋白,经几丁质柱亲和层析得到目的蛋白,葡聚糖凝胶G15去除DTT干扰,TricineSDS-PAGE鉴定T42肽,紫外分光光度法检测其浓度。MTT检测T42肽对细胞的生长增殖抑制作用,AO/EB荧光染色检测细胞凋亡形态学变化。结果:提取的T42肽其相对分子质量在5000左右,与理论值4600一致。MTT实验结果显示:T42肽作用下Hepg2细胞生长增殖受到抑制,且随着T42肽浓度的增加,Hepg2细胞存活率逐渐下降,其半数抑制浓度(IC50)为30mmol.L-1;AO/EB荧光染色结果表明:经过30mmol.L-1T42肽作用24h后的Hepg2细胞表现出细胞皱缩呈圆形或卵圆形,核皱缩变形且胞膜受损等一系列细胞凋亡特征性的形态变化。结论:T42肽具有显著的抗肿瘤细胞活性,可明显抑制人肝癌细胞Hepg2的生长增殖,并促进其凋亡。

肿瘤抑素影响婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖与凋亡的相关机制

目的观察肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖及凋亡的影响,并对相关机制进行初步探讨。方法采用0、5、10、20和40μg/ml的肿瘤抑素及40μg/ml的肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞0、12、24和48 h,采用MTT方法及流式细胞术检测婴幼儿血管瘤内皮细胞的增殖及凋亡情况。采用Western blot方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞中AMPK和m TOR的磷酸化水平。结果同0μg/ml肿瘤抑素处理组相比,5、10、20和40μg/ml的肿瘤抑素均可显著抑制婴幼儿血管瘤内皮细胞的增殖能力,并促进婴幼儿血管瘤内皮细胞的凋亡(P<0.05),且这种作用具有计量依赖性。同0 h处理组相比,40μg/ml的肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞2、24和48 h均可显著抑制婴幼儿血管瘤内皮细胞的增殖能力,并促进婴幼儿血管瘤内皮细胞的凋亡(P<0.05),且这种作用具有时间依赖性。同对照相比,肿瘤抑素可上调婴幼儿血管瘤内皮细胞中AMPK的磷酸化水平,下调m TOR的磷酸化水平。结论肿瘤抑素可通过激活AMPK通路,进而抑制m TOR通路,从而抑制婴幼儿血管瘤内皮细胞的增殖能力,并促进婴幼儿血管瘤内皮细胞的凋亡。

肿瘤抑素T_7肽及其衍生物T_7-NGR载体构建及表达

目的为了提高作用靶向性,将导向肽NGR与肿瘤抑素T_7肽的C端连接,获得T_7肽及其衍生物T_7-NGR的载体。方法通过PCR和合成基因序列方法分别构建了肿瘤抑素T_7肽及T_7-NGR的克隆载体pMD-T_7和pMD-T_7N,经酶切和测序鉴定后,将2种载体分别双酶切,经低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后,切下目的片段与酶切回收的质粒载体pET28a在低熔点琼脂糖中直接进行连接反应。阳性克隆经酶切和测序鉴定,转化感受态E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。结果酶切和测序鉴定结果正确,分别成功构建表达载体pET-T_7和pET-T_7N,经IPTG诱导,完成了表达条件的优化。Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,当IPTG浓度为1mmol/L时,25℃诱导8h,分别获得了T_7肽和T_7-NGR的表达产物。结论已经成功构建T_7肽和T_7-NGR的表达载体,获得了表达产物,为下一步的小肽活性实验奠定了基础。

肿瘤抑素活性肽段及其衍生物研究新进展

肿瘤抑素(tumstatin)是继内皮抑素(endostatin)和血管生成抑素(angiostatin)发现以来,来源于人血管基膜Ⅳ型胶原蛋白的极具潜力的肿瘤抑制因子。它强大的抗肿瘤新生血管生成、诱导肿瘤细胞和内皮细胞凋亡等生物活性,使其成为近年来的研究热点。本文详细介绍了肿瘤抑素活性肽段及其衍生物的研究进展。对Tum-5、T7肽和19肽以及这些活性肽段连接NGR导向肽或人源性IgG3铰链区等肽段后形成的衍生物作了较详细的介绍。肿瘤抑素的活性肽段及其衍生物,以高选择性、高活性、低毒性等优点正成为抗肿瘤药物研究的新希望。

肿瘤抑素诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的实验研究

目的探讨肿瘤抑素对体外培养的人喉癌Hep-2细胞系凋亡的影响。方法用MTT法和台盼蓝染色法观察肿瘤抑素对喉癌Hep-2细胞生长的抑制作用。实验分为对照组和治疗组,光镜、电镜观察细胞形态及超微结构变化,采用DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡的梯形条带,TUNEL标记法检测细胞凋亡情况。结果随着肿瘤抑素浓度的增加喉癌Hep-2细胞的存活率下降。在相同浓度下,随着时间延长存活细胞逐渐减少。电镜观察治疗组细胞出现明显凋亡,琼脂糖电泳结果可见治疗组产生了特征性的DNA梯形条带,TUNEL标记法也证实治疗组可见明显的棕黄色凋亡细胞。结论肿瘤抑素通过诱导凋亡对体外培养的人喉癌Hep-2细胞系产生杀伤作用。

小分子肽-肿瘤抑素19肽纯化及抗肿瘤活性研究

目的:利用已构建好的肿瘤抑素抗肿瘤活性肽-19肽高效表达基因重组菌纯化19肽,并进行抗肿瘤活性检测。方法:经几丁质亲和层析柱纯化出19肽,SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳后用Bradford法测其浓度,进行体内活性检测。结果:19肽可促进H22小鼠肝癌细胞死亡,血管数量减少,抑瘤率达48．46%。结论:得到了具有抗肿瘤活性的肿瘤抑素相关肽—19肽,为肿瘤抑素的作用机制研究和肿瘤的临床治疗奠定了基础。

肿瘤抑素改造T-7R肽体外抗肿瘤活性研究

目的研究肿瘤抑素改造7肽(T-7R肽)对人非小肺癌细胞(A549)和人脐静脉内皮细胞(ECV304)增殖抑制和促凋亡活性,并进行对比研究。方法采用生物合成技术合成了肿瘤抑素改造7肽(T-7R),高效液相和质谱显示纯度高,含量大于97%;选取人非小肺癌细胞(A549)和人脐静脉内皮细胞(ECV304),通过MTT法、生长曲线观察T-7R肽对肿瘤细胞和内皮细胞增殖抑制作用;通过TUNEL法、HE染色和透射电镜观察T-7R肽对肿瘤细胞和内皮细胞形态结构影响。结果给药48 h后T-7R对人非小肺癌细胞(A549)具有明显的抑制作用,但对人脐静脉内皮细胞(ECV304)抑制作用不明显,且具有药物剂量依赖性。对人非小肺癌细胞(A549)抑制增殖作用较强,在给药的第2天细胞浓度开始下降第四天开始无法计数;对ECV-304作用不明显,给药组与空白对照组细胞生长状态一致仅在细胞数量上有所减少。T-7R肽可引起人非小肺癌细胞(A549)细胞数量明显减少,细胞形态改变,出现大量细胞变圆、长触角消失、体积缩小、核质比例降低、细胞核深染、胞质凝集、颜色变深等现象。中早期凋亡较多,晚期凋亡较少,凋亡小体明显,凋亡率为50%。对人脐静脉内皮细胞(ECV304)作用较弱,凋亡细胞较少。结论肿瘤抑素改造T-7R肽可抑制人非小肺癌细胞(A549)增殖,促进其的凋亡,但对非肿瘤细胞-人脐静脉内皮细胞(ECV304)作用不明显,其可能对肿瘤细胞具有一定的特异性。

微小RNA-21和肿瘤抑素在膀胱癌中的表达及其相关性的研究

目的探讨膀胱癌中微小RNA-21和肿瘤抑素表达与临床病理特征之间的关系。方法采用SABC法对98例膀胱癌患者分别进行微小RNA-21和肿瘤抑素的免疫组化染色,其与肿瘤临床分期和细胞分级间的关系及微小RNA-21和肿瘤抑素在瘤细胞中的共表达情况。结果膀胱癌患者中微小RNA-21和肿瘤抑素的阳性表达率分别是69.4%和43.9%。与浅表性和分化较好的膀胱癌相比,侵袭性和分化差的癌细胞中微小RNA-21表达上调明显,而肿瘤抑素表达则显著下调,组间比较(P<0.01),差异有统计学意义。有68例患者存在微小RNA-21和肿瘤抑素共表达,两者之间呈负相关(P<0.05),差异也具有统计学意义。结论微小RNA-21和肿瘤抑素共表达失调可能促进膀胱癌的发生发展,抑制微小RNA-21表达,上调肿瘤抑素水平有希望成为有效治疗膀胱癌的一种新方法 。

肿瘤抑素相关肽抗肿瘤活性研究

[目的]评价肿瘤抑素相关肽19肽和21肽抗肿瘤活性。[方法]已构建好的19肽和21肽重组质粒在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达,经几丁质亲和层析柱纯化出19肽和21肽。用SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳对表达及纯化结果进行初步鉴定,进行19肽、21肽和19肽+21肽的腹水型转移型小鼠H22肝癌实体瘤模型大体抑瘤实验,并做组织病理学切片分析。[结果]经一步亲和层析可获得可溶性19肽和21肽。19肽,21肽,19肽+21肽联合用药组在小鼠抑瘤实验中抑瘤率分别达48.46%,42.86%,53.94%。组织病理学切片结果可见3种给药方式都可促进小鼠肿瘤组织坏死,血管数量减少。

肿瘤抑素影响血管瘤内皮细胞凋亡的相关机制分析

目的研究肿瘤抑素对血管瘤内皮细胞的增殖与凋亡过程的调节作用,为临床婴幼儿血管瘤的治疗提供参考。方法血管瘤内皮细胞培养后随机分为5组:对照组、PD98059组、肿瘤抑制素低剂量、中剂量和高剂量组。除对照组给予生理盐水外,其余各组给予PD98059(10μM)处理2 h,肿瘤抑制素低剂量、中剂量和高剂量组分别给予1μM、10μM、100μM的肿瘤抑制素处理2 h。免疫印迹法或荧光定量法分析各组细胞凋亡相关蛋白Caspase3/9、ERK信号通路关键蛋白ERK1/2和MEK及氧化应激蛋白NOX4的表达,DHE染色法分析各组细胞的氧化应激状态。结果与对照组相比,PD98059组血管瘤内皮细胞内ROS水平明显降低、细胞凋亡蛋白Caspase3/9的表达明显升高;同时ERK信号通路关键蛋白的表达明显增强,而肿瘤抑制素低剂量、中剂量和高剂量组作用与PD98059作用一致,且具有剂量依从性。结论肿瘤抑制素通过激活氧化应激状态、ERK信号及抑制细胞凋亡蛋白通过发挥对血管瘤内皮细胞增殖的抑制作用。

肿瘤抑素抗肿瘤相关肽的克隆及生物活性

为得到肿瘤抑素中具有直接抗肿瘤活性肽并检测其生物学活性,人工合成肿瘤抑素中185～2 0 3位氨基酸(19肽)所对应的核苷酸序列,将其连接到融合蛋白表达载体pTYB2中,酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL 2 1(DE3)中诱导表达.表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇(DTT)的柱内还原,直接获得可溶性19肽.利用MTT法,细胞生长曲线,小鼠H2 2腹水型转移型肝癌实体瘤模型抑瘤实验并结合组织病理学切片,研究19肽的生物学活性.获得的19肽对B16小鼠黑色素瘤细胞、人SMMC 772 1肝癌细胞、人脐静脉内皮细胞的生长均具有抑制作用.小鼠H2 2腹水型肝癌抑瘤率达4 8 4 6 % .病理学切片显示,19肽可促使小鼠肿瘤组织坏死,血管数量减少.19肽具有较强的直接抗肿瘤活性,有可能成为肿瘤治疗的一种新的有前景的药物.

肿瘤抑素的研究进展

近年来 ,人们发现作为肺 -肾出血综合征 (Goodpasture)的抗原tumstatin(肿瘤抑素 )具有新的特性 ,即可有效地抑制人内皮细胞的增生 ,引起内皮细胞凋亡 ,抑制新生血管的生成 ,达到抗肿瘤生长的目的。另外 ,它还具有其他内源性抑制因子所没有的直接作用于肿瘤细胞 ,引起肿瘤细胞凋亡的特性。因此 ,肿瘤抑素对于肿瘤的治疗将具有更大的研究和治疗价值。

肿瘤抑素抑制血管生成作用的研究进展

肿瘤抑素是一种能够有效抑制肿瘤新生血管和肿瘤细胞增殖的生物活性物质,通过双重途径抑制肿瘤生长,具有较强的肿瘤生长抑制作用。肿瘤抑素的生物活性和作用机制逐渐得到揭示,文章对其抗新生血管的活性和作用机制进行综述,并展望其在眼科的应用前景。

人肿瘤抑素相关T21RGD肽的表达与纯化

目的构建引入RGD序列人肿瘤抑素相关21肽（T21RGD）-内含肽-几丁质结合蛋白融合表达载体，实现目的肽的几丁质珠亲和层析一步纯化。方法人工设计合成T21RGD肽基因，经重组定向克隆插入到原核表达载体pTYB2，酶切和测序鉴定正确后转化人大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导其融合表达，对表达蛋白进行几丁质珠亲和层析，DTF诱导柱上裂解以获得T21RGD肽。经Trcine—SDS—PAGE和反相高效液相色谱（RP—HPLC）对纯化产物进行鉴定。结果质粒酶切和测序结果显示，含T21RGD肽基因按正确方向和序列插入质粒，融合蛋白表达量达菌体蛋白总量的50％以上，Trcine—SDS—PAGE显示了T21RGD肽目的条带与预期相符，反相高效液相色谱测定峰纯度达97％。结论成功构建T21RGD肽融合表达载体，实现了融合蛋白在大肠杆菌中高效表达和T21RGD肽几丁质珠亲和层析一步纯化，为进一步研究T21RGD肽抗肿瘤活性和作用机制奠定基础。

肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤作用的研究

目的:研究肿瘤抑素(tumstatin)185～203位氨基酸(19肽)对人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠移植瘤生长抑制和细胞凋亡的影响。方法:建立人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠移植瘤模型,19肽治疗3周后,处死动物剥离肿瘤,称重并计算抑瘤率,利用TUNEL法研究19肽对卵巢癌细胞生长和凋亡的影响。结果:肿瘤抑素19肽未见明显毒副反应,抑瘤率可达36.47%,肿瘤细胞有明显的凋亡,与对照组的差异有统计学意义(P<0.05)。结论:肿瘤抑素19肽可有效地抑制裸鼠卵巢癌细胞SKOV3的生长,具有显著的促细胞凋亡作用。

hTERT启动子驱动的肿瘤抑素靶向肝癌细胞表达及其抗血管形成的作用

目的:观察人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子驱动的肿瘤抑素(tamsta-tin)基因在肝癌细胞HepG2内特异性表达及其体外抗血管形成的作用。方法:构建phTERT-tumstatin、pCMV-tumstatin(阳性对照)、phTERT-EGFP(阴性对照)质粒,脂质体介导转染HepG2肝癌细胞、L-02正常肝细胞,荧光显微镜检测EGFP的表达。Western blotting检测tumstatin在HepG2细胞内的表达,MTS法检测稳定转染后HepG2细胞的增殖以及含或不含tumstatin蛋白的条件培养基对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cell,HUVEC)增殖的影响。通过计数管样分支数检测tumstatin蛋白对HUVEC管道结构形成的影响。结果:成功构建phTERT-tumstatin、pCMV-tumstatin和phTERT-EGFP质粒,质粒转染后tumstatin基因在肝癌细胞HepG2中特异地表达,在正常肝细胞L-02中无表达。phTERT-tumstatin和phTERT-EG-FP转染均不影响HepG2细胞的增殖。含tumstatin蛋白的条件培养基CM-T抑制HUVEC的增殖[抑制率为(56.49±0.33)%];CM-T与不含tumstatin蛋白的条件培养基CM-N、CM-NT相比显著抑制了HUVEC血管结构的形成[(3.33±1.53)%vs(24.44±3.11)%、(23.94±2.92)%,P<0.01)]。结论:phTERT基因启动子可驱动tumstatin靶向表达于肝癌细胞,并抑制HUVEC血管管道结构形成。

肿瘤抑素19肽对乳腺癌移植瘤生长的实验研究

目的:探讨肿瘤抑素19肽对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖能力的影响,并观察其在乳腺癌动物模型中对移植瘤生长的影响。方法:应用甲基四噻唑蓝(MTT)法检测19肽对乳腺癌MDA-MR-231细胞的影响,将乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型分为4组,隔日腹腔给药方法分别给予19肽、环磷酰胺、19肽+环磷酰胺、溶剂治疗,记录各组移植瘤的治疗变化,并进行统计学分析。结果:MTT显示乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长随19肽浓度的增加存活率降低,19肽治疗组和联合用药组毒副作用较环磷酰胺组小,体重差异有统计学意义(P=0.010,P=0.032);治疗组与对照组瘤重差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论:19肽可抑制体外培养的乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长;19肽体内毒副反应较小,其与环磷酰胺联合后,对移植瘤的抑制能力得到增强,并减轻后者的毒副反应。