重组复制型溶瘤单纯疱疹病毒人细胞巨噬细胞集落刺激因子的质量研究

目的研究建立重组复制型溶瘤单纯疱疹病毒人细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF,HSV1/GM-CSF)的质控方法与质量标准。方法采用限制性内切酶酶切与PCR法,对GM-CSF基因、单纯疱疹病毒载体ICP 34.5、ICP6、ICP47等改造结构进行鉴定。采用A260紫外吸收法检测病毒颗粒数;pfu法测定HSV1/GM-CSF感染活性。HSV1/GM-CSF体外感染Vero细胞后,分别测定感染上清中GM-CSF表达量以及表达产物的生物学活性;测定HSV1/GM-CSF对肿瘤细胞MCF7的体外杀伤活性;HSV1/GM-CSF分别以相同MOI感染MCF7与二倍体人胚肺成纤维细胞MRC5后,分别测定细胞裂解上清中子代病毒的感染活性,并以子代病毒的感染活性比值来分析该制品在肿瘤细胞中的增殖复制能力。采用PCR法控制野生型单纯疱疹病毒等外源因子的残留。结果对重组HSV1/GM-CSG基因组的酶切、以及对所携带的GM-CSF基因、ICP 34.5、ICP6、ICP47基因改造区的PCR鉴定结果与理论值相符。病毒载体颗粒数为4.5×1010VP.mL-1,感染活性为4.3×107pfu.mL-1。HSV1/GM-CSF以MOI 0.01感染Vero细胞72 h后,ELISA检测上清中GM-CSF表达量为228 ng.mL-1,表达产物的生物学活为4.3×103U.mL-1。该基因治疗制剂对人乳腺癌肿瘤细胞MCF7体外杀伤的MOIIC50为0.08。以相同MOI感染并经pfu法检测,HSV1/GM-CSF在人乳腺癌肿瘤细胞MCF7与人胚肺成纤维二倍体细胞MRC5的增殖比值为308。未检出野生型单纯疱疹病毒。其他各项指标均符合《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》及2005年版《中国药典》(三部)要求。结论初步建立了HSV1/GM-CSF的质控方法和质量标准,并已用于该制品的质量控制。

重组复制型溶瘤腺病毒p53的质量控制方法

建立重组复制型溶瘤腺病毒p53(SG600-P53)的质控检测方法与质量标准。采用限制性内切酶酶切、PCR法对端粒酶启动子、低压缺氧调控元件融合的巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子、p53基因等重组病毒载体结构进行分析,鉴定结果均与理论值相符。经紫外吸收法(A260)检测,病毒颗粒数为2.0×1011 VP.mL-1;TCID50法测定感染活性为5.0×1010 IU.mL-1。p53蛋白ELISA检测结果表明,重组病毒体外感染人肺癌细胞H1299后,感染组核蛋白和空白对照组A450吸收度之比为5.2。该基因治疗制剂对人肺癌细胞A549体外杀伤的MOIIC50为1.0。以相同MOI感染并经TCID50法检测,重组病毒在人肺癌细胞A549与人表皮成纤维二倍体细胞BJ的增殖比值为398。经阴离子高效液相色谱分析,病毒载体颗粒纯度为99.5%。定量PCR检测表明在1×107 VP的病毒颗粒中,野生型腺病毒基因片段少于1个拷贝。本研究建立的重组复制型溶瘤腺病毒的质量标准与检测方法,可用于该制品的质量控制,同时也为其他溶瘤基因治疗病毒载体质控研究提供参考。