山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针,建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。

肺癌发生发展与肿瘤病毒的关系

肺癌作为全世界癌症相关死亡的主要原因之一,有着多种多样的病理类型,不同病理类型的肺癌与肿瘤病毒的关系也各有差异。病毒在肿瘤的发生发展过程中占有着十分重要的地位,越来越多的肿瘤病毒致癌性及致癌机制被确认,但与肺癌关系密切的肿瘤病毒尚未发现,有关肿瘤病毒在各病理类型肺癌的发病机制中起到的具体作用的研究还较少。本文以肺癌主要亚型:肺腺癌、鳞状细胞癌、肺大细胞癌及小细胞肺癌为例,将常见的肿瘤病毒在肺癌发生发展过程中所起到的作用进行综述。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒MAb的制备及间接ELISA方法的建立

为建立检测山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的间接ELISA方法,本研究以纯化的ENTV-2免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株能够稳定分泌ENTV-2特异性单克隆抗体(MAb)的细胞株,命名为6E4,并采用鼠MAb亚类鉴定试剂盒鉴定6E4 MAb的亚类,结果显示,MAb 6E4的亚类为κ链、IgG1亚型。进一步以6E4为检测抗体,经各反应条件的优化建立了检测鼻液样品中ENTV-2的间接ELISA方法,该方法的临界值为0.323。利用该方法检测羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Movi)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)以及纯化的ENTV-2和ENTV-2患病羊鼻液样品,结果显示,除纯化的ENTV-2及ENTV-2患病羊鼻液样品的检测结果呈阳性外,ORFV、Movi、Mmc的检测结果均为阴性,该方法特异性较强。将纯化的ENTV-2(以蛋白浓度换算)2倍倍比稀释(20μg/mL~0.08μg/mL)后,利用建立的间接ELISA方法检测,结果显示,纯化的ENTV-2稀释至0.3125μg/mL时检测结果仍可判定为阳性,该方法敏感性较高。批内、批间重复性试验结果显示,二者变异系数均小于10%,该方法重复性较好。采用荧光定量RT-PCR方法和本实验建立的间接ELISA方法检测109份临床鼻液样品,比较二者之间的符合率,结果显示,该间接ELISA方法与本研究室前期建立的荧光定量RT-PCR的检测结果符合率达94.5%,表明本研究建立的间接ELISA方法可用于ENTV-2感染的临床快速检测。本研究建立的ENTV-2间接ELISA方法为ENT的净化提供了技术手段。

福建省福清市山羊地方性鼻内肿瘤病毒2型感染流行病学调查

为了解福建省福清市山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)流行及遗传变异情况,通过Taq Man qPCR检测方法,对998份山羊鼻拭子样品进行ENTV-2核酸检测,并对阳性样品SU蛋白编码基因进行遗传进化分析。结果显示:在福清市16个镇街40个山羊养殖场户中,共检测出19个阳性场户、89份阳性样品,场阳性率为47.50%,个体阳性率为8.92%;9份阳性样品的SU蛋白编码基因均与ENTV-2位于同一进化分支,其中2份阳性样品处于相对独立的分支,与ENTV-2流行株同源性约为96%,且各有5处氨基酸突变,其他阳性样品与ENTV-2流行株同源性在99%以上,氨基酸序列一致。结果表明,ENTV-2在福清市流行较为广泛,流行毒株出现了一定的变异,需要持续加强监测,采取综合措施控制该病流行。本研究有助于了解和掌握ENTV-2在山羊群中的感染情况和遗传变异特征,为提高该病防治效果奠定了基础。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV-2)快速检测方法,根据ENTV-2 env基因保守区域设计引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,该方法建立的标准曲线在重组质粒浓度为1.019×10^(9)—1.019×10^(2)copies/μL时,相关系数R^(2)为0.998,Ct值和重组质粒浓度有良好的线性关系;与相关的其他5种羊常见病原无交叉反应,最低检测限度为10.19 copies/μL,组间和组内的变异系数均在1.5%内。利用本研究建立的方法与常规RT-PCR对20份临床样品进行对比检测,两种方法的ENTV-2阳性检出率分别为60%(12/20)和30%(6/20),两种方法的总符合率为70%(14/20)。结果表明,本研究建立的方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为ENTV-2的诊断和流行病学调查提供技术手段。

山羊鼻内肿瘤病毒广东株的全基因测序与遗传进化分析

为了解山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的基因组特征和遗传变异情况,通过RT-PCR及序列分析方法从广东省某羊场送检病羊组织中鉴定出一株ENTV-2,将其命名为GDZJ2022。全基因组测序结果分析显示,GDZJ2022与GenBank中26株ENTV参考毒株核苷酸序列相似性为86.5%~96.9%,其中与四川ENTV-2-CHN3毒株序列同源性最高(96.9%),并处于同一分支。env核苷酸序列分析结果显示,GDZJ2022与四川株ENTV-2-CHN1同源性最高(98.6%);gag核苷酸序列分析结果显示,GDZJ2022与GDQY-2017同源性最高(95.2%)。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒Shaanxi株前病毒全基因组克隆及生物信息学分析

为研究山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV)Shaanxi株前病毒全基因组序列,本研究根据Gen Bank中收录的ENTV前病毒基因组序列设计5对引物,通过PCR方法从肿瘤组织中分段扩增获得了ENTV前病毒全基因组的5个片段,测序并分析。结果显示该病毒基因组全长7 275 bp,包含相互重叠的gag-pro-pol-env编码区及5'端非编码区;ENTV Shaanxi株基因组全序列与NC004994.2、AY197548.2、ENTV-SC株(HM104174.1)核苷酸同源性分别为89%、89%、99%。本研究为ENTV的分子生物学特性研究提供资料,为进一步研究其检测方法与致病机理奠定了基础。

大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)逆转录病毒周期蛋白(OrfA)相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤(WDS)在秋季发生春季萎缩的季节性生长特点与大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)辅助基因的表达有关.其中辅助基因orfA的表达产物OrfA蛋白可能是1个潜在的肿瘤相关因子,OrfA与细胞周期蛋白cyclin A和cyclin D同源,也被称为逆转录病毒周期蛋白(retroviral-cyclin).为了深入研究OrfA的作用和功能,我们构建了诱饵表达载体pGBKT7-orfA,采用酵母双杂交技术,从HeLa cDNA文库中筛选与其相互的蛋白因子.通过2轮高强度压力的筛选、β-半乳糖苷酶活性验证、回转验证以及测序分析,最终获得了1个与OrfA相互作用的转录因子E2F5.OrfA C端78个氨基酸的多肽或者缺失C端78个氨基酸的OrfA突变体均不能在酵母双杂交系统中与E2F5相互作用.这些发现为进一步研究OrfA在肿瘤萎缩中的功能奠定了基础.

山羊地方性鼻内肿瘤病毒的gag基因克隆及分析

安徽省某山羊场内部分羊只发生羊鼻漏,面部一侧肿胀,进行病理剖检观察后,取面部皮下肿瘤组织研磨,提取RNA,用特异性引物通过RT-PCR方法扩增获得目的片段并测序。序列比对分析表明,获得的目的基因和山羊地方性鼻内肿瘤病毒的同源性最高,达99%。结果显示,此羊场的山羊感染了由山羊地方性鼻内肿瘤病毒引起的山羊地方性鼻内肿瘤。

肿瘤病毒致癌机理的分子生态学

自1988年分子生态学的概念被提出以来,我们相继讨论了“关于病毒生态的几个问题”和几种病毒病的分子生态失调问题。病毒为分子生物,其所在的生态环境,主要限于允许性宿主细胞之内。若处于细胞之外的环境条件下。

山羊内源性鼻内肿瘤病毒enENTV-FJ1株全基因组测序及生物信息学分析

为了丰富山羊内源性鼻内肿瘤病毒(enENTV)全基因组序列资源,本研究从1份患羊地方性鼻内肿瘤(ENT)病羊的肾脏中经PCR扩增了1株enENTV全基因组序列,命名为enENTV-FJ1,分别对其全基因组、5’端长末端重复序列(5’LTR)基因、gag基因、env基因及其编码的氨基酸序列进行同源性分析并构建系统进化树,对enENTV的5’LTR进行酶切位点分析,并分析该株病毒的gag、env序列与enENTV、山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)、绵羊鼻内肿瘤病毒1型(ENTV-1)等相关病毒参考株相应序列的差异性。结果显示,enENTV-FJ1基因组结构为LTR-gag-pro-pol-env-LTR,长度为7923 bp;全基因组同源性分析结果显示,enENTV-FJ1株与enENTVCHN1~enENTV-CHN66个参考株的同源性为95.7%~97.3%,同源性最近;与ENTV-2参考株的同源性为87.0%~93.2%;enENTV-FJ1的5’LTR基因序列、gag基因及其编码的氨基酸序列与enENTV参考株相应序列的同源性分别为92.8%~99.1%、92.6%~97.5%、92.2%~97.7%;enENTV-FJ1 env基因及其编码的氨基酸序列与内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)参考株相应序列的同源性分别为93.3%~93.8%、94.3%~94.8%。全基因组进化树结果显示,enENTV-FJ1与enENTV-CHN1~enENTV-CHN6处于同一个进化分支;5’LTR进化树结果显示,enENTV-FJ1株与enENTV-CHN2处于同一进化分支;gag基因进化树结果显示enENTV-FJ1与ENTV-CHN9处于一个小的进化分支,与enENTV-CHN6同处于一个较大的进化分支;env基因进化树结果显示,enENTV-FJ1株与ENTV-2/Spain株处于同一进化分支;所有enENTV的5’LTR区均无ENTV-2参考株所含有的Hpy188Ⅰ、NlaⅣ、MowⅠ这3个酶切位点。gag基因序列分析结果显示,与enJSRV、外源ENTV-2、ENTV-1及绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的gag基因相比,enENTV-FJ1株在697 bp^705 bp有9个核苷酸的插入,该基因编码的氨基酸在aa229~aa232处插入3个脯氨酸。env基因编码的氨基酸结果显示,enENTV-FJ1株与ENTV-2株在aa1~aa7处插入了7个氨基酸(MFVFFRR)。与外源性病毒相比,enENTV-FJ1株在跨膜蛋白(TM)胞质尾区无YXXM基序。上述结果表明,enENTV-FJ1与enENTV属于同种病毒,其5’LTR、gag基因、env基因与来自山羊的ENTV-2病毒株亲缘关系更近;其全基因组序列与外源性ENTV和JSRV的差别主要在5’LTR区、gag基因和env基因。本研究明确了enENTV-FJ1株全基因组序列,为鉴定内外源鼻内肿瘤病毒(ENTV)以及研究ENTV-2的致瘤机制奠定了基础。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒SU蛋白的表达及其多克隆抗体的制备和特性分析

【目的】明确山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)SU蛋白的功能。【方法】采用RT-PCR方法从ENTV-2FJ分离株中扩增获得SU基因片段,将其克隆到pMD-19T载体;测序验证后,再亚克隆到PET-32a(+)上,在RosettagamiB(DE3)感受态细胞进行表达,采用SDS-PAGE、Western-blot和ELISA对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。【结果】结果显示,表达的重组菌融合蛋白大小约64.38 kD,在IPTG终浓度0.4 mmol·L^(−1)、37℃诱导4 h表达效果最好。用纯化的ENTV-2进行SDS-PAGE,SU重组蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体作为一抗,进行Western-blot,结果显示鼠抗SU蛋白多克隆抗体能与ENTV-2抗原进行特异性的反应。【结论】表达的SU蛋白有较好的抗原性,为制备ENTV-2特异性单克隆抗体及建立ENTV-2特异性血清学方法奠定了基础。

DNA肿瘤病毒蛋白与p53蛋白的相互作用

大多数人类肿瘤发生p53基因突变，突变性p53蛋白功能失活、半衰期延长，并在肿瘤细胞中大量累积，一般认为，p53基因突变是肿瘤发生的主要因素之一。但是，近年也发现一些人类肿瘤细胞存在p53蛋白累积而无基因突变。这种现象与DNA肿瘤病毒密切相关，业已证明：SV－40T抗原、腺病毒E1B55－kD、E4orf6蛋白、HBVX蛋白、HPVE6蛋白、HCMVIE84蛋白、EBVBZLF1和EBNA5蛋白均与p53蛋白结合而使其功能失活。这表明：p53基因突变并非是p53蛋白功能失活的唯一原因。p53蛋白与病毒蛋白或细胞蛋白相互作用可能是其功能失活的另一主要原因？本文就近年国外有关病毒蛋白与p53蛋白相互作用的研究加以概述；试图引起人们的注意。

逆转录肿瘤病毒在细胞增殖和凋亡中的双向机制

目的 :研究逆转录肿瘤病毒在L6 15小鼠T细胞白血病增殖和凋亡中的机理。方法 :6 15近交系小鼠 2 0只 ,随机分为病毒感染组和正常对照组。感染组动物皮下接种携带小鼠逆转录病毒的L6 15白血病肿瘤株 ,检测外周血白细胞总数 ,观察肿瘤细胞凋亡形态特征及DNA电泳图谱 ,并检测肿瘤细胞中c myc和ras基因的表达。结果 :感染组在接种肿瘤细胞株后第 8天外周血中的肿瘤细胞急剧增高 [(0 2 199± 0 10 99)× 10 9 L],与正常对照组比较差异有极显著性 (P <0 0 1)。肿瘤细胞中c myc和ras基因的表达率分别为 (76 0 0± 3 2 318) %和 (5 6± 2 0 138) %。在肿瘤细胞中还能观察到典型的细胞凋亡小体 ,凋亡率为 (4 6 0± 0 97) % ,外周血淋巴细胞DNA电泳也显示典型的梯形电泳带。结论 :L6 15小鼠逆转录肿瘤病毒在引发T细胞白血病过程中 ,可导致肿瘤细胞c myc和ras基因异常表达 ,同时还激活宿主对肿瘤细胞的凋亡路径。

大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA与orfC重组腺病毒的制备及应用

【目的】扩增大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC,制备orfA和orfC重组腺病毒,并感染Hela229和SPC-A-1细胞,以检测orfA和orfC对肿瘤细胞的影响。【方法】从pWDSV全长表达载体中扩增WDSV辅助基因orfA和orfC,构建orfA和orfC基因的重组腺病毒载体以及对照空载体,采用脂质体介导法转染HEK293细胞进行包装和扩增,用绿色荧光蛋白法测定重组腺病毒的滴度;将重组腺病毒转染肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1,采用Weastern Blot方法检测基因orfA和orfC的表达情况,并用MTT法检测其对肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1的影响。【结果】PCR扩增获得了891bp的orfA基因和360bp的orfC基因,成功构建了对照空载体pAdEasy-l-CK和含有orfA和orfC基因的腺病毒载体pAdEasy-l-orfA和pAdEasy-l-orfC,转染HEK293细胞并进行包装后获得了重组腺病毒Ad-CK、Ad-orfA和Ad-orfC,用Hela229细胞测得其滴度分别为5.67×109,2.00×109和7.33×108 GFU/mL。重组腺病毒对肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1的生长具有抑制作用。【结论】初步证明了orfA和orfC基因对人类肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1的生长具有抑制作用,为进一步研究WDSV辅助基因对人类肿瘤的影响以及肿瘤萎缩的分子机理奠定了基础。

双融膜嗜肿瘤病毒对肺腺癌细胞的杀伤效果研究

目的:构建双融膜嗜肿瘤病毒,并观察其杀伤肺癌细胞的效果。方法:将长臂猿白血病病毒融膜糖蛋白基因(Fusogenic glycoprotein gene of gibbon ape leukemia virus,GALV.fus)构建入嗜肿瘤Ⅰ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 1,HSV-1)中,使其成为具有双重融细胞膜作用的嗜肿瘤病毒(Doubly fusogenic oncolytic herpes simplex virus,Synco-2D)。与单一的重组嗜肿瘤病毒HSV-1比较,在显微镜下观察两种嗜肿瘤病毒融细胞现象,并观察其体外杀伤肺腺癌细胞A549的效率及体内对肿瘤生长的抑制作用。结果:显微镜下发现,双融膜病毒融细胞作用更明显,大量多核巨细胞形成,细胞结构模糊,细胞溶解。体外实验显示,两种病毒都有明显的杀死肿瘤细胞效果,双融膜嗜肿瘤病毒杀伤肿瘤细胞率较单一的HSV-1明显增强。体内动物实验显示双融膜嗜肿瘤病毒对肿瘤组织的生长有显著的抑制作用。结论:将融膜糖蛋白基因GALV.fus构建入嗜肿瘤Ⅰ型单纯疱疹病毒中,可以显著增强病毒杀伤肺腺癌细胞效力。

抗肿瘤病毒在肿瘤治疗中的研究进展

病毒具有“致癌”和“治癌”双重作用。在抗肿瘤研究过程中,病毒及其相关成分被证明能够通过宿主免疫激活、细胞周期抑制和细胞凋亡诱导等方式发挥肿瘤生长抑制作用,是潜在的抗肿瘤药物。为进一步了解抗肿瘤病毒及其在肿瘤治疗中的作用,本文就抗肿瘤病毒的类型、作用机制,抗肿瘤病毒在肿瘤治疗中的应用和潜在问题等作一综述。