去泛素化酶OTUD3调控PTEN肿瘤相关突变体蛋白稳定性的研究

目的 探索去泛素化酶含OTU结构域蛋白3(OTUD3)在乳腺癌中对抑癌蛋白PTEN肿瘤相关突变体蛋白稳定性的调控。方法 收集50例乳腺癌患者样本,提取癌与癌旁组织的RNA后进行逆转录,对PTEN C2结构域进行PCR扩增后测序分析,鉴定乳腺癌PTEN C2结构域的肿瘤相关突变。结合现有数据库中PTEN基因的突变位点信息,将PTEN突变体的编码序列扩增后插入哺乳动物表达载体pCMV-Myc中,构建含有PTEN C2结构域肿瘤相关突变体基因的质粒载体。将上述含PTEN点突变体或截短体基因的质粒载体分别与含OTUD3基因的质粒载体共转染MCF-7细胞,通过免疫共沉淀实验、半衰期实验、泛素化实验及Western印迹实验分别检测PTEN所有突变体与OTUD3结合能力、OTUD3对部分PTEN突变体蛋白稳定性的维持能力及去泛素化修饰能力。结果 从50例乳腺癌病例中鉴定出PTEN C2结构域有3种突变,即I224M、E307K与F341V,其中F341V是本研究在乳腺癌病例中首次鉴定出的PTEN突变体。△M199、F341V以及1-319丧失了与OTUD3结合的能力,从而失去了OTUD3对其的稳定作用。结论 在乳腺癌中,PTEN的一些突变体丧失了与OTUD3结合的能力,不能对其去泛素化修饰,使得蛋白稳定性降低。

重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体质控方法与质量标准的建立

目的建立重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体的质控方法和质量标准。方法利用乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖抑制试验测定重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体的生物学活性;RP-HPLC和SECHPLC测定其纯度;胰酶酶切,HPLC测定其肽图;荧光定量PCR检测E.coli宿主DNA残留量;ELISA法测定宿主蛋白残留量;Edman降解法进行N-末端序列测定;水平等电聚焦电泳法测定等电点;其余检测项目按《中国药典》三部(2010版)规定进行。同时对通常在原液中进行检定的宿主DNA残留、菌体蛋白残留、N-末端序列测定进行初步的方法验证,考察其在成品中进行检测的可行性。结果经初步验证,在成品中进行宿主DNA残留、菌体蛋白残留、N-末端序列测定具有可行性,用建立的方法对重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体成品进行检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2010版)的要求。结论建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。同时只对成品进行质控的方法和质量标准对同类产品的质量控制具有借鉴意义。