肿瘤睾丸抗原45在卵巢癌组织中的表达水平和血清免疫原性与预后的关系

目的评估肿瘤睾丸抗原45(CT45)在上皮性卵巢癌(EOC)组织中的表达水平和血清免疫原性与预后的关系。方法选取2018年11月至2020年1月在该院妇产科接受手术治疗的121例EOC患者(EOC组)和60例良性卵巢病变患者(对照组)作为研究对象,采集其组织和血清标本。采用实时荧光定量聚合酶链反应和免疫组织化学法检测CT45在EOC组织、正常卵巢组织中的表达水平。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清标本中抗CT45自身抗体水平,采用Western blot试验进一步证实ELISA的检测结果。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清抗CT45自身抗体对EOC的诊断价值。结果EOC组CT45A1 mRNA表达水平[1.80(1.10,3.65)]明显高于对照组[0.99(0.68,1.32)],差异有统计学意义(Z=11.883,P<0.001)。46.28%(56/121)的EOC组织均表现出CT45蛋白高表达(++/+++)。CT45蛋白高表达水平与高国际妇产科联盟分期和化疗反应均有关(P<0.05)。EOC组血清抗CT45自身抗体水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,当抗CT45自身抗体最佳截断值设置为中位数(0.37)时,39.67%(48/121)的EOC患者血清标本中可检测到抗CT45自身抗体,其鉴别EOC组和对照组的曲线下面积为0.705,灵敏度和特异度分别为72.51%和68.95%。在48份ELISA检测阳性血清样本中,有81.25%(39/48)的EOC组织CT45蛋白呈高表达。Western blot试验证实了ELISA的检测结果与EOC血清中CT45的免疫原性。组织CT45蛋白高表达(P=0.006)或血清抗CT45自身抗体阳性(P=0.029)患者3年累计总生存率明显更低。结论CT45在EOC组织中表达水平上调,并且在EOC患者中诱导体液免疫反应,表明CT45是EOC的潜在预后生物标志物和肿瘤免疫治疗的靶点。

肿瘤睾丸抗原CT45-5基因小干扰RNA表达载体的构建及干扰效果鉴定

目的:构建肿瘤睾丸抗原CT45家族中5号成员基因(CT45-5)的小干扰RNA(siRNA),并检测其对HeLa及HeLa/Fhit细胞内源性CT45-5基因及外源脆性组氨酸三联体(Fhit)基因表达的干扰效果。方法:根据CT45-5基因序列,通过生物信息学方法对靶向CT45-5基因的siRNA进行预测,从中筛选出2对合理的CT45-5-siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer 2.1-U6 Hygro中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行测序鉴定;将构建的CT45-5-siRNA重组载体转染人宫颈癌细胞HeLa及HeLa/Fhit细胞,Western印迹检测siRNA对HeLa及HeLa/Fhit细胞内源性CT45-5及外源Fhit基因表达的干扰效果。结果:构建了2个CT45-5-siRNA重组质粒,其中一条对CT45-5基因具有明显的干扰作用,并且Fhit基因表达也被抑制。结论:构建的CT45-5-siRNA为与CT45-5功能相关的基因研究奠定了基础。

肿瘤睾丸抗原CT45-5在DNA损伤应答中的作用

目的:用建立的CT45-5-siRNA研究肿瘤睾丸抗原CT45-5在DNA损伤应答中的作用。方法:通过靶向CT45-5基因小干扰RNA(siRNA)下调CT45-5的表达,用MTT比色法检测经喜树碱和依托泊苷处理后细胞对DNA损伤诱导剂的敏感性,用流式细胞技术检测电离辐射后细胞周期的变化。结果:在DNA损伤诱导剂处理后,在脆性组氨酸三联体(Fhit)高表达细胞中下调CT45-5的表达可以使细胞表现出更强的G2期阻滞及对DNA损伤诱导剂更耐受,而在Fhit缺失表达的细胞中却没有此现象。结论:CT45-5可能是以Fhit依赖的途径参与了DNA损伤应答。

肿瘤-睾丸抗原CT45-5的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的:原核表达、纯化肿瘤-睾丸抗原CT45-5基因,并制备多克隆抗体,以研究其在Fhit特异的信号通路中的作用。方法:设计出特异针对CT45-5的引物,通过RT-PCR扩增出CT45-5的编码基因,测序正确后插入到含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果:原核表达和纯化了CT45-5,并获得了其多克隆抗体,抗体效价达到1∶12800,Western印迹结果显示,该抗血清能够特异识别原核及真核细胞表达的CT45-5蛋白。结论:肿瘤-睾丸抗原CT45-5能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究CT45-5的功能奠定了基础。