肿瘤细胞培养、冻存及复苏过程中的工作体会

在多年的科研工作中，笔者接触到一些人的肿瘤细胞株，如白血病细胞株K562、U937、HL-60、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7、卵巢癌SKOV3、肺鳞癌LTEP-S-1等，现将笔者在肿瘤细胞株的培养、冻存和复苏过程中积累的经验总结如下。

人肿瘤细胞培养上清对树突状细胞表型和功能的影响

目的 :观察肿瘤细胞分泌的可溶性因子对树突状细胞表型和功能的影响 ,以进一步揭示肿瘤的免疫逃逸机制。 方法 :体外分离单核细胞 ,加入白细胞介素 4 (IL - 4 )、粒 -巨噬细胞集落刺激因子 (GM- CSF)和肿瘤细胞培养上清体外培养树突状细胞 ,采用流式细胞术、同种异体混合淋巴细胞反应等方法观察肿瘤细胞上清对树突状细胞表型和功能的影响 ,并用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)法检测了免疫抑制因子 IL - 10、血管内皮生长因子 (VEGF)和转化生长因子β1 (TGF-β1 )的 m RNA在人结肠、人卵巢和人肝脏肿瘤细胞中的表达。 结果 :当培养体系中加入人肿瘤细胞培养上清后 ,树突状细胞表面 MHC 类分子和 CD80等共刺激分子的表达较低 ,树突状细胞刺激 T细胞增殖能力下降 ,且 IL - 10 m RNA、VEGF m RNA和 TGF-β1 m RNA在 3种肿瘤细胞中均有不同程度的表达。 结论 :提示肿瘤细胞培养上清可能抑制树突状细胞的抗原提呈能力 ,肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子可能是导致肿瘤微环境中的树突状细胞功能低下、机体的免疫系统无法有效激活和启动抗肿瘤免疫反应的原因之一。

肿瘤细胞培养中的问题及采取措施

本文通过对各种不同肿瘤细胞培养(包括细胞的复苏、传代、冻存等)过程中,易出现的坏死、污染、不长等问题及采取的措施进行了探讨。总结出一条较为适合肿瘤细胞培养的方法。以提高科研水平。

尿肿瘤细胞培养建立短期培养细胞系的意义

目的:探讨膀胱肿瘤术后自然尿中肿瘤细胞培养的可行性并对预后进行评价。方法:选自1998年1月至2000年10月22例经尿道膀胱肿瘤电切术后和20例非膀胱肿瘤患者,取自然中段尿进行尿细胞培养,建立短期培养细胞系。结果:20例非膀胱肿瘤病例无肿瘤细胞生长,TUR-BT术后22例中有15例有肿瘤细胞生长,与临床分期和病理分级呈相关增长,细胞特性与膀胱恶性生长相符。结论:尿细胞培养取材方便,操作简便,无损伤性,可用于浅表性膀胱肿瘤TUR-BT术后的复发监测和对肿瘤复发的早期诊断。

人体肿瘤细胞在胶原凝胶中的培养

单层细胞培养为研究者提供了多方面研究肿瘤细胞生物特征的机会,然而单细胞层培养常常会引起细胞结构完整性的丧失,结构完整性丧失可明显地改变其功能特征。为了更好地了解肿瘤细胞浸润的复杂机制,已应用了许多体外立体浸润模型,研究肿瘤细胞进入各种生物基质的浸润活动性。如:鸡心脏、人羊膜、软琼脂、胶原凝胶培养系统、胎儿心内膜器官培养等等。

3D肿瘤细胞模型培养及其在抗肿瘤药物研究中的应用进展

根据2017年《中国肿瘤的现状和趋势》报告显示,恶性肿瘤仍然是中国居民死亡的主要原因之一。尽管近年来抗肿瘤药物研究一直是药学各领域研发的重点,但近期的统计数据显示,抗肿瘤药物的临床开发成功率远低于其他类药物。究其原因,肿瘤是一个远比我们想象的还要复杂的疾病,它的发生、生长及转移.

自制简易CO＿2温箱在细胞培养实验中的应用

自制简易ＣＯ＿２温箱在细胞培养实验中的应用皮至明，成积儒广西梧州市肿瘤防治研究所免疫室（５４３００２）目前，许多实验室都应用细胞培养技术以开展各种研究工作，但许多细胞都要求培养环境具有恒定地供应一定量的ＣＯ２（容积为５％），以维持培养液ｐＨ值的恒定［...

小鼠艾灸血清诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究

运用艾灸血清和小鼠胸腺细胞瘤 (EL 4)进行细胞培养 ,观察艾灸血清在体外对肿瘤细胞形态、细胞周期及DNA断点的影响。结果发现艾灸血清能诱导肿瘤细胞凋亡 ,引起肿瘤细胞在形态上发生较典型的凋亡改变 ,影响肿瘤细胞由S期向G2 M期的转变过程 ,提高肿瘤细胞DNA断点标记阳性率。

化疗增敏剂对多药耐药性肿瘤细胞P-糖蛋白表达及^(99)Tc^m-MIBI摄取的影响

目的 观察化疗增敏剂对多药耐药性 (MDR)肿瘤细胞P 糖蛋白 (P gp)表达的影响及相应99Tcm 甲氧基异丁基异腈 (MIBI)摄取动力学的变化。方法 MDR人乳腺癌细胞MCF 7 Adr 3 7℃培养。①实验组和对照组细胞培养基中分别加入化疗增敏剂维拉帕米 (VRP ,10 μmol L)和等量培养液DMEM。99Tcm MIBI与细胞共同培养 2h后收集细胞 ,测定放射性和P gp表达水平 (PL)。②VRP加入细胞培养基中 ,与细胞培养若干时间后 ,99Tcm MIBI加入细胞培养基中 ,一起培养 2h后收集细胞。测定放射性和PL。结果 ①VRP作用 2h后 ,实验组细胞99Tcm MIBI摄取率 (UR)较对照组明显增加 (t=2 3 3 ,P <0 0 5 ) ,但PL差异无显著性 (t=1 82 ,P >0 0 5 )。②肿瘤细胞UR随VRP作用时间延长而增加 ,各时间点UR差异有显著性 (F =5 8 2 ,P <0 0 5 )。VRP作用时间在 80min内 ,肿瘤细胞UR与PL无相关性 (r=0 16,P >0 0 5 ) ;VRP作用时间 >8h ,则两者呈负相关 (r=- 0 73 ,P <0 0 1)。结论化疗增敏剂能影响P gp过度表达所致MDR肿瘤细胞对99Tcm

人CD137L在肿瘤细胞的表达及其对肿瘤细胞分泌IL-8的影响

目的 :检测人CD137L在肿瘤细胞的表达及其功能。方法 :采用RT PCR、FACS方法检测人CD137L在肿瘤细胞的表达 ,用ELISA方法检测CD137L对肿瘤细胞分泌IL 8的影响。结果 :9种不同来源的人肿瘤细胞系均不同程度表达CD137L ,其中 ,BEL 74 0 2、HL 6 0、A2细胞系呈高水平表达 ;HepG2 .2 .15、L 78、HT 2 9细胞系中度表达 ;U937、H6、HLE细胞系低表达。胚胎细胞系ECV 30 4中度表达 ,而新分离的正常外周血单个核细胞不表达。CD137L的表达水平与肿瘤细胞系的来源无关 ,同一组织来源的细胞系 ,有的高表达 ,有的低表达。肿瘤细胞上的CD137L对肿瘤细胞本身IL 8的分泌可产生不同的影响 :可使HepG2 .2 .15分泌IL 8的水平增加 ,但对HLE、A2 ,只能微弱地增强肿瘤细胞释放IL 8。结论 :CD137L在肿瘤细胞上的表达是普遍现象 ,其表达可能与细胞的快速生长有关 ;肿瘤细胞的CD137L可增强某些细胞系分泌IL 8。

不同肿瘤细胞诱导分化时表面N-糖链结构变化的比较研究

目的 为比较不同肿瘤细胞株诱导分化时表面N-糖链结构的变化。方法 采用 Con A和 DSA凝集素亲和柱层析法分析 SMMC 772 1人肝癌细胞受 ATRA和 db-c AMP以及 HL - 6 0人早幼粒白血病细胞受 ATRA和 PMA诱导分化时细胞表面糖蛋白上 N-糖链的结构变化。结果 ATRA和 db- c AMP均使 SMMC 772 1细胞表面高甘露糖型/杂合型和三 /四天线复杂型 N-糖链减少而二天线复杂型N-糖链增多。ATRA和 PMA也均使 HL- 6 0细胞表面三 /四天线 N-糖链减少和二天线 N-糖链增加 ,但却使高甘露糖型/杂合型 N-糖链增加。结论 同一细胞受不同诱导剂分化时 ,其表面 N-糖链的结构有相同的变化 ,也有不同的变化 ;

p38MAPK抑制剂SB203580抑制人绒癌JAR细胞的体外侵袭作用

目的 研究 p38MAPK通路在人绒癌 JAR细胞体外侵袭中的作用。方法 用细胞 EL ISA法测定 JAR细胞中 p38MAPK的活性变化 ;用 Transwell细胞侵入系统检测细胞的侵袭作用。结果 PMA呈浓度依赖性地激活 JAR细胞中 p38MAPK。 PMA能促进人绒癌 JAR细胞的体外侵袭作用 ,而 p38特异性抑制剂 SB2 0 35 80抑制了JAR细胞的侵袭能力。结论 p38MAPK通路在人滋养细胞的侵袭行为以及人绒癌的形成中具有重要作用。p38抑制剂可能会为人绒癌的防治提供新的途径。

Cl^-在鼻咽癌细胞调节性容积回缩中的作用

目的 :研究鼻咽癌细胞的调节性容积回缩 (RVD)及Cl-在其中所起的作用。方法 :活细胞图像分析低分化鼻咽癌细胞 (CNE - 2Z)在细胞外低渗刺激时的细胞容积改变 ,用离子置换法和通道阻断法阐明Cl-在RVD中所起的作用。结果 :细胞外低渗刺激使细胞膨胀并诱发RVD。在 16 0 - 2 30mOsmol/L范围内 ,RVD与细胞膨胀程度正相关。用葡萄糖酸取代灌流液Cl-时RVD增强 ,细胞内Cl-耗竭时RVD消失。氯通道阻断剂阻抑RVD ,但不同的阻断剂对RVD的阻抑率有明显差异。结论 :Cl-是CNE - 2Z细胞RVD的关键离子 ,Cl-通道激活 ,Cl-外流是RVD的主要机制。

紫杉醇对K562细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用

目的 探讨紫杉醇体外抑制 K5 6 2细胞株及诱导凋亡的作用。方法 体外培养 K 5 6 2白血病细胞株 ,以不同浓度紫杉醇处理 12～ 72小时后 ,用 MTT法测定细胞生长抑制作用 ,用细胞形态学观察和 DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡 ,用流式细胞仪 (FCM)检测细胞 DNA含量及细胞周期。结果 K5 6 2细胞经紫杉醇处理后细胞生长受抑 ,对 K5 6 2细胞的半数抑制浓度 IC50 为 0 .84μg/ ml。经药物作用后可见细胞染色质浓聚和凋亡小体形成 ,FCM显示细胞凋亡率明显增加 ,但电泳检测未见 DNA裂解。结论 紫杉醇能抑制 K5 6 2细胞的生长 。

p14^(ARF)基因抑制喉癌细胞生长及其对内源性p53表达的影响

目的 探讨p14ARF对喉癌细胞生长的抑制作用及其对内源性p5 3表达的影响 ,为喉癌致癌的分子机理和基因治疗提供理论基础。方法 采用基因转染技术 ,将全长野生型p14ARF 互补DNA(complementaryDNA ,cDNA)转染到人喉鳞状细胞癌Hep 2细胞中 ,利用流式细胞仪、聚合酶链反应(polymerasechainreaction ,PCR)和Western Blotting等方法研究其对细胞周期、内源性野生型p5 3表达的影响。结果 转染p14ARF基因的Hep 2细胞的生长受到明显抑制 ,其克隆形成能力为转染空载体的5 7%。细胞分析表明 ,转染p14ARFcDNA 48h后 ,处在G0 G1和G2 M期的细胞皆增加了 1倍。同时Western Blotting分析结果表明 ,内源性野生型p5 3表达明显上升。结论 p14ARF 基因能上调Hep 2细胞中内源性野生型p5 3的表达并阻滞细胞于G0 G1和G2 M期 ,从而抑制其生长。

CML相关抗原诱导正常T细胞增殖的TCR Vα基因选用和克隆性研究

目的:了解慢性粒细胞白血病(CML)相关抗原体外诱导T细胞的TCR Vα亚家族限制性表达和克隆性增殖情况。方法:采用混合淋巴细胞和肿瘤细胞培养(MLTC)方法,利用CML细胞、K562细胞和bcr3-abl2多肽体外诱导脐血或正常人的T细胞增殖,用RT-PCR和基因扫描分析MLTC后T细胞的29个TCR Vα亚家族基因的互补决定区(CDR3),了解各Vα亚家族的限制性表达情况和T细胞克隆性增殖特点。结果:经CML抗原刺激后增殖的T细胞仅表达部分Vα谱系基因(1-14个亚家族),两例脐血均出现有Vα3亚家族T细胞克隆性增殖趋势;正常人外周血出现寡克隆增殖的Vα5、Vα14亚家族T细胞。结论:CML相关抗原体外诱导脐血和正常人T细胞出现抗原相关的TCR Vα优势利用和克隆性增殖。

AML-M2a型细胞诱导自体及异体优势增殖TCR Vβ亚家族T细胞的研究

目的 :研究急性髓细胞性白血病 M2 a亚型 (AML M2 a)患者外周血白血病细胞反应性 T细胞受体V区 β链 (TCR Vβ)亚家族 T细胞体内外优势表达情况及其体外细胞毒性分析。方法 :采用混合淋巴细胞 /肿瘤细胞培养法 (ML TC)将 AML M2 a细胞与自体或正常人外周血 T细胞体外混合培养和扩增 ,用反转录多聚酶链反应 (RT PCR)分析 ML TC前后患者和正常人 T细胞 TCR2 4个 Vβ亚家族的表达情况 ,同时用四甲基偶氮唑盐 (MTT)法对其进行细胞毒性分析。结果 :AML M2 a患者和正常人 T细胞在 ML TC培养后均出现了 TCR Vβ亚家族优势表达情况 ,与淋巴因子激活杀伤细胞 (L AK细胞 )相比具较高特异性的细胞毒性 (P<0 .0 1)。结论 :AML M2 a细胞可以诱导自体与异体特异性细胞毒性 T细胞 (CTL ) ,且其主要为一些优势的TCR Vβ亚家族

顺铂诱导人骨肉瘤细胞凋亡及其分子机制的初步研究

目的 研究顺铂 (c DDP)对人骨肉瘤细胞的生物学效应及其作用机制。方法 骨肉瘤细胞经 c DDP处理后 ,用台盼蓝技术法检测 c DDP的 IC50 ,采用流式细胞仪、DAPI荧光染色、TUNEL 及 DNA电泳检测细胞凋亡。结果 c DDP在一定浓度范围内以浓度依赖的方式抑制骨肉瘤细胞生长 ,其 IC50 为 1.0 5 μg/ ml± 0 .2 5 μg/ ml。 0 .5～ 2 .0 μg/ mlc DDP处理骨肉瘤细胞后 ,流式细胞仪检测出凋亡峰 ,流式细胞光度计下可见明显的凋亡细胞形态特征 ,琼脂糖凝胶电泳出现 DNA梯形条带。结论 c DDP在体外可诱导骨肉瘤细胞凋亡 ,这种诱导细胞凋亡的能力是 c DDP疗效的基础 ,在对骨肉瘤的治疗中有着巨大的潜力。

肝细胞生长因子对卵巢癌血管生成因子的影响及信号传导途径

目的研究肝细胞生长因子(HGF)对人卵巢癌SKOV3细胞血管内皮生长因子的影响及其信号传导机制。方法将不同浓度、不同作用时间的HGF和核转录因子(NFkB)抑制剂PDTC刺激培养的SKOV3细胞;应用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测卵巢癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的变化;采用蛋白印迹方法检测卵巢癌细胞VEGF蛋白和核蛋白NFkB的变化。结果HGF促进卵巢癌细胞VEGF mRNA和蛋白的表达,且随时间和浓度增加作用增强,PDTC可以抑制HGF的刺激作用;HGF促进细胞核NFkB蛋白的活化,且随时间延长作用增强,于刺激1 h达高峰,PDTC可以抑制HGF对NFkB的活化作用。结论HGF通过NFkB途径在核酸和蛋白水平调节卵巢癌细胞分泌VEGF。

选择性环氧化酶2抑制剂塞来昔布对人卵巢癌细胞系A2780细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨环氧化酶-2抑制剂塞来昔布(celecoxib)对人卵巢癌细胞系A2780细胞增殖与凋亡的影响。方法采用MTT法观察塞来昔布对A2780细胞的增殖抑制情况;流式细胞仪测定塞来昔布对A2780细胞周期的影响;并用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态。结果塞来昔布对A2780细胞的增殖具有抑制作用,并显示表现出明显的时间和剂量的依赖性;塞来昔布使A2780细胞发生细胞周期的G1期阻滞,细胞凋亡增加,并且在荧光显微镜下可观察到凋亡细胞。结论塞来昔布抑制A2780细胞增殖并促进细胞凋亡,有可能成为卵巢癌化疗的有效药物。