p53凋亡刺激蛋白2与肿瘤细胞的自噬和凋亡

p53凋亡刺激蛋白2(ASPP2)是ASPP家族的一个重要成员,能够通过对细胞促凋亡靶基因转录的调节来促进细胞的凋亡。另外,ASPP2与自噬也具有一定的关系,它能通过提高p53通路介导的自噬来诱发肿瘤细胞凋亡增加,从而达到抑制和杀灭肿瘤的作用。在肝癌细胞中,ASPP2过表达可增强p53诱导的自噬调节蛋白(DRAM)介导的自噬对肝癌细胞的促凋亡作用。DRAM的发现使p53与自噬之间建立了联系,也进一步丰富了ASPP2的功能机制,这也为肿瘤的基因治疗提供了新的思路。

P53凋亡刺激蛋白2分子调控机制的研究进展

P53凋亡刺激蛋白家族(apoptosis stimulating pr-oteins of p53 family, ASPP)是英国科学家Sullivan和卢欣的团队在2001年发现的一类可以调控肿瘤细胞凋亡的家族,其成员包括P53凋亡刺激蛋白1(apop-tosis stimulating protein 1 of p53, ASPP1)、ASPP2和ASPP2家族抑制蛋白([inhibitory member of the ASPPfamily, iASPP)［1-2]。

ASPP2以p53非依赖形式促进自噬引起Hep3B细胞凋亡

p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)能特异性地与p53蛋白结合并增强其促凋亡的功能,进而发挥抗肿瘤作用.本室前期研究发现,ASPP2可以通过p53-DRAM-自噬途径诱导细胞凋亡.在本研究中,利用ASPP2腺病毒感染Hep3B细胞(p53缺陷型肝癌细胞系)并用甲基磺酸(MMS)处理后;Calcein AM/PI和M30染色检测细胞凋亡;GFP-LC3质粒转染细胞后检测自噬;荧光定量PCR和免疫印迹检测自噬基因表达.结果表明,ASPP2在p53缺陷的Hep3B细胞内可诱导发生凋亡;在MMS存在和缺失条件下,Adr-ASPP2均引起自噬体水平升高及自噬基因的表达增加,且MMS协同Adr-ASPP2能使自噬水平增加;进一步用VPS34 siRNA和DRAM siRNA抑制自噬发现,细胞凋亡水平下降,说明由Adr-ASPP2诱发经损伤相关自噬调节蛋白(DRAM)介导的自噬参与了肝癌细胞系凋亡的发生.综上结果表明,ASPP2可以通过非p53依赖的DRAM介导自噬,并促进肝癌细胞凋亡.该研究可为肝癌的基因治疗提供新的思路.

异构体ΔASPP2可拮抗ASPP2对p53(细胞)凋亡功能的增强作用

p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)能够与p53蛋白结合特异性地增强其促细胞凋亡功能,进而发挥肿瘤抑制作用.我们发现的1个比ASPP2少300多个N端氨基酸的异构体ΔASPP2.目前,ΔASPP2对p53起何种作用尚不清楚.在本研究中,我们构建了rAd-ASPP2、rAd-ΔASPP2腺病毒,利用rAd-p53、rAd-ASPP2、rAd-ΔASPP2感染p53缺失的细胞系H1299,在MMS的作用下研究ASPP2和ΔASPP2对p53介导的细胞凋亡的影响.结果发现,p53自身过表达能明显促进肿瘤细胞的凋亡;ASPP2可显著增强p53介导的MMS引起的H1299细胞凋亡的作用;然而,ΔASPP2对p53介导的细胞凋亡没有明显影响但却显著抑制rAd-ASPP2增强的rAd-p53的促细胞凋亡作用.p53-ASPP2复合体可能改变p53蛋白的构象,促进p53和增强子Bax的结合活性.p53转录调控基因的表达研究显示,ΔASPP2的存在可显著抑制ASPP2增强p53介导的bax基因转录活性,提示ΔASPP2可能与ASPP2结合后来抑制p53的凋亡基因转录活性.

TP53BP2/ASPP2通过p53非依赖性方式激活mTOR通路抑制HepG2人肝癌细胞自噬

目的研究肿瘤蛋白p53结合蛋白2/p53凋亡刺激蛋白2(TP53BP2/ASPP2)对HepG2人肝癌细胞自噬的调节作用和机制。方法通过腺病毒、慢病毒感染HepG2细胞上调或下调细胞中ASPP2的表达,HepG2细胞继续在不含胎牛血清的培养基中培养24 h,通过Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、beclin1、P62、自噬相关基因5(ATG5)、ATG7和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白mTOR、磷酸化的mTOR(p-mTOR)、真核转录起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)、磷酸化的4EBP1(p-4EBP1)、核糖体蛋白S6、磷酸化的S6(p-S6)、核糖体S6激酶B1(RPS6KB1/p70S6K)、磷酸化的p70S6K(p-p70S6K)的蛋白表达,荧光显微镜检测细胞表达的绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3(GFP-LC3)融合蛋白。同时,使用慢病毒感染不表达p53的Hep3B细胞,敲低细胞中的ASPP2水平,Western blot法检测Hep3B细胞ASPP2和mTOR通路相关蛋白mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、S6、p-S6、RPS6KB1/p70S6K、p-p70S6K的蛋白表达。结果当ASPP2的表达上调时,mTOR复合物1(mTORC1)通路被激活,并且自噬相关蛋白的表达和自噬体的数量减少。在下调ASPP2表达后,mTORC1通路受到抑制,自噬相关蛋白的表达水平和自噬体的数量增加。在p53表达沉默的Hep3B细胞中,当ASPP2下调后,mTORC1途径仍然受到抑制。结论ASPP2以p53非依赖性方式激活mTOR通路抑制HepG2人肝癌细胞自噬。

ASPP2,iASPP和p53在宫颈癌组织中的表达及意义

目的:探讨p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating proteins of p53 2,ASPP2)、ASPP家族抑制成员(inhibitory member of the ASPP family,iASPP)在宫颈癌发生中的意义及其与p53的关系。方法:采用免疫组织化学法检测ASPP2,iASPP,p53在51例早期宫颈癌、53例子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)Ⅱ-Ⅲ期、48例CIN I期及45例正常宫颈组织中的表达,分析ASPP2,iASPP与p53的相互关系。结果:p53阴性时,ASPP2在宫颈癌组、CIN Ⅱ-Ⅲ组、CIN I组、正常宫颈组中的阳性表达率逐渐升高,且CIN Ⅱ-Ⅲ组、宫颈癌组与正常宫颈组比较差异有统计学意义(P<0.05),余各组两两比较差异无统计学意义(P>0.05);iASPP在宫颈癌组、CIN Ⅱ-Ⅲ组、CIN Ⅰ组、正常宫颈组中的阳性表达率逐渐降低,且宫颈癌组与正常宫颈组比较,差异有统计学意义(P<0.05),余各组两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。p53阳性时,ASPP2和iASPP在各组中的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:ASPP2和iASPP可能通过调节野生型p53诱导细胞凋亡的能力参与早期宫颈癌的发生,ASPP2和iASPP可能成为治疗宫颈癌潜在的分子靶点。

老年大鼠肾脏损伤中ASPP2蛋白调控与内质网应激的作用及相关性分析

目的探讨P53凋亡刺激蛋白(ASPP)家族成员ASPP2蛋白及内质网应激在老年大鼠肾脏损伤中的作用机制。方法以6月龄SD大鼠为成年组,18月龄SD大鼠为老年组,苏木精-伊红染色(HE)观察各组大鼠肾脏结构的改变;qRT-PCR检测内质网应激相关指标C/EPB同源蛋白(CHOP)、活化转录因子6(ATF6)、X盒结合蛋白-1(XBP-1)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的mRNA表达水平;Western blot法检测各组大鼠ASPP2蛋白的表达水平,并对ASPP2的表达水平与内质网应激相关指标CHOP、ATF6、XBP-1、GRP78的表达水平作相关性分析。结果与成年组SD大鼠相比,老年组SD大鼠肾脏结构明显改变,CHOP、ATF6、XBP-1、GRP78的mRNA表达水平及ASPP2蛋白表达水平显著增高,且ASPP2水平与CHOP和XBP-1呈正相关,ASPP2水平与ATF6呈负相关。结论在老年SD大鼠中,ASPP2调控内质网应激可能是引起肾脏损伤的重要机制之一。

ASPP2过表达可增强DRAM介导的自噬对HepG2细胞的促调亡作用

p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)能特异性地与p53蛋白结合并增强其促凋亡功能,进而发挥抗肿瘤作用.最近文献提示,自噬对肿瘤发生、发展及肿瘤细胞对抗肿瘤药物的反应都具有重要作用.在本研究中,甲基磺酸(MMS)处理HepG2细胞24 h后,用calcein AM/PI和M30染色检测细胞凋亡,可引起早期(M30免疫组化阳性)和晚期细胞凋亡(PI染色阳性).给HepG2细胞转染GFP-LC3质粒后,发现MMS处理24 h可引起自噬的发生.ASPP2腺病毒(rAd-ASPP2)感染HepG2细胞引起ASPP2过表达后,再用MMS处理24 h,能引起更明显的早期、晚期细胞凋亡和自噬.荧光定量PCR检测发现,rAd-ASPP2诱导了更高的BCL-2相关X蛋白基因(BAX)和p53蛋白的目的基因p53诱导的自噬调节蛋白(p53-induced modulator of autophagy,DRAM)的表达.但仅用rAd-ASPP2处理HepG2细胞不能引起自噬和凋亡.利用2条DRAM特异性的siRNA下调DRAM的表达,发现rAd-ASPP2引起的自噬被完全抑制,早期和晚期凋亡均部分被抑制,同时BAX的mRNA水平也明显下降.以上结果说明,ASPP2可通过上调BAX和DRAM基因的转录而促进MMS引起的HepG2细胞凋亡;另外,DRAM介导的自噬是ASPP2促进MMS引起的肿瘤细胞凋亡的机制之一.该研究可为肝癌的基因治疗提供新的思路.

多功能蛋白ASPP2在肿瘤发生发展中的作用

恶性肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤参与的复杂过程,临床上肿瘤治疗存在复发率高且易耐药等现象,寻找肿瘤易转移、易复发及耐药的干预靶点对恶性肿瘤的诊断和治疗意义重大。多功能蛋白p53促凋亡刺激蛋白2(ASPP2)是一种单倍体不足肿瘤抑制因子,自被发现以来其在肿瘤中的作用备受关注。ASPP2在多种恶性肿瘤中的表达均明显下调,且其下调水平与肿瘤晚期及不良预后相关,表明其在肿瘤发生发展中扮演重要角色。本文主要综述ASPP2在肿瘤转移、耐药和代谢等方面的研究进展,为以ASPP2为治疗靶点的研究提供理论依据。

奥沙利铂诱导结肠癌HCT116细胞凋亡过程中p53凋亡刺激蛋白2的磷酸化对p53促凋亡功能的影响

目的探讨p53凋亡刺激蛋白2（ASPP2）的磷酸化状态对ASPP2／p53凋亡通路活性的影响。方法结肠癌HCT116细胞分别转染野生型ASPP2表达质粒（Aw）和非磷酸化突变型ASPP2质粒（Am），使细胞过表达野生型和非磷酸化突变型ASPP2蛋白。以奥沙利铂诱导HCT116细胞凋亡。annexinV／PI双染细胞后，以流式细胞术分析HCT116细胞的凋亡水平。Westernblot法检测HCT116细胞中ASPP2蛋白的表达量和磷酸化状态。免疫共沉淀法检测ASPP2蛋白与p53的结合情况。结果奥沙利铂能诱导HCTl16结肠癌细胞凋亡以及ASPP2set92和ser361两个位点发生磷酸化。Aw和Am质粒转染的p53^＋/＋ HCT116细胞的凋亡率分别为（3．8±1．0）％和（3．9±1．2）％，与绿色荧光蛋白（GFP）质粒转染的p53^＋/＋ HCT116细胞的凋亡率[（4．0±0．8）％]差异无统计学意义（P〉0．05）。但经过奥沙利铂处理后，Aw质粒转染的p53^＋/＋HCT116细胞的凋亡率为（46．7±3．9）％，明显高于Am和GFP质粒转染的p53^＋/＋HCT116细胞[分别为（40．1±10．2）％和（37．1±6．9）％，P〈0．05]，而Am和GFP质粒转染组p53^＋/＋HCT116细胞的凋亡率差异无统计学意义（P〉0．05）。磷酸化的ASPP2通过p53依赖途径促进奥沙利铂诱导的HCT116细胞凋亡，而ASPP2的磷酸化状态影响其与p53的结合能力。结论在奥沙利铂诱导的结肠癌HCT116细胞凋亡过程中，ASPP2的磷酸化状态调节p53的促凋亡功能。

p53及其凋亡刺激蛋白对结肠癌细胞自噬和凋亡影响机制探讨

目的探讨p53、p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2of p53,ASPP2)及异构体ΔASPP2在p53缺陷结肠癌细胞系HCT116-/-细胞中对自噬及凋亡的影响。方法实验分为对照组、MMS组、MMS+p53组、MMS+ASPP2+p53组、MMS+ΔASPP2+p53组和MMS+ASPP2+ΔASPP2+p53组。应用ASPP2、ΔASPP2及p53质粒转染HCT116-/-细胞,同时转染绿色荧光GFP-LC3质粒于各组细胞中,经甲基磺酸(MMS)处理后用荧光显微镜观察细胞自噬水平,蛋白质印迹法检测各组细胞自噬及凋亡相关蛋白表达水平,Calcein AM/PI染色检测细胞凋亡水平。结果自噬水平对照组为(0.63±0.14)%,MMS组为(10.48±0.58)%,MMS+p53组为(5.45±0.41)%,MMS+ASPP2+p53组为(3.43±0.35)%,MMS+ΔASPP2+p53组为(14.84±0.64)%,MMS+ASPP2+ΔASPP2+p53组为(12.29±0.58)%,差异有统计学意义,F=1 182.364,P<0.001;与MMS组比较,MMS+p53组和MMS+ASPP2+p53组自噬水平下降,P值均<0.001;与MMS+p53组相比,MMS+ASPP2+p53组自噬水平降低,P<0.001;MMS+ΔASPP2+p53组自噬水平较MMS+p53处理组增加,P<0.001;MMS+ASPP2+ΔASPP2+p53组自噬水平较MMS+ASPP2+p53组增加,P<0.001。凋亡率比较,对照组为(2.09±0.54)%,MMS组为(16.79±0.69)%,MMS+p53组为(33.70±1.16)%,MMS+ASPP2+p53组为(50.61±1.17)%,MMS+ΔASPP2+p53组为(21.32±1.18)%,MMS+ASPP2+ΔASPP2+p53组为(35.22±1.06)%,差异有统计学意义,F=2 571.942,P<0.001;MMS+p53和MMS+ASPP2+p53组凋亡较MMS组增加,P值均<0.001;与MMS+p53组相比,MMS+ASPP2+p53组凋亡增加,P<0.001;MMS+ΔASPP2+p53组凋亡较MMS+p53组减少,P<0.001;MMS+ASPP2+ΔASPP2+p53组凋亡较MMS+ASPP2+p53组也有所降低,P<0.001。结论 ASPP2能够增强p53的自噬抑制作用,并增强p53促细胞凋亡作用,ΔASPP2能够抑制ASPP2与p53的功能,具有促进细胞自噬,抑制细胞凋亡的作用。

胆总管腺癌PUMA和ABCG2的表达及其临床病理意义

目的探讨胆总管腺癌和癌旁组织中PUMA和ABCG2的表达水平及其临床病理意义。方法 40例胆总管腺癌和15例癌旁组织手术切除标本常规制作石蜡包埋切片,免疫组化法检测PUMA和ABCG2的表达。结果胆总管腺癌PUMA和ABCG2表达阳性率及其评分明显高于癌旁组织(PUMA:67.5%vs.13.3%,P=0.001,2.58±1.84vs.0.53±1.13,P=0.000;ABCG2:60.0%vs.13.3%,P=0.002,2.28±1.88vs.0.53±1.13,P=0.001)。PUMA和ABCG2表达阳性的癌旁组织上皮均呈轻至中度不典型增生;腺癌I级和淋巴结未转移病例PUMA和ABCG2表达阳性率及其评分明显低于腺癌II级或III级和淋巴结转移者(P<0.05或P<0.01)。PUMA和ABCG2在胆总管腺癌中表达评分呈高度正相关(r=0.65,P=0.000)。结论 PUMA和ABCG2表达与胆总管腺癌发生、临床生物学行为及预后有密切关系;两者的高表达预示预后不良。