GPC5过表达对人肺腺癌A549肿瘤起始细胞生物学功能的影响

目的:探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5(glypican 5,GPC5)基因对人肺腺癌A549肿瘤起始细胞(cancer-initiating cells,CICs)生物学功能的影响。方法 :采用前期构建的过表达GPC5慢病毒载体稳定转染的细胞株GPC5-A549,无血清培养方法富集A549细胞中的CICs微球,通过定量分析检测微球大小,流式细胞术检测CD133阳性细胞比率,Matrigel和Tanswell小室检测细胞侵袭迁移能力,Western blot检测上皮细胞间质化相关蛋白表达。结果:与对照组相比,过表达GPC5后A549细胞中CICs微球形成数目明显减少,体积变小,CD133阳性率明显下降(P<0.05);细胞侵袭、迁移能力显著降低(P<0.05);E-cadherin的蛋白表达明显上调,Vimentin、N-cadherin的表达显著被抑制(P<0.05)。结论:GPC5过表达能够抑制肺腺癌细胞株A549中CICs的发生、侵袭和迁移,调控上皮细胞间质化相关蛋白表达。

力达霉素对肝肿瘤起始细胞表型的调控作用及机制探讨

目的探讨力达霉素对肝肿瘤起始细胞表型的调控作用及机制。方法运用裸鼠皮下移植瘤模型,对力达霉素治疗肝癌Huh7肿瘤起始细胞效果展开检测,回顾相关作用机制。结果力达霉素可使肿瘤体积缩小,将肿瘤的发生时间推迟。深入研究示,力达霉素在肿瘤起始细胞作用的可能分子机制为:力达霉素在体内或体外,均可使CSK3β/β-catenin通路活性下调。结论力达霉素可在体内、体外对Huch7肝肿瘤起始细胞抑制,并使CSK3β/β-catenin通路活性下调,对肿瘤起始细胞被力达霉素抑制的可能分子机制有所揭示,为临床实验提供参考依据。

胃癌CD133阳性细胞亚群肿瘤起始细胞样特性的检测

目的 探讨人胃癌细胞CD133＋亚群的分选及其特性的鉴定.方法 对50例胃癌原发灶和癌旁胃黏膜组织标本行免疫组织化学染色及Western blot检测CD133蛋白的表达.采用流式细胞仪检测不同分化胃癌细胞系CD133所占百分比,免疫磁珠法分选CD133＋细胞亚群,悬浮培养并观察其生长特性,并检测CD133阳性细胞裸鼠皮下接种致瘤能力.单细胞克隆观察单个CD133＋细胞生长特性,半定量反转录聚合酶链反应法鉴定相关干细胞标记的表达.结果 CD133蛋白多定位于胃癌原发灶黏膜及黏膜下层的肿瘤细胞膜表面,其相对表达量高于癌旁胃黏膜组织（P＜0.05）.不同分化程度的人胃癌细胞系KATO-Ⅲ、SGC-7901、AGS及MKN-45中CD 133＋亚群所占相对百分比为（28±2）％、（17±2）％、（6±2）％及（4±2）％.人胃癌细胞系KATO-Ⅲ分选后阳性组中CD133＋亚群比例分别为（91±3）％；培养1周后,达到（95±2）％,并不断增殖形成细胞球.而且其增殖能力强于阴性细胞[群体倍增时间分别为（21±3）h和（40±8）h,P＜0.05].CD133阳性组和未分选组细胞裸鼠皮下接种时成瘤率分别为100％和80％；而CD133阴性组不成瘤,CD133阳性组移植瘤平均体积及重量均大于未分选组（P＜0.05,P＜0.05）.单克隆形成实验示单个CD133＋细胞可形成新的细胞克隆.半定量RT-PCR检测示其表达干细胞标记物Oct-4、Nanog、Sox-2、Musashi-1及EGFR.结论 体外可成功分离、纯化和扩增人胃癌细胞CD133＋亚群,其具有自我更新、增殖能力及较强的致瘤能力,并表达部分干细胞相关基因.

肿瘤起始细胞及上皮-间质转化在肿瘤转移及耐药中的作用

目的总结肿瘤起始细胞(tumor initiating Cells,TICs)和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及其在肿瘤转移和耐药中的研究现状。方法检索近年来国内外有关TICs和EMT及其与肿瘤转移和耐药关系的文献并做综述。结果 TICs是肿瘤细胞中一小群具有自我更新、高度增殖及多向分化能力的细胞,表达多种表面标志物,如CD133、CD44等,在肿瘤的侵袭、转移和耐药中起着重要的作用。EMT是肿瘤上皮细胞失去极性转变为间质细胞的一种现象,常见于胚胎发育及组织修复,能够促进肿瘤的侵袭、转移以及逃避宿主的免疫反应,EMT可能是TICs所致肿瘤转移和复发的根源。靶向TICs或EMT的治疗可能有效预防肿瘤的复发及改善患者的预后。结论 EMT是TICs致肿瘤转移及耐药的重要机理,对于TICs和EMT的研究可用于探索更有效的针对肿瘤的靶向治疗策略。

非小细胞肺癌中circ-SOX4调控起始细胞干性并通过Wnt通路促进肿瘤进展的机制探讨

目的探讨circ-SOX4表达与非小细胞肺癌(NSCLC)起始细胞(TICs)干性的关系以及其促进NSCLC进展的机制。方法利用数据库获得NSCLC原发肿瘤的环状RNA(circRNA)表达信息并验证。采用分子生物学技术检测circ-SOX4对肺癌TICs干性、增殖及凋亡的影响,并检测不同通路抑制剂对上述作用的影响。结果数据库结果显示:在ALDH1^(+)肿瘤细胞中,hsa_circ_0000497、hsa_circ_0018082、hsa_circ_0024105、hsa_circ_0044360及hsa_circ_0131457表达显著上调。实时荧光定量-聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测结果显示:相较于CD133-肺癌细胞,hsa_circ_0131457(circ-SOX4)在CD133^(+)细胞中的表达显著上调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与阴性对照相比,过表达circ-SOX4使CD133-H-1944/Calu-1细胞中CD133表达显著上调,而敲减circ-SOX则显著下调CD133^(+)细胞中CD133表达,差异均具有统计学意义(P<0.01)。与阴性对照相比,敲减circ-SOX4能显著抑制体外培养48、72、96 h时CD133^(+)H-1944/Calu-1细胞的增殖,减少CD133^(+)H-1944/Calu-1细胞的克隆形成,增加CD133^(+)H-1944/Calu-1细胞的凋亡,下调干性基因OCT4、Nanog、SOX2和SOX4的表达,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与阴性对照相比,过表达circ-SOX4能显著促进体外培养48、72、96 h时CD133-Calu-1细胞的增殖,增加CD133-Calu-1细胞克隆形成,抑制CD133-Calu-1细胞凋亡,差异均具有统计学意义(P<0.05)。Wnt通路抑制剂KYA1797 k可逆转过表达circ-SOX4对上述细胞的影响。相较于单纯过表达circ-SOX4,过表达circ-SOX4联合KYA1797 k能显著抑制体外培养48、72和96 h时CD133-Calu-1细胞的增殖,减少CD133-Calu-1细胞克隆形成,并增加CD133-Calu-1细胞凋亡,差异均具有统计学意义(P<0.05)。而RO4929097(Notch通路抑制剂)、LY294002(PI3K/AKT通路抑制剂)和CHS828(NF-kB通路抑制剂)对上述转染细胞的增殖和凋亡无显著影响,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论circ-SOX4在NSCLC起始细胞中表达显著上调并正向调控TICs干性,circ-SOX4通过Wnt通路促进NSCLC增殖并抑制其凋亡。

肿瘤起始细胞化疗耐药机制研究

肿瘤起始细胞是肿瘤发生的源头,具有自我更新、无限增殖、多向分化、DNA修复活性,以及抗凋亡等干细胞特性,参与肿瘤细胞化疗耐药,是肿瘤耐药性产生乃至复发的根本所在.然而肿瘤起始细胞耐药机制错综复杂,既涉及肿瘤的一般耐药特质,也保留了干细胞的天然耐药属性.具体机制尚存在争议.本文综合国内外相关文献从肿瘤起始细胞内生型和外生型两个方面介绍肿瘤起始细胞的化疗耐药机制.通过揭示耐药机制,可以利用其来预测临床化疗的效果.现就肿瘤起始细胞化疗耐药机制研究进展作一综述.

蛋白激酶CK2促进脑肿瘤起始细胞存活的机制研究

蛋白激酶CK2是一种表达丝氨酸/苏氨酸的激酶,由两个催化亚基(α或α')和两个调节亚基(β)组成的不均一四聚体。在许多不同的癌症中,均发现蛋白激酶CK2的表达和活性升高,包括胶质母细胞瘤(GBM)。本研究使用细胞培养并分离小鼠脑组织,形成神经球,使用流式细胞仪,免疫印迹和细胞实验对脑肿瘤起始细胞(BTIC)的存活机制进行研究。结果显示,与相同GBM异种蛋白内的CD133-细胞相比,CD133+BTIC中蛋白激酶CK2α亚基的表达量增加。利用ATP竞争性蛋白激酶CK2抑制剂CX-4945治疗,导致Sox2和Nestin的表达降低,其中Sox2和Nestin是对维持干细胞很重要的转录因子。本实验的研究结论初步表明,由于蛋白激酶CK2在对BTIC存活重要的多种信号传导途径中起关键作用,蛋白激酶CK2是GBM中有希望的靶标。

肿瘤的起源：局部或全身？

经典的肿瘤起源理论认为肿瘤起源于局部。越来越多的证据显示，肿瘤起源于全身而非局部。我们推测：肿瘤起源于肿瘤起始细胞的随机漫游；在合适的微环境中，肿瘤起始细胞停滞并复制；肿瘤细胞刺激形成肿瘤微环境；转移只是肿瘤起始细胞在多个适宜微环境中的生长。

肝细胞癌(HCC)对索拉非尼耐药相关机制的研究进展

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的恶性肿瘤之一。分子靶向药物索拉非尼是不能手术切除的进展期HCC的一线疗法。但部分HCC对其耐药性的出现影响了总体疗效,耐药可分为原发性(HCC原本就对索拉非尼缺乏敏感性)和获得性(开始敏感,治疗过程中出现耐药)两类,其机制尚不清楚。HCC对索拉菲尼的耐药机制主要表现在肝癌细胞自身和肿瘤微环境两个方面:前者包括细胞自噬、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、铁死亡(ferroptosis)受抑制和肿瘤起始细胞(tumor-initiating cell,TIC)等;后者包括外泌体(exosome)和血管选定等。本文对其相关研究进展进行总结。

胃癌CD133阳性细胞的纯化及其生物学特性研究

目的检测人胃癌KATO-Ⅲ、SGC7901、AGS及MKN-45细胞株中CD133基因及蛋白的表达,研究CD133阳性(CD133+)细胞与CD133阴性(CD133-)细胞的生物学特性的差异。方法采用半定量聚合酶链反应及免疫蛋白印迹法分别检测KATO-Ⅲ、SGC7901、AGS及MKN-45细胞株中CD133基因和蛋白的表达;免疫磁珠细胞技术将KATO-Ⅲ细胞株中CD133+和CD133-细胞分离纯化,对比两者生长形态特点、体外增殖能力及分化能力的差异;采用CCK-8法分析CD133+和CD133-细胞对不同浓度(0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mg/ml)化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的差别。结果 KATO-Ⅲ细胞中CD133基因及蛋白表达量均明显高于SGC7901、AGS及MKN-45细胞(P<0.05)。CD133+细胞在无血清培养基中呈球形克隆悬浮生长,相比CD133-细胞具有更强的体外增殖能力及潜在分化能力。5-FU耐药性实验中,CD133+细胞在0.50mg/ml浓度下的抑制率较CD133-细胞明显降低(P<0.05),但其他浓度时二者比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论人胃癌细胞株KATO-Ⅲ中的CD133+细胞具有一定增殖、分化及耐药潜能,CD133可作为胃肿瘤起始细胞亚群的表面标志之一。

TGF-β1诱导胃癌细胞上皮间质转化及促进干细胞特性获得的研究

目的观察TGF—β1能否诱导胃癌KATO—III细胞上皮间质转化及促进胃癌细胞干细胞特性的获得。方法5ng／mETGF-β1处理胃癌KATO-III细胞72h后，置于倒置显微镜下观察其形态学变化，CCK-8法检测TGF-β1对KATO—III细胞增生的影响，RT—PCR与Westernblotting法检测上皮间质转化相关凶子Snail、E—cadherin、N—cadherin，胚胎干细胞相关因子Sox2、OCT4、Nanog、EGFR及肿瘤起始细胞相关标志物CD44、CD133表达的变化。单克隆形成实验研究TGF-β对KATO-1I细胞克隆形成能力的影响。结果TGF-β1处理KATO-Ⅲ细胞后，细胞形态南上皮细胞形态向间质细胞样形态转变；TGF-β1处理组KA—TO—III细胞Snail、N—cadherinmRNA表达相对灰度值为（0．5219±0．0147）、（0．6640±0．0124），显著高于对照组（0．2049±0．0214，P=0．004；0．2722±0．0098，P=0．001），TGF—Bl处理组Snail、N—eadherin蛋白表达相对灰度值为（0．4769±0．0234）、（0．5014±0．0216），显著高于对照组（0．2534±0．0345，P：0．02；0．2026±0．0268，P=0．009），TGF—β1处理组中E—cadherinmRNA及蛋白表达相对灰度值分别为（0．4701±0．0215）、（0．1349±0．0258），昆著低于对照组（0．6792±0．0157，P=0．01；0．6055±0．0227，P=0．004）：TGF—β1处理后KATO—III细胞增生能力明显降低（P〈0．05）。与对照组相比（0．143±0．013、0．156±0．025、0．325±0．046），胚胎干细胞相关凶子Sox2、OCT4、NanogmRNA表达相对灰度值显著增加（0．594±0．039，P=0．001；0．438±0．033，P=0．001；0．489±0．037，P=0．03），TGF—β1处理组CIN4与CDl33mRNA表达相对灰度值分别为（0．437±0．037）与（0．543±0．028），显著高于对照组（0．247±0．024，P=0．000：0．139±0．016，P=0．000）；TGF—β1处理组CD44与CD133蛋白表达相对灰度值分别为（0．429±0．034）与（0．316±0．027），显著高于对照组（0．152±0．014，P=0．000；0．110±0．010，P=0．000）。TGF—β1处理后，KATO-Ⅲ细胞克隆形成数目及直径均显著高于对照组（P〈0．01）。结论TGF—β1能诱导胃癌KATO—III细胞发生上皮问质转化转变，同时促进其干细胞特性获得。

免疫磁珠法分离胆囊癌CD133阳性细胞及其生物学特性鉴定

目的建立胆囊癌CD133＋细胞分离纯化的方法，观察胆囊癌CD133＋细胞和CD133-细胞生物学特性的差异。方法流式细胞仪检测胆囊癌GBC—SD、SGC996细胞中CD133所占百分比，免疫磁珠法分选CD133＋细胞亚群，免疫荧光法定位检测CD133蛋白表达，逆转录-聚合酶链反应（RT．PCR）检测CD133mRNA表达，细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测CD133＋组和CD133-组细胞增殖能力及对5．氟尿嘧啶（5．Fu）耐药特性的差异，单克隆形成实验观察单个CD133＋细胞生长特性。结果胆囊癌GBC-SD、SGC996细胞中CD133＋亚群所占相对百分比为（68．5±2．9）％、（0．3±0．2）％。GBC—SD组CD133mRNA相对灰度值（0．6466±0．0259）显著高于SGC996组（0．2181±0．0108，P〈0．01）。CD133蛋白定位于细胞膜表面，并在GBC—SD细胞中呈强表达。人胆囊癌GBC—SD细胞分选后，CD133＋组CD133蛋白表达明显强于CD133-组。CD133＋组中CD133＋亚群所占比例为（90．4±0．9）％。CD133＋组CD133mRNA相对灰度值（0．7734±0．0217）显著高于CD133-组（0．2146±0．0174，P〈0．01）。CD133＋组细胞增殖能力明显强于CD133-组（P〈0．01）。经5-Fu（0．1μg／m1）处理后，CD133＋组细胞生存率明显高于CD133-组（P〈0．05）。单克隆形成实验结果示单个CD133＋细胞可形成新的细胞克隆，且CD133＋组[（36．25±2．99）％]细胞克隆球形成率高于CD133-组[（4．50±1．29）％，P〈0．01]。体内成瘤实验结果示CD133＋组与未分选组移植成瘤率分别为100％和60％，而CD133-组不成瘤。结论免疫磁珠分选系统可成功分离高纯度的胆囊癌CD133＋细胞，而且人胆囊癌CD133＋细胞具有-定的增殖、耐药、自我更新及致瘤潜能。

化疗药物对胃癌CD133＋细胞亚群的作用及其对相关凋亡基因表达的影响

目的研究常规化疗药物对纯化的胃癌CD133＋细胞亚群的作用及对相关凋亡基因Bc1-2和BAX的mRNA表达的影响，进而探讨胃癌耐药的作用机制。方法采用免疫磁珠分选术分离纯化KATO-Ⅲ细胞株中CD133-和CD133-细胞亚群。采用CCK-8法分析两种亚群细胞对不同化疗药物5-氟尿嘧啶（5-Fu）、顺铂及依托泊苷（VP-16）敏感性的差别。行半定量聚合酶链反应分析化疗药物诱导后相关凋亡基因表达产物的表达差异。结果KATO—III细胞磁珠分选纯化后，经流式细胞仪分析结果显示：分选后CD133＋组所得细胞CD133＋表达率为90％。5-FU、顺铂及VP-16分别作用12h后，CD133＋组及CD133-组均开始出现凋亡的形态学改变。CCK-8检测发现CD133＋组细胞生长抑制比率较CD133-组有-定程度的下降[5-FU组为：（30．56±1．99）％～（88．60±1．95）％vs（32．81±2．67）％-（35．55±3．23）％，P=0．045；顺铂组为：（45．89±3．64）％～（81．20±1．18）％vs（50．21±3．22）％～（90．46±1．89）％，P=0．043；VP-16组为：（37．21±3．80）％-（78．49±3．22）％vs（35．55±3．23）％～（89．32±3．54）％，P=0．048]。3种化疗药物干预后，两组亚群细胞中均呈现凋亡抑制因子Bc1-2mRNA表达降低，凋亡因子BAXmRNA表达升高。这些变化在CD133＋组中较CD133-组中更为明显。结论胃癌CD133＋细胞亚群对5-FU、顺铂及VP-16具有-定耐药潜能。可能是由于BAX基因上调及Bc1-2基因下调进而诱导胃癌CD133＋细胞亚群凋亡，并由此而获得对肿瘤药物的抵抗性。