葡萄籽多酚逆转胆囊癌细胞株GBC-SD耐药的研究

目的研究葡萄籽多酚(GSP)逆转先天性耐药细胞株GBC-SD耐药的机制,寻找高效低毒的耐药逆转剂。方法选择先天性耐药细胞株GBC-SD为研究对象。MTT比色法测定各化疗药物的半数抑制浓度(IC50);RT-PCR测定MDR 1 mRNA的变化;流式细胞仪检测P-gp,bcl-2蛋白和细胞内阿霉素浓度的变化。结果(1)无毒(3μg/mL)和低毒(6μg/mL)浓度的GSP处理后各化疗药物的IC50值均明显下降(P<0.0 5),能明显逆转GBC-SD的多药耐药性;(2)上述两浓度的GSP能下调GBC-SD细胞MDR 1 mRNA表达(P<0.0 5);(3)上述两浓度的GSP能下调GBC-SD细胞P-gp和bcl-2蛋白表达(P<0.0 5);(4)GSP增加GBC-SD细胞内ADM药物浓度(P<0.0 5)。结论GSP能部分逆转先天性耐药细胞株GBC-SD多药耐药性,其作用机制为下调GBC-SD细胞MDR 1 mRNA,及P-gp和bcl-2蛋白表达。

脐血源性CIK细胞的体外增殖及其对人胆囊癌细胞株GBC-SD杀伤活性的实验研究

目的探讨脐血CIK细胞的体外增殖活性及其对人胆囊癌细胞株GBC-SD的杀伤作用。方法通过在脐血单个核细胞中加入IFN-γ、IL-2和CD3单克隆抗体进行细胞培养,获得多种细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine inducde killer cells)即脐血CIK细胞。用流式细胞仪对细胞作动态表型分析,用MTT法测定其抗肿瘤活性,并与CD3AK作对比分析。结果脐血CIK细胞在培养2周左右获得大量增殖,CD3^-、CD56^+双阳性细胞大量增殖达1000倍以上;CIK细胞及其培养上清抗人胆囊癌细胞株GBC-SD活性明显优于CD3AK细胞,其抑瘤率为85%与62.8%(P<0.05),早期培养过程中加入G-CSF可以显著提高CIK细胞的增殖活性。结论脐血CIK细胞是一种新型、高效的免疫杀伤活性细胞,其对人胆囊癌细胞株GBC-SD具有明显的细胞毒作用,研究脐血CIK细胞对胆囊癌的过继性免疫治疗具有重要的临床意义。

CD133蛋白在胆囊癌细胞株及胆囊癌组织中的表达

目的:检测CD133蛋白在胆囊癌细胞株GBC及胆囊癌组织中的表达。方法:用Hoechst染色检测CD133蛋白在胆囊癌细胞株GBC中的表达及分布;用免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法检测CD133蛋白在20例胆囊癌组织和20例正常胆囊组织中的表达。结果:Hoechst染色检测结果显示,CD133主要表达于GBC细胞株的细胞膜和细胞浆中;免疫组织化学检测结果显示,CD133蛋白在胆囊癌组织中高表达,在正常胆囊组织无表达。结论:胆囊癌细胞株及胆囊癌组织中均存在CD133蛋白的表达。

选择性Cox-2抑制剂Celebrex对人胆囊癌GBC-SD细胞系生长的抑制作用

目的探讨选择性环氧合酶-2(Cox-2)抑制剂Celebrex对体外培养的人胆囊癌GBC-SD细胞系增殖的影响。方法采用MTT比色法检测Celebrex对细胞系生长的影响;TUNEL染色法观察细胞凋亡指数,并用流式细胞仪定量分析;透射电镜和荧光显微镜检测细胞凋亡。结果Celebrex抑制GBC-SD细胞系的生长呈剂量依赖性;4 0,8 0,1 2 0,1 6 0μmol/L浓度的Celebrex对GBC-SD细胞的生长抑制率分别是1 8.7 7%,2 5.3 2%,4 6.5 8%和5 2.1 9%(P<0.0 1)。流式细胞仪定量分析在4 0,8 0,1 2 0,1 6 0μmol/L浓度下的细胞凋亡率分别为(8.5 1±1.4 4)%,(1 2.4 0±0.8 7)%,(2 6.3 7±1.7 2)%和(4 3.2 1±0.3 9)%,与对照组(4.8 7±0.5 5)%比较有显著的统计学差异;各组间两两比较差异亦有显著性(均P<0.0 1)。透射电镜和荧光显微镜下能观察到胞核浓缩、碎裂以及凋亡小体的形成。结论Celebrex可以有效地抑制人胆囊癌GBC-SD细胞系的增殖并诱导其凋亡。

胆囊组织、组织细胞膜及细胞株的FTIR研究

研究了不同病理生理状态的胆囊组织、胆囊组织细胞膜及胆囊癌细胞株的傅里叶变换红外光谱的相关性.结果显示,与正常组织比较,胆囊癌组织中脂质相关谱带(2955,2920,2870,2850和1740 cm-1)与蛋白相关谱带(1550 cm-1)强度降低;胆囊癌细胞株中脂质相关谱带与蛋白相关谱带(1550 cm-1)强度明显增加;胆囊癌组织细胞膜中脂质相关谱带强度明显增加;核酸相关吸收谱带强度变化在胆囊癌组织和胆囊癌细胞株中一致,在细胞膜中消失;I1460/I1400比值在组织、细胞株和细胞膜层面变化一致,与正常组织相比均有所减少.结果表明,与胆囊癌组织相比,胆囊癌细胞株和胆囊癌组织细胞膜的红外光谱发生了显著变化:癌组织的脂类和蛋白质的相对含量降低;癌细胞株的脂质和蛋白相对含量增加;胆囊癌组织细胞膜的脂质和蛋白相对含量升高.从组织、细胞和细胞膜3个层面阐述了癌变的分子光谱变化.I1460/I1400比值的变化在组织、细胞株和细胞膜层面变化一致,对此指标的深入研究有望获得一个良好的临床诊断指标.

核酶切割技术对胆囊癌细胞端粒酶活性抑制作用的研究

目的探讨锤头状核酶切割技术对胆囊癌细胞端粒酶活性的影响及对胆囊癌细胞生长增殖的作用。方法根据拟要切割的胆囊癌端粒酶RNA亚基模板两翼区的序列,体外合成锤头状核酶的基因序列,并构建入pTriEx-4真核表达载体。酶切及测序鉴定正确后,采用脂质转染法导入胆囊癌细胞,观察其对胆囊癌细胞端粒酶活性的影响及对细胞生长、增殖的作用,并设空载体转染组和单纯脂质体转染组作为对照。结果与对照组比较,实验组胆囊癌细胞的端粒酶活性明显减低;核酶基因作用后,G0/G1期细胞比例明显增高,S期细胞比例明显降低;细胞的分裂、增殖受到明显抑制。核酶作用后1 0 d凋亡率为1 7.1 0%,1 3 d后凋亡率为3 1.0 1%。结论核酶切割技术对胆囊癌细胞端粒酶活性有明显的抑制作用,并能抑制胆囊癌细胞的生长,促进细胞凋亡。

VEGF反义寡核苷酸对胆囊癌细胞VEGF，Flt-1及KDR mRNA表达和VEGF蛋白分泌的影响

目的:体外研究Oligofectamine介导的VEGF反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)转染对人胆囊癌GBC-SD细胞VEGF,Flt-1及KDR mRNA表达和VEGF蛋白分泌的影响.方法:运用Oligofectamine介导的VEGF反义寡核苷酸(ASODN)和错义寡核苷酸(Scrambled Oligodeoxynucleotide,SODN)转染人胆囊癌细胞GBC-SD,半定量RT-PCR检测转染后各组细胞不同时间的VEGF,Flt-1及KDR mRNA表达变化,ELISA测定转染后各组细胞培养上清液VEGF蛋白浓度.结果:半定量RT-PCR发现ASODN组及ASODN+Oligofectamine组24,48,72,96 h VEGF(ASODN组VEGF165:0.686±0.033,0.569±0.049,0.489±0.036,0.716±0.017;ASODN组VEGF121:0.462±0.046,0.338±0.034,0.219±0.022,0.471±0.038;ASODN+Oligofectamine组VEGF165:0.601±0.021,0.465±0.042,0.416±0.023,0.662±0.035:ASODN+Oligofectamine组VEGF121:0.408±0.014,0.286±0.019,0.157±0.021,0.418±0.037)、Flt-1(ASODN组:0.694±0.019,0.562±0.045,0.435±0.042,0.724±0.026;ASODN+Oligofectamine组:0.609±0.018,0.442±0.049,0.314±0.015,0.614±0.029)及KDR(ASODN组:0.667±0.063,0.490±0.033,0.301±0.029,0.665±0.068;ASODN+Oligofectamine组:0.523±0.048,0.432±0.027,0.218±0.036,0.524±0.037) mRNA的表达显著低于Control组(P<0.05),且ASODN+Oligofectamine的抑制作用比ASODN强(P>0.05).ELISA测定结果显示ASODN组(281.26±18.62,526.44±34.95,791.13±20.99)及ASODN+Oligofectamine组(250.7±14.57,506.09±19.14,711.79±19.91)24,48,72 h VEGF蛋白的分泌浓度均显著低于Control组(394.23±16.26,711.6±26.21,933.85±28.65)(P<0.05),且ASODN+Oligofectamine的抑制作用比ASODN强(P>0.05).结论:Oligofectamine介导的VEGF ASODN能抑制GBC-SD细胞VEGF,Flt-1及KDR mRNA表达和VEGF蛋白分泌.

胆囊收缩素受体在胰腺癌细胞中的表达及胆囊收缩素对胰腺癌细胞周期的影响

目的:观察胆囊收缩素受体(CCKR)在人胰腺癌细胞株SW1990中的表达及胆囊收缩素(CCK)-8肽对胰腺癌细胞周期的影响. 方法:应用RT-PCR方法检测人胰腺癌细胞株SW1990中胆囊收缩素受体(CCKR)mRNA的表达,细胞化学法检测SW1990 细胞中胆囊收缩素受体(CCKR)蛋白水平的表达,流式细胞仪检测不同浓度的CCK-8肽对SW199细胞周期的影响. 结果:在人胰腺癌细胞株SW1990中不表达CCK-A亚型受体,但表达CCK-B亚型受体;CCKR在癌细胞株SW1990 中的表达主要位于细胞膜上,细胞浆内也可见.在10-8g/L- 10-5g/L浓度范围内,CCK-8肽促进SW1990细胞的增殖, 呈剂量依赖性,细胞周期分析发现S期细胞增加,G2/M 期细胞减少. 结论:CCKB受体在人胰腺癌细胞株SW1990中表达, CCK-8肽能促进SW1990细胞的增殖,抑制细胞的凋亡, CCK通过CCKR在胰腺癌细胞的增殖中发挥重要作用.

VEGF反义寡核苷酸抑制胆囊癌生长增殖和凋亡的体外实验研究

目的:探讨VEGF反义寡核苷酸转染对人胆囊癌GBC-SD细胞生长、增殖和凋亡的影响。方法:运用Oligofectamine介导VEGF反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)和错义寡核苷酸(Scrambled Oligodeoxynucleotide,SODN)转染人胆囊癌(GBC-SD)细胞。采用MTT法测定转染后各组细胞的生长曲线及抑制率,流式细胞术检测转染后不同时间各组细胞凋亡情况。结果:SODN组、SODN十Oligofectamine组对GBC-SD细胞生长无显著影响(P>0.05),ASODN组及ASODN十Oligofectamine组则能显著抑制GBC-SD细胞生长(P<0.05),且ASODN十Oligofectamine组对GBC-SD细胞生长增殖抑制作用较ASODN组更为强(P<0.05)。流式细胞术检测结果发现ASODN十Oligofectamine组能促进GBC-SD细胞凋亡(P<0.05)。结论:VEGFASODN转染能抑制胆囊癌GBC-SD细胞生长和增殖,Oligofectamine介导能明显增强VEGF ASODN的抑制作用;Oligofectamine介导VEGF反义寡核苷酸转染能促进胆囊癌GBC-SD细胞的凋亡。

单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷自杀基因系统对胆囊癌细胞的体外作用

目的 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)自杀基因系统对体外胆囊癌细胞的杀伤效果。方法 将含有tk自杀基因的重组逆转录病毒载体PLtkSN经脂质体介导转染胆囊癌细胞,并测定不同浓度的GCV对转基因细胞GBC-SD/tk的生长抑制率;将GBC-SD/tk与未转基因细胞GBC-SD按不同的比例混合,噻唑蓝(MTT)法测定GCV对不同混合比例细胞的杀伤率,观察旁观者效应。结果 GCV对体外GBC-SD/tk细胞有明显的杀伤作用。与对照组比较差异有非常显著性(P<0.01),并呈现剂量依赖性的特点。当GCV浓度为1、10、50、100、500mg/L时,杀伤率依次为6.8％、25.2％、54.5％、66.3％、89.3％;在混合细胞中,当GBC-SD/tk细胞所占比例分别是0、10％、20％、50％、70％、100％时,GCV对混合细胞的杀伤率依次为0、19.7％、40.3％、77.7％、88.0％、93.5％,提示存在旁观者效应。结论 HSV-tk/GCV自杀基因系统有望成为治疗胆囊癌的有效手段之一。

双自杀基因体系对胆囊癌细胞体内外杀伤作用的研究

目的 研究联合应用双自杀基因对胆囊癌细胞的杀伤作用。方法 将GBC SD/CD +tk细胞和GBC SD细胞分别接种于裸鼠皮下 ,观察前体药物应用前后肿瘤体积的变化。将CD和HSV tk自杀基因转染胆囊癌细胞GBC SD ,MTT法观察 5 氟胞嘧啶或 /和丙氧鸟苷的杀伤作用。结果 单独应用 5 氟胞嘧啶或丙氧鸟苷均能对转染阳性的胆囊癌细胞GBC SD/CD +tk产生明显的杀伤效应 ,联合应用可以产生更大的杀伤作用 ,旁观者效应明显 ;GBC SD/CD +tk和GBC SD细胞分别接种裸鼠后成瘤性无明显差别 ,转染组的杀伤作用明显 ,体内局部旁观者效应明显。结论 双自杀基因的应用对胆囊癌细胞具有明显的杀伤作用 ,其旁观者效应明显。

蛋白激酶C介导的胆囊收缩素对人胰腺癌细胞的促生长作用

本文用３Ｈ－胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法研究了八肽胆囊收缩素（ＣＣＫ８）及其受体拮抗剂对人胰腺癌细胞株（ＰＵ－ＰＡＮ－１）细胞生长的作用，并观察了ＣＣＫ８对癌细胞膜和胞浆中蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）活性的影响。结果表明，ＣＣＫ８可显著刺激人胰腺癌细胞的生长（３５％～５０％），而此促生长作用可被ＣＣＫ受体拮抗剂所抑制。ＣＣＫ８也可使癌细胞膜和胞浆中ＰＫＣ活性分别升高２～１６倍和５～１４倍。ＣＣＫ８刺激细胞生长和ＰＫＣ活性增高的浓度是一致的，这提示ＰＫＣ可能介导ＣＣＫ８对人胰腺癌细胞的促生长作用。

腺病毒载体介导的早幼粒细胞性白血病生长抑制因子诱导胆囊癌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨腺病毒载体介导的早幼粒细胞性白血病(promyelocyticleukemia ,PML)生长抑制因子抑制胆囊癌细胞系(GBC- SD)的生长作用。方法 用重组绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad GFP)感染胆囊癌细胞系,检测其对胆囊癌细胞株的感染力及Ad- PML对细胞体外生长的影响。用DNAladdering和TUNEL法检测细胞凋亡,用流式细胞仪检测细胞周期。结果 腺病毒滴度为10 0MOI时被感染的胆囊癌细胞可达10 0 % ;PML能明显抑制GBC SD细胞体外生长(P <0 .0 5 ) ;Ad PML感染后GBC SD细胞出现DNA降解带,凋亡细胞数量明显增加(P <0 .0 1) ;但细胞周期无明显改变。结论PML能显著抑制GBC- SD细胞的体外生长,PML通过诱导胆囊癌细胞凋亡发挥其生长抑制作用。

多西紫杉醇诱导胆囊癌细胞凋亡的研究

多西紫杉醇是一种新型抗肿瘤药物,对多种肿瘤均有良好的生长抑制和诱导细胞凋亡的作用[1].本研究旨在观察该药对胆囊癌细胞GBC-SD增殖和凋亡的影响. 一、材料与方法 1．材料：胆囊癌细胞株GBC—SD购于上海中国科学院生化细胞所。多西紫杉醇由齐鲁制药有限公司生产。

Survivin shRNA表达质粒的构建、转染和筛选

我们采取基因静寂策略，利用psiRNA—hHlneo载体，以SurvivinmRNA为靶序列，构建在细胞内产生短发夹状RNA（shRNA）的重组质粒，观察其对胆囊癌细胞株GBC—SD的抑制作用。