槲皮素逆转人胆囊癌细胞耐药性的作用机制探讨

目的 探讨槲皮素对先天性多药耐药胆囊癌细胞株GBC-SD多药耐药性（MDR）的逆转情况。方法 分别以10个浓度阿霉素（3.33～33.28μg/ml）及其与不同浓度槲皮素（0.1、0.05、0.025μmol/L）混合液培养GBC-SD,观察细胞生存率及半数抑癌浓度值（IC50）。结果 单用阿霉素培养时IC50为16.65μg/ml,细胞生存率分别为80.58%～26.18%。加用槲皮素培养后IC50分别为6.66、9.99和13.32μg/ml,两两比较,P均〈0.05,且均显著低于单用阿霉素者（P均〈0.05）;细胞生存率均显著低于单用阿霉素者,且逆转能力呈浓度依赖性。结论 槲皮素可逆转GBC-SD的MDR。

耐顺铂人肺腺癌细胞系A_（549）DDP的建立及耐药机制

采用递增顺铂（ＤＤＰ）浓度的方法，体外连续培养建成一株耐ＤＤＰ的人肺腺癌细胞系Ａ（５４９）ＤＤＰ，耐ＤＤＰ为亲代Ａ（５４９）的２４．４倍。在无ＤＤＰ的培养基中培养５月余，其耐药性仍稳定。Ａ（５４９）ＤＤＰ细胞内谷胱甘肽（ＧＳＨ）水平显著高于亲代细胞（Ｐ＜０．０１）。ＢＳＯ耗竭细胞内ＧＳＨ后，Ａ（５４９）ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ敏感性增加５倍，ＢＳＯ对亲代Ａ（５４９）细胞无增敏作用，Ａ（５４９）ＤＤＰ细胞ＧＳＴ酶同功酶ＧＳＴ—π含量较Ａ（５４９）高１．６倍，却无ＧＳＴ基因扩增，表明ＧＳＨ／ＧＳＴ解毒系统参与Ａ（５４９）ＤＤＰ耐药性的产生。实验结果亦示Ａ（５４９）ＤＤＰ与卡铂及氨甲喋呤间存在交叉耐药，而与易产生ＭＤＲ或ａｔＭＤＲ之ＡＤＭ、ＶＣＲ、ＶＰ－１６、ＶＭ－２６无交叉耐药，Ａ（５４９）细胞无Ｐ－糖蛋白（Ｐ－ｇｐ）表达，Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ研究Ａ（５４９）ＤＤＰ无ｍｄｒｌＴｏｐｏⅡ基因扩增，提示Ａ（４５９）ＤＤＰ细胞系与ＭＤＲ及ａｔ－ＭＤＲ无交叉耐药。

6种常见耐药标志物在氟尿苷耐药绒癌细胞系构建过程中的动态表达

目的:通过检测对氟尿苷(FUDR)耐药的绒癌细胞系构建过程中肺耐药相关蛋白(LRP)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、survivin、谷胱甘肽S-转移酶-π(GST-π)、多药耐药基因(MDR1)和多药耐药相关蛋白基因(MRP)6种常见耐药标志物的动态表达,探讨其耐药机制并进行耐药标志物的初步筛选。方法:用化学发光法和荧光定量PCR技术,分别检测不同浓度FUDR诱导的JEG-3细胞中β-人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)的分泌量和上述6种常见耐药标志物在耐药细胞构建过程中的动态表达。结果:不同基因在药物诱导过程中的变化趋势不尽相同。只有LRP基因的表达随着诱导药物浓度和肿瘤细胞耐药性的增加而逐渐上调。结论:耐药的产生是分阶段的,不同阶段有不同的因素参与。就目前的研究结果而言,只有LRP的表达变化与FUDR诱导浓度和耐药性有明显正相关,提示其可以作为绒癌对FUDR耐药的候选预测指标。

绒癌耐药细胞系的建立及获得性耐药机制的研究

目的 :采用目前治疗绒癌最常用的药物诱导建立绒癌的耐药细胞系 ,比较不同药物引起耐药机制的差异。方法 :采用浓度梯度递增法和间歇诱导法 ,分别用 5 FU ,MTX ,VP 16诱导绒癌细胞系JEG 3,建立相应耐药细胞系 ,采用MTT法测定耐药细胞系对5 FU、MTX、KSM、VP 16和Taxol的耐药指数 ,用RT PCR测定亲本细胞及各耐药细胞系耐药相关基因如肺耐药蛋白 (LRP)、多药耐药相关蛋白 (MRP)、谷胱甘肽转移酶 (GST π)、二氢叶酸还原酶 (DHFR)和多药耐药基因 (MDR 1)的mRNA表达 ,比较各种细胞生长曲线 ,细胞群体倍增时间。结果 :JEG 3细胞系在诱导耐药细胞前即有LRP、MRP、GST π、DHFR的共表达 ,诱导耐药后上述各基因的表达无明显变化。诱导耐药前JEG 3细胞无MDR1的表达 ,用VP 16、5 FU间歇诱导的方法诱导形成的耐药细胞系有MDR 1表达 ,且耐药指数增加。结论 :JEG 3耐药细胞系耐药性的产生与MRP、LRP、GST π、DHFR表达的关系不密切 ,而与MDR1的表达有关。

IL-2基因转染逆转绒癌耐药细胞系多药耐药性

用RT PCR的方法克隆人的IL 2基因 ,将IL 2基因插入真核表达载体pcDNA3 1(+)中 ,通过阳离子脂质体将IL 2基因转染用足叶乙甙 (VP 16 )诱导建立的绒癌耐药细胞系JEG 3/VP16 ,用G418筛选含IL 2DNA片段的单个细胞克隆 ,检测转染前后细胞对 5 氟尿嘧啶 (5 Fu) ,氨甲蝶呤 (MTX) ,VP 16 ,更生霉素 (KSM) ,紫杉醇 (TAXOL)耐药指数的变化 ,用RT PCR的方法测定转染前后细胞IL 2和多种耐药基因包括肺耐药蛋白 (LRP) ,多药耐药相关蛋白 (MRP) ,谷胱甘肽转移酶 (GST π) ,二氢叶酸还原酶 (DHFR)和多药耐药基因 (MDR 1)的mRNA表达情况。结果表明转染IL 2的细胞中用RT PCR的方法检测到IL 2mRNA表达 ,转染IL 2基因的细胞耐药指数降低 ,MDR 1mRNA表达转阴 ,而其它耐药基因的表达无明显改变。

Caspase-3活性改变与人卵巢癌细胞系COC1/DDP耐药的关系

目的 探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP中抗凋亡蛋白Bcl-XL、Bcl-2、细胞色素C的表达及半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性与人卵巢癌顺铂耐药的关系。方法:采用RT-PCR和Western Blot分析人卵巢癌顺铂敏感细胞株COC1和顺铂耐药株COC1/DDP中Bcl-XL、Bcl-2、细胞色素C的表达和caspase-3的活性。并用流式细胞术测定顺铂作用后COC1和COC1/DDP细胞株的凋亡率。结果:在COC1/DDP细胞中,Bcl-XL和Bcl-2的表达明显高于COC1细胞;顺铂作用后,在COC1/DDP细胞株中细胞色素C的表达明显减少,caspase-3活性明显降低(P<0.05);其凋亡率也明显低于COC1细胞株(P<0.05)。结论:人卵巢癌细胞株COC1/DDP对顺铂产生耐药可能与细胞内Bcl-XL、Bcl-2过度表达抑制了线粒体细胞色素C的释放及caspase-3活性有关。

人涎腺黏液表皮样癌多药耐药细胞系的建立及其生物学特性

目的:建立一种耐药性稳定的人涎腺黏液表皮样癌细胞株(MEC/5-FU),为研究其耐药机制和逆转药物的筛选奠定实验基础。方法:采用浓度递增法联合大剂量冲击诱导方法,建立稳定的MEC/5-FU。应用MTT法、RT-PCR、罗丹明123蓄积试验等方法检测该细胞株的耐药性能及其生物学特性。结果:MEC/5-FU耐药性能稳定,对5-FU的耐药倍数达到36.11,并且对其他几种化疗药物表现不同程度的交叉耐药性。RT-PCR显示耐药相关基因ABCA2、ABCB1、ABCB11、ABCC1、ABCC4等ABC家族基因在MEC/5-FU细胞中明显高表达。罗丹明123在MEC/5-FU细胞中的蓄积量远低于MEC细胞。结论:MEC/5-FU具有多药耐药特性,为人涎腺黏液表皮样癌耐药机制和耐药逆转研究提供了理想的实验模型。

人肺腺癌多药耐药细胞系的建立

目的 :体外建立人肺腺癌多药耐药细胞系。方法 :以泰素为诱导药 ,人肺腺癌细胞系SPC -A1为诱导对象 ,逐步增加泰素浓度冲击 ,以一定浓度的泰素维持培养共计 2 4周后 ,光镜观察细胞形态 ,用MTS方法进行细胞耐药检测。结果 :SPC A1/TAX形态不规则 ,对阿霉素、长春地辛、足叶乙甙、顺铂、5 氟脲嘧啶、泰素 (紫杉醇 )六种抗癌药物有不同程度的耐药性。结论 :建立了相对稳定多药耐药细胞系SPC A1/TAX 。

卵巢癌细胞系敏感株与耐药株中环氧化酶-2的表达研究

目的:探讨环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在卵巢癌细胞系敏感株与耐药株中的表达情况。方法:应用RT-PCR和免疫细胞化学方法研究人卵巢癌细胞系敏感株与耐药株中COX-2的表达情况。结果:检测的卵巢癌细胞系3个敏感株全部明显表达COX-2mRNA,5个耐药株有较弱的COX-2mRNA表达;3个敏感株免疫细胞化学全部呈现强阳性反应,5个耐药株均呈弱阳性反应。结论:卵巢癌细胞系敏感株中COX-2表达明显高于耐药株,为卵巢癌的化学治疗提供了理论基础。

人胆囊癌耐砷细胞株GBC-SD/As的建立及其凋亡相关基因差异表达检测

目的:建立耐三氧化二砷(arsenic trioxide,As)的人胆囊癌细胞株GBC-SD/As,分析GBC-SD/As细胞株和相应的敏感细胞株GBC-SD之间多种凋亡相关基因的差异表达,探讨As所致的胆囊癌耐药与多种凋亡相关基因之间的相关性。方法:采用As浓度递增法体外诱导人胆囊癌细胞株GBC-SD,建立耐药细胞株GBC-SD/As;MTT法测定As的细胞毒作用;利用含458个凋亡相关基因的人细胞凋亡相关基因cDNA芯片检测耐药细胞株凋亡相关基因的表达变化。结果:经8个月诱导培养,成功构建耐As的人胆囊癌细胞株GBC-SD/As,与GBC-SD细胞相比,其对As的耐药倍数为13.6倍;基因芯片检测结果表明,与GBC-SD细胞相比,GBC-SD/As中有17个基因的表达水平出现2倍以上的明显改变,其中6个基因表达增强,11个基因表达下调。结论:17种凋亡相关基因与GBC-SD/As细胞的耐药密切相关,提示细胞凋亡调控相关基因表达异常可能是胆囊癌As耐药的分子机制之一。

CIK细胞联合顺铂对卵巢癌耐药细胞SKOV3/CDDP的杀伤作用

目的:探讨细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer,CIK)细胞联合顺铂对卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/CD-DP小鼠腹腔移植模型的体内外杀伤作用。方法:取正常人的外周血单个核细胞(PBMC),加入IFN-γ、IL-2、CD3McAb和IL-1,体外诱导成CIK细胞。用MTT法测定CIK细胞、顺铂及两者联合对人卵巢癌细胞株SKOV3/CDDP细胞的杀伤活性。在SCID小鼠腹腔内接种卵巢癌SKOV3/CDDP细胞,观察CIK细胞对荷瘤鼠的体内抑瘤作用,并用RIA法检测各组血清中CA125的含量。结果:顺铂对SKOV3/CDDP细胞的IC50为315.5μg/ml,较其对SKOV3细胞的IC50(85μg/ml)增加了4倍;CIK细胞对SKOV3与SKOV3/CDDP细胞的杀伤活性均在48h最高,且随效靶比的增高而增强,其对SKOV3/CDDP细胞的杀伤活性明显高于SKOV3(P<0.05)。仅25μg/ml的顺铂即可使效靶比为12.5∶1组中的联合杀伤率比单纯顺铂组增加5.8倍,比单纯加CIK(相同效靶比)细胞杀伤率增加2.3倍,且随效靶细胞比值和顺铂浓度的升高呈依赖性增加。与对照组相比,CIK组与CIK+顺铂组均能显著抑制癌性结节的生长,抑瘤率达100%,且3组SCID鼠血中CA125值有显著性差异(P<0.05)。结论:正常人CIK细胞联合顺铂对清除晚期卵巢癌表达耐药蛋白的腹腔种植转移病灶可能会有较好的效果,并有希望成为前景良好的综合治疗方案。

人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株的建立及其生物学特性观察

目的:建立人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株。方法:采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击的诱导方法建立5-FU获得性BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株。MTT法检测耐药细胞株对多种化疗药物的交叉耐药性。观察其细胞形态学、生长曲线、倍增时间、平板克隆形成率、贴壁率、细胞周期分布、染色体核型以及裸鼠致瘤性。流式细胞术检测阿霉素在亲本及耐药细胞株内的积聚量。免疫细胞化学法检测胸苷酸合酶在耐药细胞内的表达。结果:成功建立人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株模型。该耐药细胞对阿霉素、长春新碱、奥沙利铂及甲氨蝶呤均有不同程度的交叉耐药性,但对羟基喜树碱仍较敏感。体外培养见细胞趋向群集性生长。耐药细胞株倍增时间较亲本细胞株长,克隆形成率则较亲本细胞株低,差异有统计学意义。耐药细胞贴壁率在23、h明显低于亲本细胞株,其G0/G1期细胞分布比率较低而S期比率明显增加。阿霉素在耐药细胞株内的积聚量低于亲本细胞株,耐药细胞株胸苷酸合酶的蛋白表达量较亲本细胞株明显增强。结论:人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株可以成为研究5-FU获得性耐药机制及开展多药耐药逆转剂筛选较好的体外模型。

胆囊和胆管癌组织中多药耐药相关蛋白和GST-π的表达及意义

背景与目的:多药耐药性(MDR)被认为是导致胆囊癌和胆管癌化疗疗效不佳的主要原因,本实验通过免疫组织化学的方法检测胆囊癌、胆管癌组织中MRP1、MRP2和谷胱甘肽S-转移酶-π(GST-π)的表达情况,并探讨其与耐药的关系。方法:采用免疫组化的方法(IHC)检测复旦大学附属中山医院普外科自2000年2月—2006年11月收治的并行手术切除的18例胆囊癌和36例胆管癌中MRP1、MRP2及GST-π的表达情况,并以胆囊炎和胆管炎13例为对照。结果:MRP1、MRP2和GST-π在胆囊癌组织中的表达阳性率分别72.2%、72.2%和61.1%,在胆管癌组织中的表达阳性率为86.1%、80.6%和69.4%,显著高于对照组的23.1%、15.4%和23.1%(P<0.05)。上述指标与性别、年龄、病理分期、病理类型、分化程度淋巴结转移均无关(P>0.05);MRP1和GST-π、MRP2在胆囊癌和胆管癌的表达具有相关性(P<0.05)。结论:MRP1、MRP2、GST-π在未经过化疗的胆囊癌和胆管癌组织中均有不同程度的高表达;胆囊癌和胆管癌的原发性多药耐药可能与MRP、MRP、GST-π有关。

无血清培养胆囊癌GBC-SD细胞形成肿瘤细胞球的鉴定

目的:分离扩增肿瘤干细胞,并鉴定其生物学性质.方法:用无血清培养基培养人胆囊癌GBC-SD细胞得到肿瘤细胞球.将肿瘤细胞球传代扩增,并用含血清培养基培养促使其分化;将肿瘤球和普通GBC-SD细胞分别种入96孔板,MTT检测增殖能力,并将肿瘤球和普通GBC-SD细胞分别植入裸鼠皮下,观察移植瘤的形成;流式细胞术检测CD15s和CD24在肿瘤球细胞和普通GBC-SD细胞中的表达,筛选细胞表面标志物.结果:在无血清培养基中,胆囊癌细胞可以形成少量的肿瘤细胞球,并显示很强的自我更新和增殖能力,含血清环境能够诱导其分化而贴壁生长;在动物实验中,肿瘤球细胞较普通GBC-SD细胞显示更强的致瘤能力(80.00%vs10.00%,P<0.05);标志物CD15s在肿瘤球的表达较普通GBC-SD细胞明显增高(2.56%±0.38%vs10.77%±0.93%,t=18.25,P<0.05).结论:人胆囊癌细胞GBC-SD的肿瘤干细胞可以通过无血清培养环境来分离和扩增,CD15s可能为其细胞表面标志物.

CIK细胞联合多西紫杉醇对肺腺癌耐药细胞SPC-A1/DTX的体内外杀伤作用的实验研究

目的:探讨正常人细胞因子诱导的杀伤(Cytokine induced-killer,CIK)细胞联合多西紫杉醇对肺腺癌多西紫杉醇耐药细胞SPC-A1/DTX的体内外杀伤作用。方法:取健康人外周血单个核细胞,经IFN-γ、IL-2、抗CD3单抗联合诱导CIK细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定多西紫杉醇、CIK细胞及两者联合对耐药细胞SPC-A1/DTX体外的细胞毒活性。用肺腺癌耐药细胞SPC-A1/DTX建立裸鼠皮下移植瘤模型,2周后腹腔给予生理盐水(对照组)、多西紫杉醇(单纯化疗组)、CIK细胞和CIK细胞联合多西紫杉醇(联合治疗组),观察它们对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。结果:体外实验表明,SPC-A1/DTX对多西紫杉醇的耐受性(IC50为110.5μg/ml)较亲代敏感株SPC-A1(IC50为8.5μg/ml)增加了13倍。CIK细胞对人肺腺癌多西紫杉醇耐药细胞SPC-A1/DTX的杀伤活性,明显高于其亲代敏感株SPC-A1(P<0.05)。经CIK细胞作用后的SPC-A1/DTX细胞,仅10μg/ml的DTX即可使CIK:SPC-A1/DTX效靶比为5:1组中的联合杀伤率比单纯加DTX(同等剂量)组增加6.1倍,比单纯加CIK(相同效靶比)细胞杀伤率增加1.4倍,联合杀伤率的大小随效靶细胞比值和DTX浓度的升高呈依赖性增加。体内实验表明,CIK细胞联合多西紫杉醇可明显抑制裸鼠皮下肺腺癌耐药细胞移植瘤的生长,联合治疗组肿瘤生长缓慢,肿瘤组织坏死、淋巴细胞浸润明显。结论:CIK细胞联合多西紫杉醇能够显著抑制体内外肺腺癌多药耐药细胞SPC-A1/DTX的生长,为临床上应用CIK细胞联合化疗治疗放、化疗等无效的中晚期耐药肺癌患者提供了实验依据。

胆囊癌与胆管癌多药耐药类蛋白的表达

目的 了解多药耐药类蛋白P -糖蛋白 (P -gp) ,谷胱甘肽 -S -转移酶 (GST -π) ,DNA拓扑异构酶Ⅱα(TopoⅡα)在胆囊癌和胆管癌化疗耐药机制中的作用及其相互关系。方法 用免疫组化EnVision二步法检测 2 6例胆囊癌和 2 8例胆管癌组织的P -gp ,GST -π ,TopoⅡα 蛋白的表达情况。结果 P -gp ,GST -π ,TopoⅡα 蛋白在胆囊癌的阳性表达率分别为6 1 .5 % ,6 9.2 % ,76 .9% ,而在胆管癌的阳性表达率分别为 71 .4 % ,85 .7% ,5 7.1 % ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。P -gp和GST -π蛋白在分化高的癌组织中阳性表达高 ,TopoⅡα 则在分化低的癌组织中阳性表达高 ,P -gp和GST -π蛋白的表达呈正相关。结论 胆囊癌和胆管癌的化疗耐药机制类似 ,P -gp ,GST -π ,TopoⅡα 均参与其化疗耐药形成过程 ,当癌组织P -gp和GST -π蛋白低表达 ,TopoⅡα 蛋白高表达 。

TGF-β_1对耐药细胞系Tca8113/CDDP增殖和凋亡影响的研究

目的 研究TGF β1对耐药细胞系Tca8113/CDDP增殖与凋亡的影响。方法 以人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113诱导产生的耐药细胞系Tca8113/CDDP为研究对象。应用ELISA法检测转化生长因子TGF β1在Tca8113/CDDP细胞中的表达水平。另在体外用不同浓度的TGF β1对Tca8113/CDDP细胞进行作用 ,通过吉姆萨(Giemsa)染色、MTT比色法和DNA琼脂糖凝胶电泳 ,观察Tca8113/CDDP细胞的凋亡情况。结果 ELISA检测可知Tca8113/CDDP细胞内和无血清培养液中的TGF β1的表达水平均低于Tca8113(P <0 .0 1)。体外诱导凋亡实验 ,TGF β1的浓度高于 0 .1ng/ml时 ,Tca8113/CDDP即有显著的凋亡特征出现 ,细胞皱缩脱落。Geimsa染色可见凋亡小体形成 ;MTT法显示Tca8113/CDDP细胞的凋亡与TGF β1的浓度有一定的相关性 ;DNA琼脂糖凝胶电泳有典型的梯状条带。结论 Tca8113/CDDP自身的TGF β1的表达水平与其增殖状态有关 ;外源TGF β1(0 .1ng/ml)可以显著的诱导Tca8113/CDDP凋亡。

P-gp和GST-π在胆囊癌中的表达与化疗耐药的研究

目的 通过检测胆囊癌组织中P -糖蛋白 (P - gp)和胎盘型谷胱苷肽S转移酶(GST -π)的表达状况 ,揭示胆囊癌对化疗不敏感的内在机制。方法 38例胆囊癌组织石蜡标本 ,12例结石性胆囊炎组织石蜡标本分别进行生物素蛋白链菌素 -生物素 -过氧化物酶免疫组织化学染色 ,按照既定的阳性标准判定染色结果。结果 P - gp和GST -π在胆囊癌的表达阳性率分别为 78.9%和 6 5 .7% ,而在胆囊良性疾病中两者阳性率分别为 2 5 %和 16 .6 % ,两者比较均具有显著性差异 (P <0 .0 5 )。结论 P - gp、GST

钙网蛋白在甲氨蝶呤耐药绒毛膜癌中的作用研究

目的:探讨钙网蛋白(CALR)在对甲氨蝶呤(MTX)耐药的人绒毛膜癌中的作用。方法:采用Western blot印迹和细胞免疫荧光方法检测CALR蛋白在对MTX间断诱导耐药绒毛膜癌细胞株JeG-3/MTXA1与亲本细胞JeG-3中的表达差异,观察利用RNA干扰(RNAi)技术干扰CALR表达后耐药细胞耐药指数的变化。结果:Western blot验证结果,CALR在耐药细胞JeG-3/MTXA1中的表达明显高于亲本细胞JeG-3。细胞免疫荧光结果,在耐药细胞JeG-3/MTXA1中,CALR蛋白表达明显较亲本细胞JeG-3增多,且近核表达增强。经过RNAi后,耐药细胞JeG-3/MTXA1的耐药指数下调74.05%(33.94±0.68vs8.81±1.58),而对细胞增殖无明显影响。结论:CALR蛋白在耐药细胞中明显上调,干扰其表达后耐药细胞可明显降低其耐药指数。CALR可能参与对MTX耐药绒毛膜癌的发生。