胆固醇氧化酶高产菌株的复合诱变选育

为进一步提高产酶水平,本实验采用超声波联合亚硝基胍的复合诱变方法处理胆固醇氧化酶产生菌(甾短杆菌),通过1mg/mL亚硝基胍和超声(200W,50kHz,35min)同时处理细胞悬液,获得一株红色突变株,其产酶活力从0.5U/mL提高到1.21U/mL,酶活提高了140%。证明该联合诱变手段对甾短杆菌产胆固醇氧化酶具有良好的诱变效果。

微生物胆固醇氧化酶的研究进展

微生物来源的胆固醇氧化酶在医疗诊断、食品加工、生化制药、抗虫基因工程等方面具有良好的应用价值,引起了国内外学者的广泛关注,并开展了大量的研究工作。本文就胆固醇氧化酶的种类、酶学性质、结构、功能、应用及近年来基因工程等方面的研究进展作一综述。

产胆固醇氧化酶重组大肠杆菌的发酵培养基和诱导条件的优化

在摇瓶中对产胆固醇氧化酶重组大肠杆菌的发酵培养基和诱导条件进行了优化,优化培养基为甘油10 g/L,胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,KH2PO42 g/L,K2HPO44 g/L,Na2HPO4.12 H2O7 g/L,(NH4)2SO41.2 g/L,NH4Cl 0.2 g/L,MgSO4.7 H2O1 g/L;优化的诱导条件为:对数生长中期诱导,IPTG浓度为0.3 mmol/L。在优化的培养基和优化的诱导条件下,单位菌体产酶量达745.86 U/g,菌体产酶水平达1 625.97 U/L,为优化前的700 U/L的2.3倍。

利用胆固醇氧化酶转化胆固醇制备胆甾-4-烯-3-酮

用酶法催化氧化胆固醇制备胆甾 4 烯 3 酮相对于化学法合成具有反应简单、成本较低等优点 .作者探讨了在正辛烷作为有机相的两相反应体系中 ,以胆固醇氧化酶催化氧化胆固醇制备胆甾 4 烯 3 酮的方法 .在胆固醇质量浓度为 4 0 g/L ,反应时间 4 0min、反应温度 4 0℃、磷酸缓冲液 正辛烷体积比 3:2、通氧 4 0L/h及搅拌转速 30 0r/min下 ,胆固醇转化率达到 92 % ,经薄板层析及紫外扫描 ,发现转化产物为单一的胆甾 4 烯 3

胆固醇氧化酶基因的克隆及在E.coli中的表达

根据NCBI中报道的BrevibacteriumsterolicumATCC21387胆固醇氧化酶基因序列,采用PCR方法以Brevibacteriumsp.DGCDC-82的基因组为模板,扩增得到了编码胆固醇氧化酶的基因,该基因与来源于BrevibacteriumsterolicumATCC21387的胆固醇氧化酶基因(choB)同源性为98%。将得到的基因定向克隆到pET28a载体中,转化至含有编码argU和proL基因的大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP中表达。经过IPTG诱导后,经SDS-PAGE检测在约55kD处有一蛋白表达条带,目的蛋白表达量约占总蛋白的16%,经测定酶活为340U/L。

胆固醇氧化酶转化蛋黄胆固醇工艺的优化

研究了用响应面分析法 (RSM )优化酶法转化蛋黄胆固醇的工艺 ,发现胆固醇氧化酶(COD)添加量及蛋黄粉的稀释率是影响蛋黄胆固醇转化率最重要的因素 .在模拟优化的条件下 :反应时间为 14.15h ,蛋黄粉稀释率为 3.5 4 ,COD为 5 .39U /g时 ,胆固醇转化率达 85 6 1% .对氧化产物进行分析发现 :仅有单一产物胆甾烯酮 ,该产物具有降血脂、减肥等功效 .

三相分离甾短杆菌胆固醇氧化酶及其性质

三相分离（TPP）是将硫酸铵与叔丁醇混合后形成有机相、中间沉淀相和水相。在20°C,调节发酵上清液的pH至6.0,加入硫酸铵使终浓度为400 g/L,溶解后加入与上清液等体积的叔丁醇,静置1 h分相,胆固醇氧化酶在有机相和水相之间形成蛋白沉淀,12 000 r/min离心10 min收集中间蛋白相,用pH 7.5,10 mmol/L的磷酸缓冲液溶解。结果表明：利用三相分离技术从乳化体系中分离纯化胆固醇氧化酶,比酶活提高了3.49倍,收率达93%。回收的酶液进一步经过DEAE-Sepharose Fast Flow纯化,比酶活从3.56 U/mg提高到30.15 U/mg。该酶最适反应温度为60°C,最适反应pH为7.5,酶的等电点为8.5,该酶在37°C,pH 6.0~8.0较为稳定。Hg2＋和Ag＋离子完全抑制胆固醇氧化酶的活性。

溶胶-凝胶法固定胆固醇氧化酶偶联普鲁士蓝化学修饰电极的研究

用溶胶-凝胶法将胆固醇氧化酶固定在普鲁士蓝修饰的玻碳电极表面,制成了一种新型胆固醇传感器,实现了低电位下对胆固醇的间接测定,胆固醇的测定范围伏安法为5×10^(-7)～8×10^(-5)mol/L,安培法为5×10^(-6)～5×10^(-4)mol/L。伏安法检出限为1.2×10^(-7)mol/L,是目前所见灵敏度最高的胆固醇传感器之一,该传感器对胆固醇的测定可避免常规电化学传感器测定中由于样品中大量存在的易氧化物质所带来的干扰,该传感器的寿命长,使用次数在300次以上。

比色法测定胆固醇氧化酶酶活

根据实验结果和理论计算确定检测体系中胆固醇的质量浓度为 0 .3 87mg/mL ,表面活性剂的质量浓度为 0 .2 g/dL ,确定过氧化氢浓度与反应液吸光度之间的定量关系 .在此基础上 ,建立了比色法测定胆固醇氧化酶酶活的方法 .

短杆菌属产胆固醇氧化酶的发酵条件优化

短杆菌属(Brevibacterium sp.)是胆固醇氧化酶高产菌,对其进行底物诱导及发酵条件的优化,其最适培养基为蔗糖0.3%,酵母膏0.2%,蛋白胨0.3%,牛肉膏0.3%,K2HPO4 0.1%,MgSO4 0.05%,pH6.8。最适培养条件为接种量5%,24℃培养20h,通气量为50mL培养基/250mL三角瓶,200r/min。结果表明,胆固醇氧化酶的酶活力可达到2439U/L,比未优化前195U/L提高了12倍。在pH6.5和温度54℃条件下测得酶米氏常数Km值为7.1×10-5 mol/L。

重组大肠杆菌产胆固醇氧化酶的指数流加策略

以指数流加策略高密度培养重组大肠杆菌,发酵生产胆固醇氧化酶。通过对比生长速率的分阶段控制使得细胞干重达40.128g/L。确定了最佳的诱导时机为菌体对数生长期的中期,产酶速率为1287.31U/(L·h)。菌体产酶水平达6436.56U/L,生产强度为459.75U/(L·h),实现了胆固醇氧化酶的高效生产。

高密度培养重组E-coli产胆固醇氧化酶的乳糖诱导策略

研究了乳糖诱导重组大肠杆菌表达胆固醇氧化酶。结果表明,乳糖不仅可以作为诱导剂诱导外源蛋白的合成,而且能作为碳源促进菌体的生长。通过对诱导条件的优化,实现了重组大肠杆菌的高密度培养,最高密度达68.9(OD600);在此基础上确定了最佳的诱导时机为发酵中期,菌体产酶水平达6005.66U/L,生产强度为200.19U/L.h,实现了胆固醇氧化酶的高效生产。

聚吡咯固定胆固醇氧化酶/普鲁士蓝安培传感器的研制

利用电聚合吡咯的方法将胆固醇氧化酶固定在普鲁士蓝 (PB)修饰玻碳电极表面 ,制成了一种新型胆固醇安培传感器。PB膜修饰电极催化过氧化氢电还原 ,于 0V(vs.Ag ACl)产生灵敏还原峰 ,利用安培法可对胆固醇进行间接测定。胆固醇的测定范围为 0～ 2× 10 - 4mol L ,检出限为 6× 10 - 7mol L ,灵敏度较当前胆固醇传感器有明显的提高。

Bacillus cereus SG03 10L发酵罐中产胞外胆固醇氧化酶发酵条件优化

目的:优化菌株Bacillus cereus SG03在10L发酵罐中产胆固醇氧化酶的工艺条件,为该菌株的进一步应用提供依据。方法:在10L发酵罐中,通过单因素实验,分别考察了培养液起始pH、搅拌速率、溶解氧(DO)浓度对Bacillus cereus SG03产胞外胆固醇氧化酶的影响。结果:较佳的发酵条件为培养液起始pH6.8、搅拌速率250r/min、溶解氧(DO)浓度80%。在此基础上,对发酵过程进行了两阶段DO控制,发酵前20h DO控制在90%,然后调整为20%,直至发酵结束。较单一DO控制,最大胞外胆固醇氧化酶产量、生产效率分别提高了30.2%和20.0%,达到了1.38U/mL和0.03U/(mL·h)。

高活性胆固醇氧化酶产生菌出发菌株的筛选

从4个不同来源的样品中筛选出高产胞内胆固醇氧化酶的出发菌株,经鉴定为假单胞菌属。用五种处理方法对细胞进行破壁,使其释放出胞内酶,结果表明,超声波处理胞内酶破壁效果较好,最高酶活可达到63.9u/g湿菌体。

乳糖诱导重组大肠杆菌表达胆固醇氧化酶的研究

采用乳糖诱导胆固醇氧化酶(COD)基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,研究了培养基成分、乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对胆固醇氧化酶表达的影响。结果显示,在对诱导条件进行优化控制的前提下,胆固醇氧化酶酶活达到15.2 U/mL。研究结果为乳糖作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了有益的参考和借鉴。

构建胆固醇氧化酶的短杆菌基因文库

以内切酶Sau3AI部分水解产胆固醇氧化酶短杆菌的染色体DNA,以质粒pUC18为载体,JM109为宿主,采用碱性磷酸酯酶CIP去除内切酶BamHI水解后质粒的5’端磷酸根,提高质粒的重组率。

信号肽对短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中表达的影响

从Brevibacterium sp.DGCDC-82染色体DNA中扩增出含信号肽序列的胆固醇氧化酶结构基因,插入大肠杆菌表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a-COD(s+)。以pET28a-COD(s+)为底物,扩增出不合信号肽的胆固醇氧化酶结构基因,构建成重组质粒pET28a-COD(s-)。两种重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)通过IPTG诱导均获得活性表达,SDS-PAGE分析,目的产物表达量都占到了细胞总蛋白的50%以上,Brevibacterium sp.DGCDC-82胆固醇氧化酶的信号肽对重组酶的空间构象和表达量并没有太大的影响。

不同诱变方法对青霉TS406Y胆固醇氧化酶活性的影响

以青霉TS406Y(Penicillum sp.)为诱变出发菌株,评价了硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)和甲基磺酸乙酯(EMS)对该菌株的诱变效应,发现在常规剂量内达到70%致死率时所需要的时间分别为23,3,90 min.根据使用方便和安全原则,进行了青霉TS406Y的DES诱变和选育,获得了胆固醇氧化酶活性提高84.5%的突变菌株D5,其胆固醇氧化酶活性达到了1240 U/L,连续传代6次,发现D5菌株具有遗传稳定性.另外还发现,利用紫外线(UV)和EDS对单因素诱变后获得的胆固醇氧化酶高产菌株进行复合诱变,94%的突变菌株为负变菌株.