5-氟尿嘧啶半乳糖神经酰胺脂质体的抗耐药作用及部分机制研究

目的研究5氟尿嘧啶半乳糖神经酰胺脂质体(5FuGCL)体外对耐5FuHepG2细胞株的抑制作用并对其抗耐药机制进行探讨。方法在建立耐5Fu的HepG2细胞株模型的基础上,采用MTT法检测5FuGCL对其的抑制作用。另外,通过高效液相法(HPLC)检测细胞内液的药物含量、免疫组化法检测胸苷酸合酶(TS)的表达、化学法检测NO含量等研究其抗耐药作用机制。结果5FuGCL(75,150,300,600,1200μmol·L-1)对耐5Fu的HepG2细胞株有明显的抑制作用,IC50为158.6μmol·L-1,远小于游离5Fu(400.9μmol·L-1);5FuGCL(300μmol·L-1)对耐5Fu的HepG2细胞的抑制作用随时间的延长而增强,其中(24～48h)的抑制作用明显强于相同浓度的游离5Fu。5FuGCL(300μmol·L-1)与相同浓度的游离5Fu比较,能明显增加药物进入HepG2细胞内液的程度;5FuGCL(75,300,1200μmol·L-1)既可明显降低TS的表达,又可显著增加NO的含量,且5FuGCL(300,1200μmol·L-1)与相同浓度的游离5Fu相比,其作用明显增强。结论5FuGCL有明显的抗5Fu耐药作用,这可能是通过增加细胞内液5Fu的含量,抑制TS的表达和增加NO含量实现的。

肽-半乳糖苷-阿霉素脂质体在肝细胞癌靶向治疗中作用

目的:获得一种对肝细胞癌具有特异靶向的药物传递系统载体—聚乙二醇修饰的MMP-2底物肽-半乳糖苷-阿霉素脂质体(PEG-PD-Gal-ADM-liposomes),为临床肝癌的靶向治疗提供实验依据。方法:将二棕榈磷脂酰基乙醇胺(DOPE)与聚乙二醇化的MMP-2底物肽连接(Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln),即获得可被MMP-2切割的聚乙二醇-底物肽-DOPE,再与半乳糖苷脂质体(Gal-liposomes)、阿霉素(ADM)耦合,最终获得聚乙二醇修饰的MMP-2底物肽-半乳糖苷-阿霉素脂质体(PEG-PD- Gal-ADM-liposomes),体外观察其对人肝癌细胞株HepG2的效应。结果:MTT法显示PEG-PD-Gal-ADM脂质体对人肝癌细胞株HepG2的毒性作用弱于半乳糖苷-阿霉素脂质体(PEG-Gal-ADM)的作用(P<0.05),对人结肠癌细胞株SW480的毒性作用二者之间无显著差异;用MMP-2(5μ/ml)预处理后,PEG-PD-Gal-ADM脂质体对人肝癌细胞株HepG2的毒性作用与Gal-ADM脂质体的作用相近,无显著差异(P>0.05);加入过量的半乳糖封闭半乳糖受体后,二者的毒性作用均有下降,无显著性差异(P>0.05)。结论:PEG-PD-Gal-ADM脂质体是一种新型的HCC特异靶向治疗药物传递载体,可能是将来HCC靶向治疗的重要手段。

半乳糖配体介导多烯紫杉醇脂质体靶向性研究

目的:研究经半乳糖配体修饰后的多烯紫杉醇脂质体(docetaxel liposomes modified with galactose ligand,Gal-DOC-L)在小鼠体内的组织分布,探讨Gal-DOC-L对肝脏的靶向作用。方法:采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatogra-phy,HPLC)测定各组织中多烯紫杉醇的药物浓度,以多烯紫杉醇普通脂质体(docetaxel liposomes,DOC-L)为对比,分别采用相对摄取率re、峰浓度比Ce和靶向效率te作为评价参数,对Gal-DOC-L的肝靶向性进行评价。结果:DOC-L和Gal-DOC-L的re分别为2.80和4.34,Ce分别为1.67和2.38,te分别为28.44%和38.91%。结论:药物经脂质体包封后对肝脏具有一定的靶向效应,而半乳糖配体的引入可进一步提高脂质体对肝脏的靶向性。

阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在_及GRC细胞株中的表达

目的 :研究阳离子脂质体Lipofectin介导的 β 半乳糖苷酶基因在不同肿瘤细胞株中的表达。 方法 :质粒pDCβ在大肠杆菌DH5α中扩增后用碱裂解法提取 ,并经Sepharose 2B凝胶过滤柱层析 ,以Lipofectin分别转染人肝癌细胞株HepG2 、人肾癌细胞株GRC ,然后用X gal细胞化学染色法检测 β 半乳糖苷酶活性。 结果 :β 半乳糖苷酶活性在HepG2 、GRC中均有表达。结论

半乳糖上调内皮细胞Siglec-9聚糖配体水平抑制巨噬细胞活性

目的探究半乳糖对人原代肺动脉内皮细胞上唾液酸特异性Ig样凝集素-9(sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin 9,Siglec-9)聚糖配体表达的影响及作用机制。方法采用流式细胞术确定内皮细胞表面Siglec-9聚糖配体的表达并鉴定该聚糖配体末端糖苷键类型;分别用左旋葡萄糖、葡萄糖、N-乙酰基葡萄糖、甘露糖、N-乙酰基甘露糖、半乳糖、唾液酸、蔗糖处理内皮细胞48 h,采用流式细胞术检测内皮细胞Siglec-9聚糖配体的表达;将内皮细胞分为对照组和半乳糖组(n=3),Western blot、流式细胞术、免疫荧光分析半乳糖对内皮细胞Siglec-9聚糖配体表达的影响;α2-3,6,8唾液酸酶处理内皮细胞后,Western blot检测半乳糖对内皮细胞Siglec-9聚糖配体恢复时间的影响;半乳糖处理内皮细胞后,Western blot检测分析细胞内唾液酸合成关键酶(GNE、NANS、NANP、CMAS、NPL以及ST3Gals)表达水平,并用RT-qPCR验证相关蛋白的mRNA表达;siRNA敲低NANP、CMAS及ST3Gal-Ⅲ,Western blot检测内皮细胞Siglec-9聚糖配体水平变化;巨噬细胞与内皮细胞共培养实验分析Siglec-9聚糖配体的增加对巨噬细胞的凋亡与吞噬能力的影响。结果内皮细胞上表达有Siglec-9聚糖配体且该配体为末端结构为α2-3连接的唾液酸糖蛋白;与对照组比较,半乳糖组内皮细胞上该聚糖配体表达水平显著增加(P<0.01),但半乳糖的添加对该配体的自我恢复时间无影响;与对照组比较,半乳糖处理的内皮细胞中NANP、CMAS、ST3Gal-Ⅲ表达水平升高(P<0.05,P<0.01),且RT-qPCR验证结果与其一致;抑制内皮细胞中NANP、CMAS、ST3Gal-Ⅲ的表达后,内皮细胞Siglec-9聚糖配体水平下降(P<0.01)。共培养实验中,与未处理组比较,半乳糖处理的内皮细胞促进巨噬细胞凋亡增加(P<0.01),并导致其吞噬能力减弱(P<0.05)。结论半乳糖通过NANP-CMAS-ST3Gal-Ⅲ通路上调内皮细胞上Siglec-9聚糖配体水平,从而抑制巨噬细胞活性。

半乳糖化脂质体-聚阳离子-DNA复合物的肝靶向性研究

目的研究半乳糖苷修饰的脂质体-聚阳离子-DNA复合物（Gal-LPD）在体外的肝细胞靶向性。方法合成胆甾五半乳糖苷（Gal-chol）,并用薄膜-超声分散法制备空白阳离子脂质体,再与鱼精蛋白-DNA复合物形成Gal-LPD;用激光粒度仪及电位分析仪测定其粒径和电位;以lacZ质粒DNA作为报告基因,用HepG2肝癌细胞和A549肺癌细胞考察LPD的转染效率;用MTT法测定其细胞的毒性。结果Gal-LPD的粒径为200 nm;Zeta电位随阳离子成分DDAB-DNA比例的不同而在20-55 mV间变化;与未用半乳糖修饰的LPD0相比,Gal-LPD在HepG2细胞中的转染率提高了2.4倍,但在A549细胞中的转染率却有所下降,而且半乳糖能竞争抑制Gal-LPD在HepG2细胞中的转基因效率;Gal-LPD无明显的细胞毒性。结论Gal-LPD在HepG2细胞中有较高的转基因效率,具有体外的肝细胞靶向性。

壳聚糖/N-乙酰-D-半乳糖胺修饰水飞蓟宾配体脂质体的抗氧化作用研究

水飞蓟宾是一种具有抗氧化、抗脂质过氧化作用的成分。本实验采用薄膜分散法制备不同投药量脂质体,并通过滴加法将壳聚糖修饰到脂质体上和通过水合介质将N-乙酰-D-半乳糖胺修饰到脂质体上,以包封率和载药量为主要指标,采用Fenton法测定脂质体清除羟基自由基的适宜浓度和清除率。清除羟基自由基实验结果比较,当浓度为30μg/mL时,脂质体有最大清除率。清除率最高的是投药量为0.0100 g的N-乙酰-D-半乳糖胺修饰的水飞蓟宾脂质体为94%。投药量为0.0080 g的壳聚糖修饰的水飞蓟宾脂质体的包封率93.76%和载药量2.65%为最佳。除壳聚糖修饰的水飞蓟宾脂质体,其他不同修饰的水飞蓟宾脂质体的羟基自由基清除率都随着包封率和载药量的增大而提高。样品间有显著性差异(P<0.05)。

微柱离心-HPLC法测定半乳糖化去甲斑蝥素脂质体的包封率

采用SephadexG-50微柱离心法结合HPLC法测定了半乳糖化胆固醇配体修饰去甲斑蝥素脂质体(Gal-NCTD-Lips)的包封率,并进行质量评价。当离心力为1000 r/min,离心时间为1 min,Gal-NCTD-Lips上样量为0.2 mL时,微柱离心法能有效分离脂质体和游离药物。在所建立的色谱条件下,去甲斑蝥素在0.03~0.18 mg/mL范围内线性关系良好(r=0.9994),高、中、低三种浓度的加样回收率分别为98.5%、98.9%、97.9%,包封率为51.06%±2.65%(n=5)。3种浓度的凝胶微柱的加样回收率分别为101.8%、99.25%、101.1%,RSD分别为1.69%、1.95%、1.40%,结果显示该方法准确、快速,能用于Gal-NCTD-Lips包封率的测定。

齐多夫定棕榈酸酯半乳糖化脂质体在小鼠体内的分布

肝实质细胞作为人类免疫缺陷病毒的贮库,与病毒不断地向外周循环扩散有关。本文制备了含自制[(2-乳糖酰胺基)乙胺基]甲酸胆固醇酯([(2-lactoylamido)ethylamino]formic acid cholesterol ester,CH-ED-LA)为“肝自导向”辅料的齐多夫定棕榈酸酯(azidothymidine palmitate,AZTP)半乳糖化脂质体(GalLs),并对齐多夫定棕榈酸酯半乳糖化脂质体在小鼠体内的分布进行了研究。采用乙醇注入-超声分散法制备了以下4种脂质体,脂质构成分别为:大豆磷脂(SPC)/胆固醇(CH)/CH-ED-LA(80∶10∶10,10%GalLs),SPC/CH/CH-ED-LA(80∶15∶5,5%GalLs),SPC/CH/CH-ED-LA(80∶17∶3,3%GalLs)和SPC/CH(80∶20,CL),测得各脂质体的包封率均大于95%,平均粒径均小于100 nm;CH-ED-LA的加入量对AZTP脂质体的膜电位和药物含量均无影响。小鼠尾静脉注射齐多夫定溶液剂15.85 mg.kg-1、齐多夫定棕榈酸酯普通脂质体及半乳糖化脂质体各30 mg.kg-1,HPLC法测定药物在小鼠体内各组织中的分布。各脂质体组的药物半衰期较溶液组均有显著增加(P<0.05);与齐多夫定溶液剂相比,齐多夫定棕榈酸酯普通脂质体和CH-ED-LA分别占脂质总量3%,5%,10%(mol/mol)的半乳糖化脂质体的药物肝靶向摄取率(re)分别为1.32和1.48,2.13和1.50。结果表明含新糖脂CH-ED-LA的脂质体可显著改善齐多夫定棕榈酸酯的肝靶向性,可望成为一种有用的靶向肝的药物传递载体。

半乳糖化脂质体在小鼠体内肝靶向性评价

目的以阿霉素为模型药物,研究半乳糖化脂质体在小鼠体内的肝靶向性和肝实质细胞靶向性。方法以新型半乳糖化胆固醇,(5-胆甾烯-3β-氧基)4-氧代-4-[2-乳糖酰胺基乙氨基]丁酸酯(CHS-ED-LA)为肝靶向辅料,采用硫酸铵梯度法制备阿霉素普通脂质体和半乳糖化脂质体。小鼠尾静脉注射阿霉素溶液、普通脂质体及半乳糖化脂质体(10 mg.kg-1),采用荧光分光光度法测定阿霉素在小鼠体内各组织及肝细胞中的含量。用靶向效率(Te)评价阿霉素半乳糖化脂质体的肝靶向性。结果阿霉素脂质体包封率>95%,平均粒径约80 nm。与阿霉素溶液组比较,阿霉素普通脂质体及阿霉素半乳糖化脂质体组的体内循环时间明显延长,而在心和肾两组织中的量显著降低。普通脂质体和CHS-ED-LA分别占脂质总量2%,5%,10%的半乳糖化脂质体的阿霉素肝靶向效率(Te)(%)分别为15.41,18.21,32.16,50.07,肝实质细胞与非实质细胞的分布比分别为52∶48,58∶42,78∶22,88∶12。结论半乳糖化脂质体可显著提高阿霉素的肝靶向性及肝实质细胞靶向性。

以β-半乳糖苷酶脂质体为模型筛选冷冻干燥保护剂的新方法

[目的]以β-半乳糖苷酶脂质体的直径、分散系数(PDI)和Zeta电位为检测指标,联合透射电子显微镜法,创建一种利用脂质体模拟细胞膜筛选冷冻干燥保护剂的模型,从而快速筛选出瑞士乳杆菌冷冻干燥保护剂,有效提高乳酸菌冻藏菌种的活性。[方法]拟采用800 W功率超声10 min的方法来获取优质β-半乳糖苷酶脂质体,添加不同的冻干保护剂后进行冻存。以冻干脂质体水解后β-半乳糖苷酶渗透率为评价指标,评价冷冻干燥保护剂的保护效果。[结果]海藻糖浓度为100 mg/L、透明质酸浓度为2 mg/L时,β-半乳糖苷酶渗透速率最慢。选取瑞士乳杆菌9(LH-9)对上述结果进行验证,发现冻干保护剂对LH-9有同样的保护作用。[结论]该研究为今后乳酸菌冻干保护剂的筛选研究提供新思路。

肝靶向半乳糖化HCPT脂质体的研究

为了增强脂质体作为药物载体对肝癌细胞的靶向能力,通过在脂质体表面修饰肝靶向基团的方法,设计并合成了新型低毒性的肝细胞靶向脂质材料(Mono-Gal-ST),并制备了相应的半乳糖修饰的脂质体(MonoGal-LPs)和常规脂质体(LPs)。体外生物学实验结果表明,与LPs相比,Mono-Gal-LPs有更好的肝靶向能力和区分肝癌细胞和正常细胞的能力。

5-氟尿嘧啶神经酰胺脂质体急性毒性的昼夜节律研究

目的 研究 5 氟尿嘧啶 (5 FU)半乳糖神经酰胺 (GalCer)脂质体急性毒性是否存在昼夜节律。方法 分别于 4、10、16、2 2时 ,采用静脉注射 (iv) ,观察小鼠给予包封有 5 FU的GalCer脂质体后所产生的毒性反应和死亡情况 ,计算半数致死量(LD50 )。结果 iv 5 FUGalCer脂质体LD50 分别为 171 0、2 5 2 5、2 70 1和 2 0 2 7mg·kg-1;其 95 %可信区间分别为 15 2 8～190 3、2 2 6 8～ 2 81 1、2 2 2 0～ 32 7 5和 173 1～ 2 36 5mg·kg-1。结论 5 FUGalCer脂质体夜间的急性毒性大于白天 。

高效液相色谱-蒸发光散射法检测酶促催化反应中底物D-半乳糖

目的：建立酶促催化反应中底物D-半乳糖的测定方法。方法：采用高效液相色谱-蒸发光散射法（HPLC-ELSD法）测定酶促催化反应中底物D-半乳糖的含量,色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18（2）柱（250mm×4.6mm,5μm）,流动相为乙腈-水,流速为1.0ml·min-1,柱温为35℃,检测器为SEDEX-75型蒸发光散射检测器（漂移管温度为45℃,载气压力为3.0bar）。结果：D-半乳糖在0.5~10.0mg·ml-1范围内呈良好的线性关系（r=0.9995）,平均回收率分别为100.3%,RSD为1.6%。结论：该方法准确、重复性好,适用于酶促催化反应中底物D-半乳糖的测定。

细胞表面β1,4-半乳糖基转移酶1功能研究进展

β1,4-半乳糖基转移酶1(β1,4-galactosyltransferase1,β4GalT1)是人们研究最广泛、最深入的糖基转移酶之一。β4GalT1的基因编码了长形和短形两种蛋白,长形的=βGalT1比短形的β4GalT1在胞浆区多了13个氨基酸的尾巴,正是由于这种差异造成了β4GalT1定位以及功能上的不同,短形的βGalT1和部分长形的β4GalT1分布在高尔基体上,发挥糖基转移酶的基本功能,还有一部分长形的β4GalT1分布在细胞表面,发挥粘附分子样作用,在精卵结合、神经突触生长、神经元迁移、肿瘤细胞迁移等过程中有非常重要的意义。文章主要从β4GalT1的基本结构、β4GalT1与多种配体之间的相互作用介导了细胞不同的生物学功能、β4GalT1与细胞骨架蛋白的关系等几个方面综述细胞膜表面F4GalT1的研究进展。

去唾液酸糖蛋白受体配体胆固醇-半乳糖苷的酶促合成优化研究

目的在有机相中利用酶促反应合成能被去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)特异性识别的配体胆固醇-半乳糖苷分子,对其合成工艺进行优化。方法采用质谱和核磁碳谱鉴别产物结构;单因素和正交设计法优化酶促合成条件。结果酶促最佳条件为底物胆固醇癸二酸乙烯酯(CH-VS)与乳糖醇(LA)物质的量之比4∶1,脂肪酶Novozym 435 25 mg,反应32 h,产率高达92%。结论该方法高效、反应条件可行、产物专一。

半乳糖化胆固醇配体修饰去甲斑蝥素脂质体的制备及表征

以半乳糖和胆固醇氯甲酸酯为底物,通过化学反应合成半乳糖-胆固醇偶联物,并经1H NMR、13C NMR和HRMS确证了产物的结构。以此为配体,采用薄膜超声分散法制备半乳糖化胆固醇配体修饰的去甲斑蝥素脂质体,通过单因素试验和正交设计优化处方。结果所得优化工艺为:磷脂与半乳糖化胆固醇的质量比3∶1,药脂比1∶12,溶胀时间30 min。优化脂质体的包封率为(50.75±1.61)%,载药量为(7.85±2.16)%,平均粒径为(128.4±5.7)nm,平均ζ电位(-22.78±1.80)mV;与去甲斑蝥素溶液相比,优化脂质体的体外释放呈现出一定的缓释特征。

酶促合成3种半乳糖-胆固醇配体及其与肝靶向性的构效关系研究

目的酶促法构建3种不同类型的半乳糖-胆固醇配体修饰的阿霉素(doxorubicin,DOX)脂质体,研究其在小鼠体内的药动学及组织分布特征。方法利用脂肪酶在非水相中合成了3种不同结构的半乳糖-胆固醇配体:CHS-C8-Gal NAc、CHS-C8-GAL、CHS-C8-LA;利用MS、NMR鉴定产物结构;采用薄膜分散-梯度载药法制备DOX脂质体并对其理化性质进行表征;以小鼠为实验对象,采用尾iv给药,通过比较3种配体修饰的DOX脂质体在小鼠体内的药动学与组织分布特征来阐明配体中半乳糖基的结构与去唾液酸糖蛋白受体之间的构效关系。结果产物经MS、NMR鉴定均为目标产物,产率均>90%;采用薄膜分散-梯度载药法制备的DOX脂质体粒径<90 nm,PDI<0.1,包封率>99%,24 h渗漏率<5%,Zeta电位接近于0;3种配体分子对肝脏亲和力大小依次为CHS-C8-Gal NAc>CHS-C8-LA>CHS-C8-Gal;肝脏对CHS-C8-Gal NAc修饰的脂质体的摄取几乎完全被预注射的asialofetuin所抑制(P<0.01),而对CHS-C8-Gal及CHS-C8-LA修饰的脂质体无显著的抑制效果(P>0.05)。结论含有N-乙酰半乳糖胺基(N-acetylgalactosamine,Gal NAc)为末端的配体分子能被去唾液酸糖蛋白受体高效识别,而含有D-半乳糖基(D-galactose,Gal)或乳糖醇基(lactitol,LA)为末端的配体分子易被肝枯否细胞上的半乳糖粒子受体所竞争性结合。

番茄红素肝靶向脂质体制备工艺研究及肝靶向性评价

番茄红素是一种天然功能性类胡萝卜素,因化学稳定性及水溶性较差降低了生物利用率,将其制备成靶向脂质体可改善其水溶性并扩大其应用范围。实验采用探头式超声-逆向蒸发法制备以硬脂醇半乳糖苷为配体修饰的番茄红素肝靶向脂质体,单因素及响应面法优化后最佳工艺为大豆卵磷脂与胆固醇比7∶1、配体与固体脂质比1∶40、药脂比1∶48、旋蒸时间35 min、旋蒸温度51℃,在此条件下制备的脂质体包封率为(91.13±0.20)%,载药量为(2.39±0.37)%,粒径为(252.63±5.87)nm,在不同光照条件、贮藏温度以及有无氧气条件下稳定性均良好。动物实验显示番茄红素肝靶向脂质体组小鼠肝脏部位番茄红素含量最高,证明了经硬脂醇半乳糖苷修饰后,番茄红素脂质体肝靶向性增强。

免疫脂质体的发展及应用

目的介绍免疫脂质体的应用及发展。方法围绕目前已经出现的免疫脂质体制剂,分析其在提高疗效及靶向性,降低毒副作用等方面的情况。结果免疫脂质体可以提高药物的靶向性,并降低药物对其他组织器官的毒副作用。结论免疫脂质体通过主动靶向,在提高疗效及靶向性、降低毒副作用等方面具有广阔的发展前景。