茶树胆碱单加氧酶CsCMO的克隆及甜菜碱合成关键基因的表达分析

【目的】从茶树中克隆甜菜碱(GB)合成途径中的关键酶——胆碱单加氧酶CsCMO,研究不同逆境胁迫和不同抗寒茶树品种间GB合成中关键基因的表达模式,并分析茶树体内GB的含量,为茶树抗性育种奠定基础。【方法】采用反转录PCR结合RACE技术,从茶树中克隆CsCMO的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析,结合前期克隆得到的茶树甜菜碱醛脱氢酶CsBADH,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析这2个基因的表达模式,紫外分光光度计测定GB含量。【结果】克隆得到茶树CsCMO(GenBank登录号:JX050146)的cDNA全长1 558 bp,包含1 305 bp的完整开放阅读框(ORF),编码434个氨基酸,并被定位在叶绿体上。氨基酸序列分析表明,CsCMO含有CMO中保守的Rieske型2Fe-2S结构域和单分子非血红素Fe结合位点,与其它植物CMO序列相似性在50%以上;进化树分析显示,它与枸杞的关系最近。qRT-PCR分析表明,4℃低温、NaCl盐和ABA处理均能诱导CsCMO和CsBADH表达,96 h内随着处理时间的增加,表达量呈增加趋势,但2个基因的表达模式有差异,盐胁迫诱导基因表达更显著;在不同抗寒品种中,2个基因的表达在抗性强的品种中表达量总体要高于抗性弱的品种,且CsBADH的变化比CsCMO的显著。3种胁迫处理48 h后,叶片中的GB含量均增加;低温处理后抗寒性强的品种中GB含量比抗寒性弱的高。【结论】克隆了茶树CsCMO,在低温、NaCl盐以及ABA处理下,GB积累,CsBADH和CsCMO上调表达,且盐胁迫下的表达更明显,表明GB与茶树抵御这3种胁迫关系密切。

北美海蓬子胆碱单加氧酶基因CMO的克隆及表达研究

胆碱单加氧酶(CMO)是合成植物小分子非毒性有机渗透调节物质甜菜碱过程中重要的限速酶.文中采用RACE技术以北美海蓬子为实验材料克隆CMO基因的全长c DNA序列(Genbank登录号:KM884944),并做相关的生物信息学分析.研究结果表明,该基因c DNA全长1 834 bp,其中开放阅读框(ORF)有1 317 bp,编码439个氨基酸,预测其蛋白分子量为49.537 k Da,理论等电点(p I)为6.15;序列分析显示北美海蓬子CMO蛋白中含有2个重要的保守域和功能域,不存在跨膜区域;除了与蒺藜苜蓿及水稻的同源性分别为46%和49%外,与其他植物CMO蛋白序列相似性均达到55%以上;系统进化树分析显示,它与欧洲海蓬子的亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,随着Na Cl浓度的升高,北美海蓬子CMO基因的表达量增加,说明该基因可通过盐胁迫诱导表达.

香蕉A、B基因组胆碱单加氧酶基因克隆及渗透胁迫下表达特性分析

胆碱单加氧酶(CMO)是高等植物体内甜菜碱合成过程中的关键酶,在植物抵御逆境生理过程中具有重要作用。在香蕉A、B参考基因组数据库中分别鉴定到1个CMO基因,对MaCMO与MbCMO基因组序列进行生物学信息分析,发现MbCMO可能由1个香蕉O-岩藻糖基转移酶家族蛋白编码基因与MbCMO基因串联形成。克隆湛江AA(ZJ;AA基因型)、巴西蕉(BX;AAA基因型)、广东大蕉(GD;AAB基因型)和金粉(JF;ABB基因型)的CMO基因编码序列并测序比对,在ZJ和BX中鉴定到基因CMO-A,GD和JF中鉴定到基因CMO-A、CMO-B1和CMO-B2,JF中鉴定到基因CMO-H。鉴定到的4种香蕉CMO基因中,有23个共同的高频密码子,密码子CUU和CCG分别是偏性最强和最弱的密码子。CMO-A蛋白与CMO-H蛋白的氨基酸数量最少,均为425个;CMO-B1蛋白的氨基酸数量最多,为470个,且二级结构最为复杂;CMO-B2蛋白分子量最大,为52.02 kDa;CMO-A分子量最小,为47.48 kDa;4种CMO均属于酸性蛋白,均不具有跨膜结构且均为亲水性蛋白;亚细胞定位预测显示4种CMO均定位在叶绿体中。在进化方面,植物CMO在进化时单、双子叶植物有明显的分支,香蕉CMO-A、CMO-H、CMO-B1、CMO-B2蛋白与其他单子叶植物CMO蛋白亲缘关系更近。RT-qPCR结果显示:4种香蕉根中CMO在渗透胁迫前期上调表达,A基因组纯合型ZJ与BX的CMO表达量高于A、B基因组杂合型GD与JF的CMO表达量;4种香蕉叶中CMO在渗透胁迫前期下调表达,其中A基因组纯合型ZJ与BX的CMO表达量在渗透胁迫后期出现上调表达,A、B基因组杂合型GD与JF的CMO表达量高峰出现在10 d,而后15 d时表达量再次下调,并显著低于ZJ与BX的CMO表达量。本研究揭示了香蕉A、B基因组间CMO基因的差异和不同基因型香蕉中CMO基因在渗透胁迫下的表达模式,为进一步研究香蕉A、B基因组CMO基因生物学功能,特别是来源于不同基因组的CMO基因与香蕉抗渗透胁迫能力间的关系奠定基础,为利用基因工程提高香蕉抗逆性提供参考依据。

山菠菜胆碱单加氧酶基因对棉花的遗传转化和耐盐性表达

胆碱单加氧酶(CMO)是渗透保护剂甜菜碱生物合成的关键酶之一。以棉花(Gossypium hirsutium L.)泗棉3号的下胚轴切段为外植体,利用农杆菌介导法将克隆自山菠菜(Atriplex hortensis)的AhCMO基因导入其中,通过组织培养胚状体发生途径获得转基因再生植株。以0.5%卡那霉素对再生苗筛选后,PCR检测抗卡那霉素棉苗确认阳性转化株,Southern和Northern杂交结果进一步证实外源基因已导入棉花并得到表达。在温室盆栽条件下,于2片真叶期对转AhCMO基因棉花及其转化受体泗棉3号施加0.5%的NaCl胁迫,15d后发现其光合作用和植株生长被显著抑制,非转基因棉花泗棉3号的株高、鲜重和光合速率分别降低了57.6%、65.6%和69.9%,而转AhCMO基因的棉株分别降低了37.3%、54.6%和47.9%。转AhCMO棉花所受盐害程度显著小于非转基因的棉株,说明AhCMO基因的导入和表达提高了转基因棉花的耐盐性。

杜梨胆碱单加氧酶基因克隆及胁迫表达

为了解梨砧木—杜梨对非生物胁迫的防御机制,采用RT-PCR、RACE和长片段PCR技术从杜梨幼苗中获得1个甜菜碱合成相关的胆碱单加氧酶基因(PbCMO),运用生物信息学方法分析序列特点,并通过跨内含子引物进行半定量RT-PCR研究其在非生物胁迫下的表达情况。结果表明:(1)PbCMO基因cDNA序列编码区长1 227bp,编码由408个氨基酸组成的多肽。其对应基因组DNA序列长2 928bp,由10个外显子和9个内含子组成。其推导的多肽预测的等电点为6.19,相对分子质量为46.27kD,具备Rieske型铁硫[2Fe-2S]簇结合区域和非血红素单核态铁配位点序列,与枸杞CMO蛋白相似性最高(71%)。(2)PbCMO在幼苗根和叶中均为诱导型表达,100mmol/L氯化钠、10%(W/V)聚乙二醇、180mmol/L甘露醇或20μmol/L脱落酸处理后其表达量明显上调,表明PbCMO对盐碱、干旱、渗透胁迫和ABA均存在表达响应,可能参与杜梨应对非生物胁迫的转录调节。

水稻胆碱单加氧酶基因的克隆与表达分析(英文)

高等植物中甜菜碱由胆碱经两步氧化反应合成，其中由胆碱单加氧酶（CMO）催化第一步氧化反应，甜菜碱醛脱氢酶（BADH）催化第二步氧化反应。采用生物信息学技术和RT-PCR的方法从水稻幼苗组织中分离得到了水稻CMO基因的eDNA克隆，将其命名为OsCMO。该基因含有10个外显子和9个内含子，其开放阅读框编码一条长为410个氨基酸残基的多肽，与拟南芥、山菠菜、苋、碱蓬和甜菜等植物的胆碱单加氧酶的氨基酸序列的一致性50％-62％。mRNA分析表明OsCMO基因在水稻幼苗组织中的表达受高盐、低温和干旱等胁迫的上调诱导表达，表明该基因可能在抵御非生物胁迫中发挥重要作用。

菠菜胆碱单加氧酶基因cDNA的克隆及重组植物表达载体的构建

从菠菜叶片中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增到菠菜胆碱单加氧酶(CMO)基因cDNA,然后将CMO cDNA克隆至pBluescript SK+载体上,序列分析结果表明,该CMO cDNA全长为1 424 bp,开放阅读框1 320 bp,编码440个氨基酸。核酸序列同源性分析表明,该cDNA与已发表的菠菜CMO基因具有99.8%同源性,氨基酸序列同源性达99.6%。在此基础上以pBI121和pBIrd为基础,构建了组成型启动子CaMV 35S和逆境诱导表达启动子rd29A驱动的CMO基因的植物表达载体。

一步PCR法快速扩增辽宁碱蓬胆碱单加氧酶cDNA3′末端序列

根据已获得的辽宁碱蓬 (SuaedaliaotungensisKitag)胆碱单加氧酶cDNA的部分序列 ,设计一条基因特异性引物 ,与通用引物并用 ,一步PCR成功地克隆了辽宁碱蓬胆碱单加氧酶cDNA 3′末端。与常规的3′_RACE法相比 ,一步PCR法具有快速、简便、经济等优点 ,是一种非常快捷的扩增cDNA

青稞胆碱单加氧酶基因cDNA全长开放阅读框克隆及序列分析

甜菜碱是一种存在于多种生物体内的季胺类高效渗透调节剂,是由甜菜碱合成酶系催化的。为了研究甜菜碱合成酶系基因的表达和青稞高抗逆性之间的关系,我们以经200mmol/L NaCl预处理72h的青稞幼苗叶片及根中提取的总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增得到全长1224bp,推测编码407个氨基酸残基的青稞胆碱单加氧酶(choline monooxygenase,cmo)基因cDNA全长开放阅读框(open reading frame,ORF),将其命名为hvcmo1并在GenBank中注册,获得登录号为GU810840。生物信息学分析表明,推定的氨基酸序列中含有与已报道高等植物胆碱单加氧酶氨基酸序列中的Rieske型铁硫簇结合区和单核铁结合基序等特征性结构域具有高度保守性的特征性结构域。与多种高等植物cmo基因进行序列同源性比对分析结果显示:hvcmo1的核苷酸序列与甜菜、盐角草、菠菜、辽宁碱蓬、拟南芥、玉米、水稻、高粱、羊草和大麦等植物的cmo mRNA编码区相似性分别为55.3%、55.4%、55.6%、5.9%、61.3%、82.6%、83.3%、83.4%、95.5%和99.5%。实验过程中,我们发现,青稞hvcmo1基因的表达必须被一定浓度的NaCl所诱导,说明hvcmo1可能在调节环境胁迫下青稞细胞内甘氨酸甜菜碱合成方面起着关键的作用,同时它可以作为研究环境胁迫下甘氨酸甜菜碱合成调节的模型。本结果为研究青稞甘氨酸甜菜碱合成酶系基因的诱导表达及其与青稞强抗逆性之间的关系奠定了基础。

RLM-RACE法快速克隆盐角草胆碱单加氧酶cDN A5′末端全序列

采用RLM-RACE法,根据已获得的盐角草胆碱单加氧酶基因的部分序列,设计2条特异性嵌套PCR引物,成功地克隆了该基因cDNA 5′末端全序列,测序结果显示该片段包括5′UTR 154个核苷酸和编码区606个核苷酸,编码N端202个氨基酸.Blast P结果表明,该片段编码的蛋白序列与辽宁碱篷及其他藜科植物的胆碱单加氧酶同源性达到85%以上.同时找出了其转录起始位点,即为该序列的第1个碱基g.

菠菜胆碱单氧化酶(CMO)基因的克隆及在大肠杆菌中的诱导表达

甘氨酸甜菜碱是一种非毒性的渗透调节物质 ,在植物体内是以胆碱为底物 ,经两步氧化而合成的 .菠菜中 ,催化第一步反应的酶为胆碱单氧化酶 (CholineMonooxygenase ,CMO) .为了研究胆碱单氧化酶基因的功能以及转基因植物的抗逆能力 ,在 30 0mmol L高盐浓度 (n(NaCl)∶n(CaCl2 ) =5 7∶1)的条件下 ,作者分离纯化了菠菜mRNA ,经RT PCR得到全长 (1.3kb)胆碱单氧化酶 (CMO)cDNA ,与已经报道的基因序列相比较 ,同源性为 99% .根据其核苷酸序列推导得到了氨基酸序列 .将PCR纯化产物与pET 30a+ 连接 ,构建了重组表达载体pETCMO ,并转化到大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导获得高效表达 .

梭梭CMO基因的克隆与植物表达载体的构建

采用RT-PCR、RACE等方法从超旱生耐盐植物梭梭（Haloxylon ammodendron）中扩增出甜菜碱合成过程中的限速酶胆碱单加氧酶（CMO）编码基因的cDNA序列（命名为HaCMO）,其开放阅读框为1 344 bp,推测的氨基酸序列全长为447个氨基酸残基.根据已获得的开放阅读框,构建重组植物表达载体pCAMBIA2300-HaCMO.HaCMO核苷酸序列与藜科几种盐生植物如菠菜（Spinacia oleracea）、山菠菜（Atriplex hortensis）、辽宁碱蓬（Suaeda liaotungensis）、盐角草（Salicornia europaea）和甜菜（Beta vulgaris）等的一致性均在74.5%以上,推导编码蛋白的氨基酸序列一致性均在73.5%以上,表明CMO编码基因在藜科植物中是一种比较保守的基因.研究结果为进一步从分子水平探明梭梭的抗旱、耐盐机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定了基础.

甘菊CMO同源基因的分离与表达分析

利用半嵌套巢式PCR结合RACE技术从菊科植物甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium(Fisch.ex Trautv.)Makino]中分离得到了一个长度为1 450 bp的片段。序列分析结果表明,其开放阅读框全长1 140 bp,编码379个氨基酸残基;在GenBank比对并进行系统进化分析可知,该片段为CMO同源基因,命名为ClCMO。利用不同胁迫处理进行分析发现,在非胁迫条件下ClCMO基因在甘菊茎、叶、花叶中均有表达信号,在根中没有表达;其可以响应干旱、高盐胁迫和脱落酸(ABA)的诱导,不响应冷热胁迫,并且其表达在水杨酸(SA)诱导下受抑制。这些结果表明,ClCMO基因是提高植物耐干旱、高盐能力的有效基因资源。

翅碱蓬CMO cDNA基因克隆、测序及重组植物表达载体的构建

从翅碱蓬叶片中提取总RNA,根据相关同源序列设计引物,使用反转录试剂盒进行RT- PCR,扩增得到翅碱蓬胆碱单加氧酶(CMO)cDNA,进行PCR产物测序;然后将CMO cDNA T-A克隆至pMD18-T-simple载体上,经测序正确后亚克隆至pBI121植物表达载体,进行酶切及克隆测序鉴定。

转AhCMO基因玉米后代的获得及耐盐性鉴定

试验采用超声波辅助花粉介导法将山菠菜胆碱单加氧酶似hCMO）基因转入玉米自交系‘郑58’中，经抗生素筛选、PCR检测及白花授粉获得转CMO基因的T2代玉米种子。选取5份T2代玉米种子盆栽进行耐盐性鉴定试验。首先针对其非转基因受体材料筛选出耐盐性鉴定浓度，其后通过生理生化指标对转基因T3代株系进行耐盐性鉴定，同时筛选耐盐性强的株系。结果表明：耐盐性筛选及鉴定的适宜浓度为250mmol／L；依据对苗期生理生化指标的测定分析，在250mmol／LNaCl胁迫下，转基因玉米植株的超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性及叶绿素含量高于非转基因玉米，丙二醛（MDA）含量低于非转基因玉米。SOD活性提高了2％-208％；POD活性提高了22％～65％；叶绿素含量增加了8％～61％；MDA含量减少了3％～93％。试验表明，耐盐基因CMO的转化提高了玉米的耐盐性。依据生理生化指标变化情况建立的耐盐性级别评价方法显示，5份参试株系中耐盐性比对照提高3级的有2份。

辽宁碱蓬SlCMO基因盐胁迫表达分析及盐诱导启动子鉴定

胆碱单加氧酶(choline monooxygenase,CMO)是合成甜菜碱的关键酶,甜菜碱在植物抵抗渗透胁迫中起着重要的作用。本研究室前期克隆了盐生植物辽宁碱蓬CMO(Suaeda liaotungensis CMO)基因及启动子。本研究对Sl CMO基因在盐胁迫下的表达及盐诱导启动子进行分析。q RTPCR分析Sl CMO基因在辽宁碱蓬不同器官及盐胁迫下的表达,结果表明,Sl CMO基因在根、茎、叶中均有表达,其中茎、叶中的表达量较高,Sl CMO基因在根、茎、叶中的表达均受盐胁迫诱导。5'端缺失分析Sl CMO启动子的盐诱导区段,结果表明,p C5(-267^+128 bp)是Sl CMO启动子的盐诱导功能区段,推测p C5调控Sl CMO基因的盐诱导表达。本研究为Sl CMO基因表达调控研究奠定基础,也为植物抗盐基因工程提供可用的启动子。

根癌农杆菌介导的CMO基因转化马铃薯的研究

通过根癌农杆菌介导法将强组成型表达启动子CaMV 35S和逆境诱导表达启动子rd29A驱动的菠菜胆碱单加氧酶(CMO)基因导入马铃薯栽培品种夏波蒂(Shepody)和费乌瑞它(Favorita)中,获得了抗卡那霉素再生植株,对转化植株进行PCR检测初步表明CMO基因已整合到转基因马铃薯基因组中。并对光照强度对马铃薯试管薯遗传转化的影响进行了研究,结果表明在诱导芽分化的过程中,2 000 lx的光照强度有利于试管薯薄片直接再生出抗性芽。

甜菜BvM14-CMO、BvM14-BADH基因的克隆、盐胁迫表达及生物信息学分析

以耐盐甜菜(Beta vulgaris)M14品系为试验材料,利用RT-PCR克隆获得甜菜M14品系甜菜碱合成相关基因胆碱单加氧酶基因BvM14-CMO和甜菜碱醛脱氢酶基因BvM14-BADH的cDNA全长。荧光定量PCR测试结果表明,200和400 mmol·L^(-1)NaCl盐胁迫下BvM14-CMO及BvM14-BADH在甜菜M14品系的叶和根中均显著上调表达。通过蛋白质互作数据库预测,得到了拟南芥CMO和BADH蛋白的互作蛋白。采用甜菜M14品系盐胁迫转录组数据库,对甜菜M14品系中CMO和BADH互作蛋白的同源基因进行盐胁迫表达聚类分析,发现甜菜M14品系中大部分预测获得的CMO和BADH互作蛋白基因与BvM14-CMO和BvM14-BADH基因在盐胁迫下的表达变化趋势一致,这些研究结果为进一步深入研究BvM14-CMO和BvM14-BADH基因的功能奠定了理论基础。

双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化

【目的】构建双元植物表达载体,通过遗传转化提高植物的抗逆能力。【方法】将从超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中克隆得到的HaBADH基因,定向导入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中,以HaCMO替换pCAMBIA2300-HaBADH中的抗性基因NPTⅡ,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并通过农杆菌介导法将其转入粳稻品种"优引三号",对所获得的转基因植株进行PCR检验。【结果】成功构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并获得了携带有pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的水稻阳性植株5株,经PCR检测,转入成功。【结论】将梭梭抗逆基因HaBADH和HaCMO构建到一个表达载体中,并成功转化水稻,为转入基因后水稻植株内甜菜碱合成和积累过程的深入分析提供了条件。

欧美杨107耐盐转基因植株的试验

以欧美杨107(Populus×euram ericanacv.“74/76”)叶片为试材,采用根癌农杆菌介导法进行了胆碱单加氧酶(CMO)基因转化,获得了耐盐转基因植株。试验结果表明,15 mg.L-1卡那霉素(Km)可作为筛选转化细胞的选择压;在农杆菌工程菌液中添加200μmol.L-1的乙酰丁香酮(As)可以显著提高抗性芽诱导率;PCR及Southern检测证明CMO基因已整合进抗性植株基因组;组织培养条件下的植株耐盐性测定及离体叶片电导率测定结果证明,转基因植株的耐盐性得到了提高。