应用PCR技术鉴定绵羊胎儿成纤维细胞系性别

根据牛、羊Y-染色体性别决定区域(SRY)的同源性设计了一对PCR引物,对8个绵羊胎儿成纤维细胞系SFF1-8进行了性别鉴定。阳性对照和细胞系SFF1、2、6、7扩增得到130bp片段,阴性对照、空白对照及细胞系SFF3、4、5、8没有扩增带。通过序列测定和同源性分析,证明PCR产物为SRY基因片段,说明有130bp扩增带的细胞系为雄性;无扩增带的为雌性。结果表明,该法具有简单、快速、准确的特点,可应用于转基因克隆动物研究中对体细胞系的早期性别鉴定。

转TLR4基因的绵羊胎儿成纤维细胞系的建立

为了通过脂质体介导的方法获得高效表达目的基因TLR4的绵羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞,以便在胚胎移植前的体外筛选过程中确定优越的转基因供体细胞,从而提高体细胞核移植生产抗病转基因绵羊的效率。本研究通过优化脂质体与质粒载体的比例浓度,进而再去转染原代培养的绵羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选,以EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)作为报告基因,从形态学与分子水平鉴定出已经稳定表达目的基因:Toll样受体4(Toll Like Receptor4,TLR4)基因的细胞系。最终经过筛选与纯化得到3个表达目的基因TLR4的细胞克隆,经RT-PCR与相对荧光定量PCR分析,在第二代转染的细胞中TLR4的表达最高,相对于未转染的绵羊胎儿成纤维细胞升高了9.65倍(P<0.01),并藉此为最终制备抗病转基因羊新品种,从提供稳定表达TLR4基因的转基因供体细胞系角度奠定基础。

兔转基因单细胞克隆株的分离培养及其染色体倍性分析

为检测原代二倍体细胞转基因后单细胞克隆的增殖能力及其染色体倍性稳定性 ,用脂质体介导的转染方法将质粒DNApEGFP -C1(带有报告基因GFP和Neor)导入体外培养的兔胎儿成纤维细胞中 ,经G4 18药物筛选后 ,分离出 73个GFP阳性细胞克隆 ,最后存活 13个 (18% ) ,对其中 9个克隆的染色体倍性进行分析 ,结果只有 2个 (2 2 % )克隆的染色体倍性正常率在 75 %以上 ,分别为 80 %和 75 % ,其余 7个克隆的染色体倍性正常率均在 70 %以下。这表明 ,当使用转基因单细胞克隆株作为供核细胞生产克隆动物时 ,单细胞克隆的增殖代数和染色体倍性的稳定性需要进一步研究提高。