硅芯片纳米微流体技术与磁激活细胞分选法对胎儿有核红细胞富集效果的比较

目的分析硅芯片纳米微流体技术与磁激活细胞分选法对胎儿有核红细胞(FNRBC)的富集效果。方法选取2020年1月—2022年12月拟于医院产科门诊进行产前筛查的112例孕妇为研究对象,所有孕妇均采集外周肘静脉血10 mL,分别通过硅芯片纳米微流体技术与磁激活细胞分选法对血液样本中FNRBC进行富集。比较两种方案富集前后细胞形态及细胞计数情况,记录两组方案对FNRBC的富集时间及富集所得FNRBC的无菌试验结果。结果硅芯片纳米微流体技术对FNRBC的富集时间长于磁激活细胞分选法(P<0.05);两种方案的无菌试验阳性发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05);与磁激活细胞分选法相比,硅芯片纳米微流体技术进行FNRBC富集时所得的总细胞量较少,FNRBC量较多,FNRBC比例较高(P<0.05)。结论硅芯片纳米微流体技术与磁激活细胞分选法进行FNRBC富集所得样本受污染风险均较低,与磁激活细胞分选法相比,硅芯片纳米微流体技术去除混杂细胞的能力较强,且获得的FNRBC数量较多,对FNRBC的富集效果较好,但所需时间较长。

人工智能辅助外周血有核红细胞形态学分类

目的评估人工智能(AI)血细胞形态分析仪(AI阅片机)对外周血有核红细胞(NRBC)检测的性能。方法收集1191例静脉血标本(全自动血细胞分析仪报警提示有核红细胞),将静脉血分为3个组(NRBC绝对值低、中、高值),用AI阅片机检测NRBC%,将预分类结果与形态学专家审核后结果进行统计学分析。②收集494例静脉血标本(NRBC绝对值≥1×10^(9)/L),用AI阅片机进行外周血细胞形态学分类,由形态学专家对结果进行校正,制作血细胞分类混淆矩阵,分析AI阅片机对外周血细胞分类的符合度和检出率。结果AI阅片机对NRBC%检测结果与专家审核后结果差异无统计学意义(P<0.005),R^(2)>0.99;AI阅片机共检测出99137个NRBC,识别正确99031个,专家校正结果为99976个。AI阅片机对NRBC检出的符合率为99.89%,检出率为99.05%。结论AI阅片机对外周血中NRBC的检测结果与专家审核后结果的符合率和检出率均较高,为NRBC相关疾病的筛查提供了高效的辅助检测手段。

基于免疫磁珠法的不同筛选方案对胎儿有核红细胞富集效果的比较

目的:将密度梯度离心(density gradient centrifugation,DGC)与免疫磁珠法(magnetic-activated cell sorting,MACS)相结合,应用4种不同的筛选方案,对脐血中的胎儿有核红细胞(fetal nucleated red blood cells,FNRBC)进行分离,评估不同策略富集FNRBC的效果。方法:对10例脐血标本(12 mL/例)按4种不同方案进行筛选:DGC;DGC+MACS阴性筛选(CD45^(-));DGC+MACS阳性筛选(CD71^(+));DGC+MACS阴性/阳性筛选(CD45^(-)/CD71^(+))。通过细胞计数板计数,K-B染色后显微镜下人工FNRBC计数,从获得总细胞量、FNRBC量和FNRBC比例经t检验后评估不同方案富集FNRBC的效果。结果:(1)与其他3组相比,DGC方案可获得的总细胞量(0.95×10^(7)/mL)最多,FNRBC数量(39.87/mL)最多,FNRBC比例最低(0.004‰),差异均具有统计学意义(均P=0.000);(2)与其他3组相比,DGC+MACS阴性/阳性筛选(CD45^(-)/CD71^(+))组合法所获得的总细胞量最少(0.81×10^(6)/mL),获得FNRBC数量也最少(7.47/mL),差异均具有统计学意义(均P=0.000);(3)DGC+MACS单种抗体筛选方案中,DGC+MACS阳性筛选(CD71^(+))所获得总细胞量为1.99×10^(6)/mL,较DGC+MACS阴性筛选(CD45^(-))(2.56×10^(6)/mL)低,差异有统计学意义(P=0.000),而两方案所得FNRBC数量之间差异无统计学意义(P=0.910);(4)DGC+MACS阴性筛选(CD45^(-)),DGC+MACS阳性筛选(CD71^(+)),DGC+MACS阴性/阳性筛选(CD45^(-)/CD71^(+))所得FNRBC比例之间差异无统计学意义(P=0.030、0.050、0.210)。结论:DGC方案获得FNRBC数量最多;DGC+MACS阴性/阳性筛选(CD45^(-)/CD71^(+))方案去除混杂细胞能力最强。在不降低获取目标细胞数量基础上,DGC+MACS阳性筛选(CD71^(+))方案富集FNRBC效果最好。

孕妇外周血胎儿有核红细胞计数变化及其在不良妊娠结局预测中的应用

目的观察孕妇外周血胎儿有核红细胞计数的变化,探讨其在妊娠不良结局预测中的应用价值。方法收集87例孕12～18周孕妇的外周血,密度梯度离心法分离单个核细胞,采用PE-GPA/FITC-CD71单克隆抗体双色标记胎儿有核红细胞后进行流式细胞分析,追踪妊娠结局并进行分析。结果妊娠结局正常者外周血中胎儿有核红细胞百分比为0.89%±0.81%,妊娠结局不良者为3.25%±2.98%,两者相比,P〈0.05。以胎儿有核红细胞百分比〉3.79%作为截断值,预测妊娠不良结局的敏感度为76.9%、特异度为64.3%。结论与妊娠结局正常的孕妇相比,妊娠结局不良孕妇孕12～18周时外周血胎儿有核红细胞增多;对孕12～18周孕妇外周血胎儿有核红细胞进行计数有助于不良妊娠结局的预测,其敏感度及特异度均较高。

运用流式细胞技术分析孕妇外周血中胎儿有核红细胞的比例与孕周的关系

目的 :探讨母亲外周血中胎儿有核红细胞 (NRBCs)的比例与孕周的关系。方法 :对 6 1名孕龄为 11～ 34周、年龄为 2 1～ 35岁的妇女的外周血中的胎儿细胞进行分离纯化 ,采用荧光激活细胞分离技术 (FACS)分选表达转铁蛋白受体的阳性细胞 (CD71+细胞 )。将孕妇组、未孕组及新生儿脐血组进行对照。结果 :孕 11～ 34周的孕妇外周血中 CD71+细胞的比例为 (0 .35± 0 .2 5 )× 10 - 2 ,与未孕组及新生儿脐血组均有极显著性差异。CD71+细胞在外周血中的比例在孕 17～18周达峰值 ,分别为 (0 .6 4± 0 .2 5 )× 10 - 2和 (0 .5 4± 0 .35 )× 10 - 2。结论 :早、中、晚期孕妇外周血中存在胎儿有核红细胞。利用母血循环中的胎儿细胞进行产前诊断的最佳时间应在妊娠 17～

孕妇外周血中胎儿有核红细胞数量与胎儿窘迫的关系

目的:探讨孕妇外周血中胎儿有核红细胞(nucleatedredbloodcells,NRBC)数与胎儿窘迫的关系。方法:对54名孕龄32～42周,年龄19～35岁(包括19名急性胎儿窘迫,15名慢性胎儿窘迫)的孕妇外周血进行不连续密度梯度离心,对分离后的细胞进行制片、染色,显微镜下进行NRBC计数,比较组间差异。结果:15名慢性胎儿窘迫孕妇外周血中NRBC数目为(23.26±6.75)个/7mL;同孕龄正常妊娠妇女外周血中NRBC数目为(9.43±4.01)个/7mL,两者间差异有显著性(P<0.05)。19名急性胎儿窘迫孕妇外周血中NRBC数目为(10.87±4.29)个/7mL,与正常妊娠间差异无显著性(P>0.05)。结论:慢性胎儿窘迫孕妇外周血中NRBC数目明显升高,为胎儿窘迫的临床预测和评估提供了一条新思路。

基于纳米技术从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞并进行无创性产前诊断的可行性

目的建立一种基于纳米技术从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞并进行无创性产前诊断的方法。方法 Percoll 1.077单密度梯度离心法之后,选用抗体CD147修饰到以玻璃为载体的纳米羟基磷灰石基底上,对新生儿脐血中的胎儿有核红细胞进行捕获,利用胎儿特异性抗体HbF、红细胞表面特异性抗体CD71以及细胞核染色剂DAPI对捕获到的新生儿脐血中有核红细胞进行染色标记,进而实现分选。对正常不同孕周孕妇外周血、未孕健康妇女外周血及新生儿脐血中抗体CD147捕获到的有核红细胞进行染色标记分选。抽取10例行常规产检时发现高危因素的孕妇外周血2 m L,用抗体CD147捕获胎儿有核红细胞并用X、Y、18、21染色体探针进行荧光原位杂交。结果用HbF+CD71双标记染色法的胎儿有核红细胞阳性率与HbF单染和CD71单染标记的细胞阳性率相比差异有统计学意义(P<0.05);HbF单染和CD71单染标记的阳性细胞率之间相比差异无统计学意义(P>0.05);在孕16~20周时孕妇外周血中阳性细胞数目达到顶峰,之后随孕周增加而呈下降趋势。10例高危孕妇外周血标本均成功分离出胎儿有核红细胞,并经过FISH鉴定,本方法对男性胎儿诊断的灵敏度为85.71%,特异度为100.00%,对女性胎儿诊断的灵敏度为100.00%,特异度为85.71%,同时诊断出1例非整倍染色体胎儿,所有结果均经后期随访证实。结论用纳米材料为基底,抗体CD147捕获,HbF+CD71双染色标记法对孕妇外周血中的胎儿有核红细胞进行识别和富集,可提高胎儿有核红细胞的检出率,可为进一步产前诊断奠定基础,最佳时机应该在孕16~20周。

孕妇外周血分离胎儿有核红细胞与FISH分析技术在无创性产前诊断中的应用

目的:应用流式细胞仪从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞(NRBCs),通过荧光原位杂交(FISH)分析进行无创性产前诊断。方法:对15例妊娠11～24周的高危孕妇外周血按常规密度梯度方法分离单个核细胞,选用红细胞特异性抗体CD71、HbF结合流式细胞术(FACS)分选富集NRBCs,并进行FISH分析。结果:所有标本均分选出NRBCs,分选率为100%,CD71和HbF双阳性细胞含量为(3.43±1.62)×10-2。经FISH成功分析13例,未发现异常结果。结论:从孕妇外周血中分离富集得到的胎儿有核红细胞,通过FISH分析检测胎儿特定的染色体,可进行无创性产前诊断遗传性疾病。

孕妇外周血中胎儿有核红细胞的富集及鉴定

目的：建立富集分离孕妇外周血胎儿有核红细胞的方法，并证实其为胎儿来源。方法：以血型糖蛋白Ａ（ＧＰＡ）为识别标志，对５例孕１２～４０周的孕妇外周血进行密度梯度离心富集胎儿有核红细胞，并经流式细胞分析及ＰＣＲ技术扩增Ｙ特异性序列以鉴定富集效果。结果：５例孕妇外周血富集后流式细胞分析结果，ＧＰＡ＋细胞含量平均为上层２３８％，下层１８１８％，富集后下层ＧＰＡ＋细胞含量是上层的７６倍；ＰＣＲ扩增结果，２例阳性，３例阴性，所得结果与实际性别吻合。结论：胎儿有核红细胞的富集及鉴定为无损伤性产前诊断的临床应用开辟了诱人前景。

联合干预离子通道提高PVDF膜富集胎儿有核红细胞的效率

目的通过干预细胞膜阴离子通道(AE)和Na+/K+/2Cl-离子共转运体(NKCC),提高聚偏二氟乙烯(PVDF)膜富集脐血有核红细胞(NRBC)的效率。方法以密度为1.067的分离液分离NRBC,用AE抑制剂维拉帕米(verapamil)和NKCC抑制剂呋噻米(furosemide)联合干预,用流式细胞技术和巢式PCR观察干预前后离心法和过5μm孔径PVDF膜法富集NRBC的效率。结果最佳离心分离密度梯度为1.067。流式细胞仪检测离心分离的NRBC平均纯度为2.54%,干预后离心分离NRBC纯度为9.36%,NRBC富集率提升近3.7倍;过PVDF膜前NRBC为0.83%,过膜后NRBC为6.15%,干预后过膜将NRBC富集率提升了7.4倍。用巢式PCR检测,每ml血样中NRBC为120个时,干预后过膜的扩增条带的密度值由4.48升高至17.78,提升近4倍。结论维拉帕米和呋噻米能够通过改变脐血细胞性状,提高NRBC通过PVDF膜的效率。

运用流式细胞术分析孕妇外周血中胎儿有核红细胞的比例与孕周的关系

目的 :探讨母亲外周血中胎儿有核红细胞 (NRBCs)的比例与孕周的关系。方法 :分离纯化孕 11～ 34周、2 1～ 35岁的 6 1例孕妇外周血中的胎儿细胞 ,采用荧光激活细胞分离技术 (FACS)分选表达转铁蛋白受体的阳性细胞 (CD71+ 细胞 )。将孕妇组、未孕组及新生儿脐血组进行对照。结果 :孕 11～ 34周孕妇外周血中CD71+ 细胞的比例为 (0 .35± 0 .2 5 )× 10 -2 ,与未孕组及新生儿脐血组差异均有高度显著性 (P <0 .0 1)。CD71+ 细胞在外周血中的比例在孕 17、18周达峰值 ,分别为 (0 .6 4± 0 .2 5 )× 10 -2 和 (0 .5 4± 0 .35 )×10 -2 。结论 :早、中、晚期孕妇外周血中存在胎儿有核红细胞。利用母血循环中的胎儿细胞进行产前诊断的最佳时间应在妊娠 17～

孕妇外周血胎儿有核红细胞富集的孕周选择

目的 利用抗转铁蛋白受体（CD71）抗体和抗白细胞共同抗原（CD45）抗体双标法，检测不同孕周孕妇外周血中有核红细胞的比例，以期选择最佳孕周进行胎儿有核红细胞富集。方法 采用抗-CD71抗体和抗-CD45抗体双标法，应用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测81例不同孕周孕妇外周血中有核红细胞的比例，并与未孕组和脐血组进行对照。结果 孕7～34周孕妇外周血中CD71^＋／CD45^dim细胞的比例为（0．107土0．063）×10^-2，与未孕组和脐血组相比差异均有统计学意义；CD71^＋／CD45^dim细胞在外周血中的比例在孕17～18周达峰值，为（0．144土0．096）×10^-2。结论 不同孕周孕妇外周血有核红细胞比例不同，孕17～18周比例最高。利用母血循环中的胎儿有核红细胞进行产前诊断，其最佳时间可选择在妊娠17～18周。

孕妇外周血胎儿有核红细胞数与胎儿及胎盘异常关系

目的探讨在胎盘和胎儿发生病理性变化时，母血中胎儿有核红细胞（FNRBC）数量的变化，为母血中FNRBC计数在无创性产前诊断中的应用提供理论基础和实验依据。方法对110例8～40孕周的妇女（60例正常妊娠，30例病理妊娠，20例胎儿异常）外周血进行单密度梯度离心，瑞氏染色和细胞计数，分析母血中FNRBC数量在病理妊娠和胎儿异常时的变化及其与孕周的关系。对有胎儿异常可能的病例，孕早期（8～12周）自然流产者行绒毛细胞核型分析，孕中期（13～24周）及晚期（25周以上）取流产儿和新生儿血进行染色体分析。结果正常妊娠时，母血中FNRBC平均数量为（10．20±8．11）×10^3／L，病理妊娠和胎儿异常时母血中FNRBC平均数量为（23．09±12．42）×10^3／L和（38．93±14．87）×10^3／L，病理妊娠组和胎儿异常组与正常妊娠组相比差异有显著性（F=25．927，q=4．236、10．674，P〈0．01）。正常妊娠组和病理妊娠组母血中FNRBC数量与孕周呈正相关（r=0．491、0．500，P〈0．05）。而异常胎儿组母血中FNRBC数量与孕周无相关性（r=0．283，P〉0．05）。结论在胎儿和胎盘发生病理性改变时，母血中FNRBC数量较正常妊娠增加，同时母血中FNRBC数量随孕周增加而增加，母血中FNRBC计数对产前预测病理妊娠和胎儿异常的发生有辅助意义。

胎儿有核红细胞在产前诊断中的应用

根据国外近5年对妊娠妇女外周血中胎儿有核红细胞应用于产前诊断的研究进展,总结胎儿有核红细胞的特点;简述胎儿有核红细胞在妊娠妇女外周血中出现规律及其富集分离方法;重点介绍采用聚合酶链反应和荧光原位杂交技术分析胎儿有核红细胞,以此对胎儿性别、血型及其可能存在的各种疾病,如21三体、13三体、18三体、地中海贫血、杜氏肌营养不良及巨细胞感染等进行诊断,同时可以对病理性妊娠提前筛查;为优生优育和妊娠期健康提供保障。

母血中胎儿有核红细胞的荧光原位杂交法在产前诊断中的可行性探讨

探讨荧光原位杂交法 (FISH)对母血中胎儿有核红细胞 (NRBC)进行无创性产前诊断的可行性。 2 0例孕龄 15～ 2 0周的孕妇外周血经不连续密度梯度离心、制片、显微镜下识别并计数 NRBC及定位 ,然后行 Y染色体的 FISH检测。结果发现 10例孕男性胎儿的孕妇外周血细胞涂片中每例均有阳性杂交信号出现 ;阳性率为 6 0 % (2 4 / 4 0 )。 10例孕女性胎儿的孕妇外周血细胞涂片中 1例出现阳性杂交信号 ;阴性率为 95 % (38/ 4 0 ) ,假阳性率仅为 5 % (2 / 4 0 )。结果提示

半乳糖特异性植物血凝素富集胎儿有核红细胞

目的建立半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的方法和反应装置，为胎儿有核红细胞用于产前诊断提供基础。方法选用38～40孕周正常分娩胎儿脐血，经半乳糖特异性植物血凝素反应体系分离和富集胎儿有核红细胞，半乳糖浓度为50、100、100、150、200μg／mL、大豆凝集素浓度为10、20、30、40、50μg／mL。特异性荧光抗体染色后用激光共聚焦显微镜观察并计数分离和富集到的胎儿有核红细胞。结果半乳糖特异性植物血凝素反应体系能够有效分离和富集胎儿有核红细胞，当包被玻片的半乳糖浓度为100μg／mL、大豆凝集素浓度为20μg／mL时，与有核细胞的比率最高为（6．54±0．56）％。结论半乳糖特异性植物凝素可用于选择性地分离和富集胎儿有核红细胞。

干预离子通道联合密度梯度离心富集胎儿有核红细胞

目的探讨干预膜表面K-Cl同向转运体(KCC)离子通道联合密度梯度离心对富集脐血中胎儿有核红细胞(NRBC)的效果。方法用KCC特异激活剂尿素(Urea)干预细胞膜,建立最大限度缩小细胞体积的干预条件;用最佳干预条件干预脐血后进行不同密度介质下离心富集NRBC,用流式细胞仪计数NRBC的富集效果。结果比较传统1.077淋巴细胞分离液离心后的单个核细胞层流式细胞仪计数NRBC为8.6%,干预脐血后用1.065密度介质离心后下层NRBC达69.9%,未干预组中用1.099密度介质离心的单个核细胞层NRBC达55.9%,提高了富集量。结论尿素干预联合密度梯度离心能有效提高NRBC的富集率。

脐血有核红细胞数量与胎儿窘迫的相关性研究

对23例急性胎儿窘迫、18例慢性胎儿窘迫患儿及21例正常妊娠分娩儿的脐血有核红细胞(NRBC)数量进行比较。结果急性胎儿窘迫脐血NRBC数量与正常分娩儿脐血NRBC数量比较,差异无统计学意义(t=1.72,P>0.05)。慢性胎儿窘迫患儿脐血NRBC数量明显高于正常分娩儿(t=4.71,P<0.001)。认为慢性胎儿窘迫患儿脐血NRBC明显增加,脐血NRBC计数可作为判断慢性胎儿窘迫的指标之一。

利用孕妇外周血中胎儿有核红细胞行无创产前性别诊断的初步研究

目的建立一种利用孕妇外周血中分选出的胎儿有核红细胞(FNRBC)进行无创伤性产前诊断的有效方法。方法收集5例妊娠7～9周的人流妇女的绒毛及外周血20ml,采用抗-CD45和抗ε链双标细胞,流式细胞仪分选CD45dim的细胞经显微挑选出ε-链免疫荧光抗体阳性的胎儿有核红细胞,再采用单细胞多重置换扩增技术(MDA)进行全基因组扩增,以扩增产物为模板,常规PCR检测Alphoid基因片段,确定胎儿性别,与绒毛PCR结果比较。结果抗-ε链、抗-CD45双标记的5例标本流式分选CD45dim细胞后,所有标本均观察到血红蛋白ε链阳性细胞。怀有2例男性和1例女性孕妇的外周血分选出的阳性细胞经MDA和PCRAlphoid基因片段扩增,显示1例全基因组扩增失败;1例诊断为男胎,1例为女性,与绒毛PCR性别检测结果完全符合。结论ε-抗体、CD45双标的CD45dim细胞经流式分选后结合显微操作技术从母血中挑选出ε-血红蛋白阳性细胞,经全基因组扩增可以有效获取足够量的研究模板,保证后续分析的准确性,可应用于性连锁遗传疾病的无创性产前诊断。