孕妇外周血胎儿有核红细胞计数变化及其在不良妊娠结局预测中的应用

目的观察孕妇外周血胎儿有核红细胞计数的变化,探讨其在妊娠不良结局预测中的应用价值。方法收集87例孕12～18周孕妇的外周血,密度梯度离心法分离单个核细胞,采用PE-GPA/FITC-CD71单克隆抗体双色标记胎儿有核红细胞后进行流式细胞分析,追踪妊娠结局并进行分析。结果妊娠结局正常者外周血中胎儿有核红细胞百分比为0.89%±0.81%,妊娠结局不良者为3.25%±2.98%,两者相比,P〈0.05。以胎儿有核红细胞百分比〉3.79%作为截断值,预测妊娠不良结局的敏感度为76.9%、特异度为64.3%。结论与妊娠结局正常的孕妇相比,妊娠结局不良孕妇孕12～18周时外周血胎儿有核红细胞增多;对孕12～18周孕妇外周血胎儿有核红细胞进行计数有助于不良妊娠结局的预测,其敏感度及特异度均较高。

基于纳米技术从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞并进行无创性产前诊断的可行性

目的建立一种基于纳米技术从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞并进行无创性产前诊断的方法。方法 Percoll 1.077单密度梯度离心法之后,选用抗体CD147修饰到以玻璃为载体的纳米羟基磷灰石基底上,对新生儿脐血中的胎儿有核红细胞进行捕获,利用胎儿特异性抗体HbF、红细胞表面特异性抗体CD71以及细胞核染色剂DAPI对捕获到的新生儿脐血中有核红细胞进行染色标记,进而实现分选。对正常不同孕周孕妇外周血、未孕健康妇女外周血及新生儿脐血中抗体CD147捕获到的有核红细胞进行染色标记分选。抽取10例行常规产检时发现高危因素的孕妇外周血2 m L,用抗体CD147捕获胎儿有核红细胞并用X、Y、18、21染色体探针进行荧光原位杂交。结果用HbF+CD71双标记染色法的胎儿有核红细胞阳性率与HbF单染和CD71单染标记的细胞阳性率相比差异有统计学意义(P<0.05);HbF单染和CD71单染标记的阳性细胞率之间相比差异无统计学意义(P>0.05);在孕16~20周时孕妇外周血中阳性细胞数目达到顶峰,之后随孕周增加而呈下降趋势。10例高危孕妇外周血标本均成功分离出胎儿有核红细胞,并经过FISH鉴定,本方法对男性胎儿诊断的灵敏度为85.71%,特异度为100.00%,对女性胎儿诊断的灵敏度为100.00%,特异度为85.71%,同时诊断出1例非整倍染色体胎儿,所有结果均经后期随访证实。结论用纳米材料为基底,抗体CD147捕获,HbF+CD71双染色标记法对孕妇外周血中的胎儿有核红细胞进行识别和富集,可提高胎儿有核红细胞的检出率,可为进一步产前诊断奠定基础,最佳时机应该在孕16~20周。

孕妇外周血中胎儿有核红细胞数量与胎儿窘迫的关系

目的:探讨孕妇外周血中胎儿有核红细胞(nucleatedredbloodcells,NRBC)数与胎儿窘迫的关系。方法:对54名孕龄32～42周,年龄19～35岁(包括19名急性胎儿窘迫,15名慢性胎儿窘迫)的孕妇外周血进行不连续密度梯度离心,对分离后的细胞进行制片、染色,显微镜下进行NRBC计数,比较组间差异。结果:15名慢性胎儿窘迫孕妇外周血中NRBC数目为(23.26±6.75)个/7mL;同孕龄正常妊娠妇女外周血中NRBC数目为(9.43±4.01)个/7mL,两者间差异有显著性(P<0.05)。19名急性胎儿窘迫孕妇外周血中NRBC数目为(10.87±4.29)个/7mL,与正常妊娠间差异无显著性(P>0.05)。结论:慢性胎儿窘迫孕妇外周血中NRBC数目明显升高,为胎儿窘迫的临床预测和评估提供了一条新思路。

联合干预离子通道提高PVDF膜富集胎儿有核红细胞的效率

目的通过干预细胞膜阴离子通道(AE)和Na+/K+/2Cl-离子共转运体(NKCC),提高聚偏二氟乙烯(PVDF)膜富集脐血有核红细胞(NRBC)的效率。方法以密度为1.067的分离液分离NRBC,用AE抑制剂维拉帕米(verapamil)和NKCC抑制剂呋噻米(furosemide)联合干预,用流式细胞技术和巢式PCR观察干预前后离心法和过5μm孔径PVDF膜法富集NRBC的效率。结果最佳离心分离密度梯度为1.067。流式细胞仪检测离心分离的NRBC平均纯度为2.54%,干预后离心分离NRBC纯度为9.36%,NRBC富集率提升近3.7倍;过PVDF膜前NRBC为0.83%,过膜后NRBC为6.15%,干预后过膜将NRBC富集率提升了7.4倍。用巢式PCR检测,每ml血样中NRBC为120个时,干预后过膜的扩增条带的密度值由4.48升高至17.78,提升近4倍。结论维拉帕米和呋噻米能够通过改变脐血细胞性状,提高NRBC通过PVDF膜的效率。

孕妇外周血分离胎儿有核红细胞与FISH分析技术在无创性产前诊断中的应用

目的:应用流式细胞仪从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞(NRBCs),通过荧光原位杂交(FISH)分析进行无创性产前诊断。方法:对15例妊娠11～24周的高危孕妇外周血按常规密度梯度方法分离单个核细胞,选用红细胞特异性抗体CD71、HbF结合流式细胞术(FACS)分选富集NRBCs,并进行FISH分析。结果:所有标本均分选出NRBCs,分选率为100%,CD71和HbF双阳性细胞含量为(3.43±1.62)×10-2。经FISH成功分析13例,未发现异常结果。结论:从孕妇外周血中分离富集得到的胎儿有核红细胞,通过FISH分析检测胎儿特定的染色体,可进行无创性产前诊断遗传性疾病。

孕妇外周血胎儿有核红细胞富集的孕周选择

目的 利用抗转铁蛋白受体（CD71）抗体和抗白细胞共同抗原（CD45）抗体双标法，检测不同孕周孕妇外周血中有核红细胞的比例，以期选择最佳孕周进行胎儿有核红细胞富集。方法 采用抗-CD71抗体和抗-CD45抗体双标法，应用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测81例不同孕周孕妇外周血中有核红细胞的比例，并与未孕组和脐血组进行对照。结果 孕7～34周孕妇外周血中CD71^＋／CD45^dim细胞的比例为（0．107土0．063）×10^-2，与未孕组和脐血组相比差异均有统计学意义；CD71^＋／CD45^dim细胞在外周血中的比例在孕17～18周达峰值，为（0．144土0．096）×10^-2。结论 不同孕周孕妇外周血有核红细胞比例不同，孕17～18周比例最高。利用母血循环中的胎儿有核红细胞进行产前诊断，其最佳时间可选择在妊娠17～18周。

胎儿有核红细胞在产前诊断中的应用

根据国外近5年对妊娠妇女外周血中胎儿有核红细胞应用于产前诊断的研究进展,总结胎儿有核红细胞的特点;简述胎儿有核红细胞在妊娠妇女外周血中出现规律及其富集分离方法;重点介绍采用聚合酶链反应和荧光原位杂交技术分析胎儿有核红细胞,以此对胎儿性别、血型及其可能存在的各种疾病,如21三体、13三体、18三体、地中海贫血、杜氏肌营养不良及巨细胞感染等进行诊断,同时可以对病理性妊娠提前筛查;为优生优育和妊娠期健康提供保障。

孕妇外周血胎儿有核红细胞数与胎儿及胎盘异常关系

目的探讨在胎盘和胎儿发生病理性变化时，母血中胎儿有核红细胞（FNRBC）数量的变化，为母血中FNRBC计数在无创性产前诊断中的应用提供理论基础和实验依据。方法对110例8～40孕周的妇女（60例正常妊娠，30例病理妊娠，20例胎儿异常）外周血进行单密度梯度离心，瑞氏染色和细胞计数，分析母血中FNRBC数量在病理妊娠和胎儿异常时的变化及其与孕周的关系。对有胎儿异常可能的病例，孕早期（8～12周）自然流产者行绒毛细胞核型分析，孕中期（13～24周）及晚期（25周以上）取流产儿和新生儿血进行染色体分析。结果正常妊娠时，母血中FNRBC平均数量为（10．20±8．11）×10^3／L，病理妊娠和胎儿异常时母血中FNRBC平均数量为（23．09±12．42）×10^3／L和（38．93±14．87）×10^3／L，病理妊娠组和胎儿异常组与正常妊娠组相比差异有显著性（F=25．927，q=4．236、10．674，P〈0．01）。正常妊娠组和病理妊娠组母血中FNRBC数量与孕周呈正相关（r=0．491、0．500，P〈0．05）。而异常胎儿组母血中FNRBC数量与孕周无相关性（r=0．283，P〉0．05）。结论在胎儿和胎盘发生病理性改变时，母血中FNRBC数量较正常妊娠增加，同时母血中FNRBC数量随孕周增加而增加，母血中FNRBC计数对产前预测病理妊娠和胎儿异常的发生有辅助意义。

干预离子通道联合密度梯度离心富集胎儿有核红细胞

目的探讨干预膜表面K-Cl同向转运体(KCC)离子通道联合密度梯度离心对富集脐血中胎儿有核红细胞(NRBC)的效果。方法用KCC特异激活剂尿素(Urea)干预细胞膜,建立最大限度缩小细胞体积的干预条件;用最佳干预条件干预脐血后进行不同密度介质下离心富集NRBC,用流式细胞仪计数NRBC的富集效果。结果比较传统1.077淋巴细胞分离液离心后的单个核细胞层流式细胞仪计数NRBC为8.6%,干预脐血后用1.065密度介质离心后下层NRBC达69.9%,未干预组中用1.099密度介质离心的单个核细胞层NRBC达55.9%,提高了富集量。结论尿素干预联合密度梯度离心能有效提高NRBC的富集率。

利用孕妇外周血中胎儿有核红细胞行无创产前性别诊断的初步研究

目的建立一种利用孕妇外周血中分选出的胎儿有核红细胞(FNRBC)进行无创伤性产前诊断的有效方法。方法收集5例妊娠7～9周的人流妇女的绒毛及外周血20ml,采用抗-CD45和抗ε链双标细胞,流式细胞仪分选CD45dim的细胞经显微挑选出ε-链免疫荧光抗体阳性的胎儿有核红细胞,再采用单细胞多重置换扩增技术(MDA)进行全基因组扩增,以扩增产物为模板,常规PCR检测Alphoid基因片段,确定胎儿性别,与绒毛PCR结果比较。结果抗-ε链、抗-CD45双标记的5例标本流式分选CD45dim细胞后,所有标本均观察到血红蛋白ε链阳性细胞。怀有2例男性和1例女性孕妇的外周血分选出的阳性细胞经MDA和PCRAlphoid基因片段扩增,显示1例全基因组扩增失败;1例诊断为男胎,1例为女性,与绒毛PCR性别检测结果完全符合。结论ε-抗体、CD45双标的CD45dim细胞经流式分选后结合显微操作技术从母血中挑选出ε-血红蛋白阳性细胞,经全基因组扩增可以有效获取足够量的研究模板,保证后续分析的准确性,可应用于性连锁遗传疾病的无创性产前诊断。

半乳糖特异性植物血凝素富集胎儿有核红细胞

目的建立半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的方法和反应装置，为胎儿有核红细胞用于产前诊断提供基础。方法选用38～40孕周正常分娩胎儿脐血，经半乳糖特异性植物血凝素反应体系分离和富集胎儿有核红细胞，半乳糖浓度为50、100、100、150、200μg／mL、大豆凝集素浓度为10、20、30、40、50μg／mL。特异性荧光抗体染色后用激光共聚焦显微镜观察并计数分离和富集到的胎儿有核红细胞。结果半乳糖特异性植物血凝素反应体系能够有效分离和富集胎儿有核红细胞，当包被玻片的半乳糖浓度为100μg／mL、大豆凝集素浓度为20μg／mL时，与有核细胞的比率最高为（6．54±0．56）％。结论半乳糖特异性植物凝素可用于选择性地分离和富集胎儿有核红细胞。

孕妇外周血中单个胎儿有核红细胞的产前基因分析

为探讨母血中单个胎儿有核红细胞 (NRBC)行产前基因分析的可行性 ,对 45名孕妇外周血行不连续密度梯度离心 ,显微操作获取单个 NRBC,A组 2 4例进行引物延伸预扩增 (PEP) ,后行 Y染色体特异性 DYZ1基因的聚合酶链反应 (PCR) ,B组 2 1例直接进行 Y染色体特异性 DYZ1基因的 PCR。发现 45名孕妇中有 2 4名检出 NRBC,A组中男胎符合率为 70 % ,总符合率为 83.3% ,B组则均未扩增到 PCR产物。提示用母血中单个胎儿 NRBC经 PEP- PCR法行产前基因分析是可行的。

胎儿有核红细胞的可识别标记

从母血循环中分离、富集和提取胎儿有核红细胞，进行无创性产前基因诊断，是近年来医学界具有重大意义的研究课题。胎儿有核红细胞由于自身特点较其他胎儿细胞更适用于产前诊断。有多种方法可用于分离胎儿有核红细胞，现就胎儿有核红细胞特异性标记进行综述。目前使用最多的阳性标记是CD71、CD36、GPA、血红蛋白等，同时使用CD45等阴性标记可以提高分选效率及纯化率。随着分子生物学、分子免疫学等学科的发展，会有更多的胎儿有核红细胞（nucleated red blood cells，NRBCs）特异性标记被发现，从而促进产前诊断的不断发展。

磁激活细胞富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞行产前诊断

目的 :研究磁激活细胞分离富集孕妇外周血胎儿有核红细胞进行产前诊断的可行性。方法 :2 1名孕 13 2 9周孕妇及 5名未妊娠妇女外周血 4 6ml,经单密度梯度离心和激活细胞分离 ,收集阳性组分抽提DNA ,经PCR扩增预测胎儿性别 ,并以出生后婴儿性别验证预测性别的准确性。结果 :以Y染色体特异引物介导的PCR扩增Y染色体特异片段检出的最低限量为 3 4个男性细胞或 3 4个男性细胞 / 3 5× 10 4 女性细胞。 2 1名孕妇分娩 13名男婴、8名女婴。男性DNA在 12名孕男胎孕妇外周血有核红细胞中被检出 ,在 1名孕男胎孕妇中未被检出 ;而在 8名孕女胎孕妇外周血有核红细胞及 5名未孕妇女外周血中均未检出男性DNA。预测胎儿性别的准确度为 95 2 3% ,假阴性率为 4 76 %。结论 :磁激活细胞分离富集孕妇外周血胎儿有核红细胞是一简单、快速、价廉的有效方法 ,被分离细胞DNA经PCR扩增后可用于胎儿性别的非侵入性产前诊断。

孕妇外周血中胎儿有核红细胞分选富集的方法学研究进展

孕妇外周血中存在胎儿有核红细胞（Fetal nucleated red blood cells，FNRBCs）已不容质疑，但要得到足够数量的FNRBCs并普及使用于无创性产前诊断仍存在一些问题。到目前为止尚未找到FNRBCs特异性的抗原，富集、分选FNRBC8操作复杂，费用昂贵。尽管如此，由于无创性产前诊断对胎儿没有任何风险，不受孕妇年龄和疾病的限制，带给孕妇的痛苦小，因此发展无创性产前诊断技术仍有较好的前景。随着单克隆抗体技术、

单个胎儿有核红细胞的DNA分析

目的 :获取孕妇外周血中的极少量胎儿有核红细胞 (NRBC) ,并进行单个 NRBC的基因分析 ,探讨其在产前基因诊断中的价值。方法 :将孕妇外周血进行不连续密度梯度离心 ,将分离后的细胞进行制片 ,光学显微镜下识别 NRBC,然后用显微操作仪获取单个 NRBC进行引物延伸预扩增 (PEP)及 Y染色体特异性 DYZ1 基因的聚合酶链反应 (PCR) ,以确定其来源于胎儿。结果 :单个 NRBC的 PEP- PCR法检测结果 ,6 0 %检出 DYZ1 的特异性条带 ,而单用 PCR法则均未检出特异性 DYZ1 条带。结论 :用母血中单个胎儿 NRBC进行产前基因诊断是可行的。

孕妇外周血中的胎儿有核红细胞在非损伤性产前诊断中的研究进展

20世纪70年代以来,研究人员开始探索分离孕妇外周血中胎儿细胞的方法来进行非损伤性产前诊断。本文对用于非损伤性产前诊断的最佳候选细胞-胎儿有核红细胞的特点、分离方法、培养、临床应用等方面的研究进展作一综述。

孕妇外周血中胎儿有核红细胞在性连锁遗传病产前诊断中的初步应用

目的：探讨利用母血胎儿有核红细胞进行性连锁遗传病产前诊断的可行性；方法：通过密度梯度离心富集母血胎儿有核红细胞，并经流式细胞仪鉴定，对富集后胎儿有核红细胞进行了ＳＲＹ 基因的套式ＰＣＲ检测；结果：５ 例有性连锁遗传病家族史的孕妇外周血中经扩增后３ 例阳性、２ 例阴性，所得结果均得到相应羊水、胎盘ＤＮＡＳＲＹ／ＰＣＲ 检测或出生胎儿生殖器检查结果的证实；