母体循环中胎儿游离DNA在单基因病产前诊断的研究进展

单基因病是引起胎儿出生缺陷的主要原因之一,其种类多,病情复杂,缺乏有效治疗方法,且预后差。目前,无创产前检测(NIPT)已成为筛查胎儿非整倍体的主要手段,在临床上广泛应用。基于母体循环中胎儿游离DNA(cffDNA)的发现及高通量测序技术的发展,单基因病的NIPT成为研究热点,且检测技术及其检测的疾病种类也在不断增加,但是单基因病的检测存在难度大、成本高等问题。目前胎儿单基因病的NIPT仍然处于研究阶段,尚未在临床应用。因此,深入研究母体循环中cffDNA的NIPT对单基因病产前诊断具有重要意义。

孕妇血中胎儿游离DNA是双胎妊娠无创DNA筛查的关键

越来越多的数据显示无创DNA筛查技术在双胎中具有良好的应用效果,并且被一些指南和文献推荐为双胎妊娠胎儿染色体非整倍体的一线检测方案。无创DNA筛查的关键是胎儿游离DNA浓度,如果浓度达不到检测阈值,将出现假阴性的结果。双胎妊娠孕妇血中的胎儿游离DNA虽然总体比单胎高,但是每个胎儿的DNA比单胎低,因此双胎妊娠的无创DNA筛查更容易出现检测失败和假阴性的结果。另外,临床上双胎一胎消失的情况又增加了假阳性的结果,这些都导致无创DNA筛查在双胎妊娠的筛查中效果不如单胎。基于SNP的无创DNA筛查技术可以准确评估孕妇和每个胎儿的游离DNA浓度,可以有效地保证无创DNA检测的效果,也可以解决消失胎儿对存活胎儿游离DNA干扰的问题。本文将对双胎妊娠胎儿游离DNA在无创DNA筛查中的关键作用进行阐述,以期为双胎的无创DNA筛查在临床上的应用和遗传咨询提供理论依据。

无创产前筛查在双胎妊娠染色体非整倍体筛查中的应用及胎儿游离DNA浓度分析

目的评估无创产前筛查(non-invasive prenatal testing,NIPT)在双胎妊娠染色体非整倍体的应用价值,并对胎儿游离DNA浓度进行分析。方法收集2018年1月至2023年5月在广州市花都区妇幼保健院接受NIPT检测的双胎样本617例(辅助生殖双胎284例,自然妊娠双胎333例)为研究对象,同期12688例单胎妊娠样本作为对照,采用高通量测序方法进行检测,对染色体非整倍体高风险样本行核型分析,根据Y染色体唯一比对条数对男胎进行胎儿游离DNA浓度计算,使用基于浅深度的母亲血浆DNA测序方法(SeqFF)对女胎进行胎儿游离DNA浓度计算。结果双胎妊娠检出2例T21和1例T18,未检出T13,T21、T18的阳性预测值分别为100%、0,阴性预测值均为100%;单胎妊娠T21、T18、T13的阳性预测值分别为88.89%、45.45%、25%,阴性预测值均为100%。双胎妊娠胎儿游离DNA浓度为10.48%,较单胎妊娠(11.35%)稍低;双胎妊娠首次建库成功率为99.03%,较单胎妊娠(99.99%)低,差异有统计学意义(χ^(2)=104.105,P=0.00)。结论NIPT在双胎妊娠染色体非整倍体筛查有一定应用价值,T21筛查效率高,胎儿游离DNA浓度影响NIPT检测的成败和结果准确性。

减少无创筛查假阴性及检测失败率——胎儿游离DNA富集技术

来自南京医科大学附属妇产医院许争峰教授从技术角度出发,给我们带来了“减少无创筛查假阴性及检测失败率-胎儿游离DNA富集技术”。许教授从NIPS中存在的问题——假阴性,检测失败出发,分析了假阴性和检测失败的原因,提出了“胎儿游离DNA富集技术”。之后详细介绍了富集方法,通过建立不同片段大小区间,回顾性分析10,000例男性胎儿NIPS测序数据,建立了提高胎儿浓度的富集方法。

胎儿游离DNA浓度低的影响因素及其与妊娠结局的关系

无创产前检测(non-invasive prenatal testing, NIPT)在21三体、18三体和13三体都具有较高的特异性和敏感性,甚至在其他常染色体非整倍体、性染色体非整倍体和微缺失/微重复综合征中也有较高的阳性预测值。NIPT检测的准确性取决于胎儿游离DNA浓度(fetal fraction, FF)。FF与采样孕周呈正相关,与孕妇体重或BMI呈负相关。孕妇年龄、受孕方式、母体血清标志物和胎儿非整倍体均可影响FF。此外,低胎儿游离DNA浓度(low fetal fraction, LFF)还可增加不良妊娠结局风险,如胎儿非整倍体、染色体变异和妊娠并发症等。在临床进行NIPT检测时,应重视FF孕妇。对于两次LFF孕妇,应建议进行后续的遗传咨询和侵入性产前诊断。

母体外周血胎儿游离DNA浓度与不良围产结局的相关性探究

目的探究母体外周血中胎儿游离DNA(cffDNA)浓度与不良围产结局的相关性。方法纳入2017年4月-2021年4月孕12^(+0)~26^(+6)周在本院行cffDNA无创产前筛查的单胎妊娠孕妇9917例。Logistic回归和ROC曲线评估不同cffDNA浓度梯度与不良围产结局的相关性。结果与cffDNA浓度高于75^(th)百分位相比,当cffDNA浓度低于25^(th)百分位时,孕妇发生妊娠期高血压(OR=1.5,95%CI:1.1~2.0)、子痫前期(OR=1.5,95%CI:1.1~1.9)、妊娠期糖尿病(OR=1.2,95%CI:1.1~1.4)、胎儿宫内生长受限(OR=1.8,95%CI:1.3~2.6)的风险增加。另外,子痫前期亚组分析显示,cffDNA%低于25^(th)百分位显著增加子痫前期并发胎儿宫内生长受限(OR=2.2,95%CI:1.0~4.7)、早发型子痫前期(OR=3.5,95%CI:1.7~7.4)、重度子痫前期(OR=1.4,95%CI:1.0~2.0)风险。cffDNA浓度联合孕妇年龄、BMI、受孕方式、产次预测早发型子痫前期的效果最佳,ROC曲线下面积为0.9,敏感性93.6%,特异性89.2%。结论cffDNA低浓度与妊娠期高血压、子痫前期、妊娠期糖尿病、胎儿宫内生长受限的风险增加有关,且与子痫前期的严重程度有关。

胎儿游离DNA浓度低相关因素分析及其对不良妊娠结局的影响

无创产前筛查(non-invasive prenatal screening,NIPS)通过对母体血浆中胎儿游离DNA(cell free fetal DNA,cffDNA)的分析,广泛用于常见胎儿染色体非整倍体的筛查。胎儿游离DNA在母体血浆游离DNA总量中的比例(即cffDNA浓度)会影响NIPS的准确性,cffDNA浓度低(<4%)可导致NIPS检测失败。目前已知多种因素会影响cffDNA浓度,但对影响因素还没有广泛的共识。此外,cffDNA浓度低可能反映早期胎盘异常并与不良妊娠结局相关。因此,分析cffDNA浓度低相关因素及其对不良妊娠结局的影响可以为NIPS结果的解释和遗传咨询提供指导。

孕妇外周血中低胎儿游离DNA浓度及处理方案

无创产前检测(non-invasive prenatal testing,NIPT)技术因其高灵敏度和特异度的特点已广泛应用于胎儿染色体异常的产前筛查之中。胎儿游离DNA浓度(fetal fraction,FF)是影响NIPT结果准确性的关键因素之一。不同检测平台对FF的最低阈值设定不同,FF达不到检测最低阈值是导致NIPT检测失败的重要原因之一。影响FF的因素众多,主要可分为生物学因素和实验相关因素。低FF也与妊娠期并发症或异常妊娠有一定相关性,其后续处理需引起重视。本文将从可能引起FF降低的因素及后续如何进行妊娠期管理等方面进行综述。

双胎妊娠中无创产前检测的胎儿游离DNA浓度特征及检测失败原因分析

目的分析双胎妊娠中无创产前筛查检测的胎儿游离DNA浓度及检测失败原因,探讨无创产前基因检测(noninvasive prenatal testing,NIPT)在双胎妊娠中的筛查效果和临床价值。方法选择2017年11月至2023年6月接受NIPT产前筛查的1685例双胎孕妇和109784例单胎孕妇作为研究对象,对行NIPT检测孕妇的血浆中胎儿游离DNA(cell free fetal DNA,cffDNA)浓度情况和检测失败原因及双胎妊娠对三大目标染色体的筛查效果进行分析。结果1685例双胎妊娠孕妇中NIPT检测成功1669例,检测成功率为99.05%,检测失败16例,检测失败率为0.95%,cffDNA浓度均在0.84%~41.22%,平均循环游离DNA(cffDNA)浓度为(10.30±4.75)%。109784单胎妊娠孕妇NIPT检测成功109335例,检测成功率为99.59%,检测失败总计有449例,检测失败率为0.41%,cffDNA浓度均在0.94%~49.83%,平均cffDNA浓度为(9.52±3.92)%。双胎妊娠孕妇中有11例检测结果提示高风险,筛查阳性率为0.66%,其中确诊7例,阳性预测值为63.63%(7/11)。结论NIPT是双胎妊娠目标染色体筛查的重要手段,但仍存在假阳性、检测失败等局限性,其检测失败率高于单胎妊娠。

胎儿游离DNA浓度的影响因素及相关产前筛查/诊断策略探讨

自1997年在孕妇血浆中发现了胎儿游离DNA后,无创产前筛查(non-invasive prenatal screening,NIPS)便应运而生,并迅速在全球临床开展。NIPS检测失败率约1%~3%,胎儿游离DNA浓度(fetal fraction,FF)低是其中一个重要的原因。本文主要对影响FF的胎儿因素、母体因素、实验室因素进行探讨,并结合孕妇相关临床特征、妊娠结局等,对进一步产前检查的选择进行探讨,以期为产前遗传咨询提供参考。

孕妇血样采集后体外存放对血浆中胎儿游离DNA水平的影响

目的:探讨孕妇血样采集后体外存放过程中血浆游离DNA水平的影响因素。方法:采集孕妇血样,体外4℃存放6、36h后,实时定量PCR检测孕妇外周游离DNA水平,Annexin Ⅴ/PI双染色法流式分析血样白细胞死亡情况,速率法检测血浆乳酸脱氢酶(LDH)活性,单相酶扩散法测定血浆DNA酶活性。结果:血样体外存放36h后,血浆中β-globin基因的拷贝数较存放6h的样品显著增加,而SRY基因拷贝数明显减少;4℃存放条件下,妊娠晚期孕妇外周血中胎儿DNA占总DNA百分比从6h的(10.3±5.6)%下降到36h的(3.0±2.1)%,差异有统计学意义(P<0.05)。体外存放6h的血样中基本未检出死亡细胞,而存放36h的血样中分别检出了坏死和凋亡的白细胞;36h样品血浆中LDH活性较6h样品显著升高(P<0.05)。单相酶扩散法结果表明,血浆DNA酶在4℃时虽然活性显著减弱,但仍然保持降解DNA的能力。结论:血样采集后体外存放时间过长会导致血浆总游离DNA增多,而胎儿DNA减少,这种变化可能与血样体外存放过程中白细胞死亡和血浆DNA酶对胎儿DNA的降解作用有关;胎儿DNA抽提应在血样采集后尽早(6h内)进行。

应用孕妇血浆中胎儿游离DNA进行产前筛查的临床研究进展

无创产前检测(NIPT)是采用二代测序技术对孕妇血浆中胎儿游离DNA(cffDNA)片段进行检测,通过生物信息学分析进行常见的胎儿染色体非整倍体异常的筛查。因其具有较高的检出率、敏感度和特异度以及较低的假阳性率,成为目前广泛应用的染色体非整倍体的产前筛查技术。通过NIPT筛查高风险孕妇选择性进行有创产前诊断,可避免大量不必要的有创性产前诊断。母体及胎儿因素可影响NIPT检测结果。临床应用时应充分考虑不同孕妇的个体情况。本文就应用孕妇血浆中cffDNA进行NIPT的临床研究进展及其影响因素进行综述,为个体化、规范化应用NIPT技术提供参考。

孕妇外周血中胎儿游离DNA在产前诊断中的应用

孕妇外周血中胎儿游离DNA的发现,为无创性产前诊断开辟了一条新途径。检测孕妇血浆中特异的胎儿DNA序列已被用于胎儿性连锁疾病鉴定、RhD血型检查和多种单基因遗传病的产前诊断;游离DNA水平的变化还可被用作某些妊娠相关疾病如先兆子、早产和胎儿染色体疾病的临床诊断新指标。本文对母体外周血中胎儿游离DNA的生化特征及其临床应用研究,进行了总结和分析。

通过富集母血浆中胎儿游离DNA无创性产前诊断β地中海贫血

目的:评价富集母血浆中胎儿游离DNA的实验平台在母血浆中富集、鉴定胎儿游离DNA的适用范围。方法:(1)筛选与父源性β地中海贫血基因连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点:利用Haploview软件对20例β地中海贫血患者(其中CD41-42型11例,IVS-II-654型9例)的β地中海贫血基因(HBB基因)进行SNP与单倍型自动化分析,检索出HBB基因内杂合度较高的SNP位点并检测与CD41-42位点及IVS-II-654位点连锁的SNP位点。(2)选取4例孕妇外周血标本,且夫妇双方为不同的β地中海贫血基因类型,利用快速耐受温度-低变性温度共扩增PCR技术(TT-FAST-COLD-PCR)检测父源性β地中海贫血基因类型为IVS-II-654型的孕妇外周血标本,若未直接检测到IVS-II-654位点,则检测仅与IVS-II-654位点连锁的SNP位点;同样的原理,利用完全耐受温度-低变性温度共扩增技术(TT-FULL-COLD-PCR)检测父源性β地中海贫血基因类型为CD41-42型的孕妇外周血标本;同时利用普通PCR技术对上述标本进行检测。结果:(1)检测出IVS-II654位点与rs7480526位点连锁9例;CD41-42位点与rs10768683位点连锁11例;(2)通过TT-FAST-COLD-PCR技术在孕妇外周血中检测出1例父源性致病突变基因(IVS-II-654位点),另外1例未直接检测到父源性致病突变基因,但检测到与其连锁的SNP位点(rs7480526位点),与羊水细胞培养检测结果一致,检出率为100%(2/2);通过TT-FULL-COLD-PCR技术在孕妇外周血中检测出2例父源性致病突变基因(CD41-42位点),与羊水细胞培养检测结果一致,检出率为100%(2/2);而普通PCR技术均未检测到上述父源性致病突变基因及与父源性等位基因连锁的SNP位点。结论:TT-COLD-PCR技术适用于富集母血浆中胎儿游离DNA突变,可用于无创性产前诊断单基因遗传病。

无创胎儿游离DNA检测技术在产前胎儿非整倍体筛查中的应用评价

目的：探讨无创胎儿染色体非整倍体检测技术（non-invasive fetal trisomy test, NIFTY）在胎儿染色体非整倍体产前筛查应用中的特异性和灵敏度。方法利用新一代高通量并行测序技术对母体外周血中的胎儿游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）进行定量分析，根据相应DNA含量的变化推断胎儿染色体的异常状况。结果2012年3月至2013年5月，检测孕12-24周的孕妇外周血标本，对233份已结束妊娠的孕妇数据进行分析评估。其中结果为染色体非整倍体高风险11例，低风险结果222例。在高风险病例中21三体5例；18三体3例；13三体1例；性染色体X0异常2例。所有高风险结果经细胞遗传学检测后确认与母血胎儿cfDNA检测结果一致，检测特异性100.0%。筛查低风险结果222例，均已分娩，临床证实为正常婴儿，检测灵敏度100.0%。结论无创胎儿游离DNA检测是一种很好的胎儿非整倍体异常的产前筛查技术。相对于目前普遍采用的孕早期或孕中期血清学产前筛查技术，胎儿cfDNA检测更加可靠，无创性的取样过程对孕妇和胎儿无损伤，具有更好的敏感度和特异性。

用不提取核酸PCR扩增孕妇血浆中胎儿游离DNA的SRY和FMR1基因

目的建立一种不提取核酸的孕妇血浆中胎儿游离DNA的检测方法。方法构建不提取核酸PCR法,用巢式PCR扩增Y染色体上的SRY基因序列和X染色体上的FMR1基因序列,检测44例孕妇血浆中游离DNA。根据随访判断结果的准确性。结果 44例孕妇经随访确认24例有男性胎儿,20例有女性胎儿。24例孕男性胎儿的孕妇血浆标本中有21例扩增出SRY基因和FMR1基因,敏感性为87.5%(21/24);20例孕女性胎儿的孕妇血浆标本中有17例扩增出FMR1基因,敏感性为85.0%(17/20)。结论建立的不提取核酸PCR法具有快速、简便等优点,可用于性连锁遗传病的产前诊断。

改良QIAamp法检测孕妇外周血中胎儿游离DNA-STR多态性

1997年研究者在一孕男胎孕妇血浆中成功地扩增出Y染色体特异性序列，从而证实了孕妇血浆中胎儿游离DNA的存在，这一发现提出了孕妇血浆中的游离胎儿DNA在产前诊断中应用的可能性。随后，许多学者在这一方向进行了研究和探讨，但大多都围绕着孕男胎孕妇血浆DNA中Y染色体的研究。

10例孕妇血浆中胎儿游离DNA-STR位点检测分析

目的:探索短串连重复序列(STR)多位点检测孕妇血浆中胎儿游离DNA的可行性。方法:改进QIAamp离心柱型DNA提取方法提取10例孕中期孕妇血浆中总游离DNA,进行D3S1358、D13S317、CSF1PO、D12S391、D6S477、VWA6个STR位点扩增,并以孕妇与胎儿羊水细胞基因组DNA为对照,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析胎儿游离DNA提取效果及检测效率。结果:10例孕中期孕妇血浆样本共检测位点60个,检出有结果位点44个,除去母体与胎儿DNA基因型完全一致的14个位点,剩余的30个位点中,18个位点成功检出胎儿DNA基因型,检出率30%。检出率最高的位点是D13S317和D12S391。结论:STR多位点的扩增可以检测得出胎儿特异性DNA序列,有望应用于无创伤性产前遗传性疾病的诊断和法医学亲子鉴定中。

孕妇血浆中胎儿游离DNA在唐氏综合征无创性产前诊断中的应用研究

目的探讨应用孕妇血浆中游离胎儿高通量基因测序技术在无创性产前诊断中的可行性。方法对3368例孕妇进行中孕期血清学筛查的同时，筛查出的高风险病例平行进行cffDNA高通量测序；对需进行产前诊断者，同时进行胎儿染色体核型以及MLPA分析。结果中孕期三联血清学筛查3368例，血清学筛查21三体高危共347例，经高通量基因测序技术检测后结果为唐氏高危20例；经MLPA分析，结果得出347例标本中21-三体病例为20例；最后通过羊水细胞核型分析证实20例与无创基因检测结果一致。应用孕妇血浆中游离胎儿DNA高通量基因测序技术诊断胎儿的21号染色体非整倍体异常的敏感度为100．00％（20／Z0），特异性为100．00％（347／347），假阳性率为0．00％（0／347）。结论无创性产前诊断技术具有无创、准确、快速的诊断优势，该技术具有良好的临床应用前景。

MiniSTR技术应用于孕妇血浆中胎儿游离DNA检测的研究

目的研究利用母血中胎儿游离DNA检测STR的方法。方法采集9名11—27孕周的孕妇抗凝血样并分离出血桨,提取血浆总DNA,利用ABI MiniFilerTM系统复合扩增D13S317、D7S820、D2S1338、D21S11、D16S539、D18S51、CSFIPO、FGA等8个常染色体miniSTR基因座和性别Amelogenin基因座,扩增产物经ABI 3100型基因测序仪作基因扫描检测,用GeneMapper ID 3.2软件分析结果。结果9例孕妇血浆样本中,均检出了父源性胎儿STR等位基因,D13S317等8个常染色体STR基因座中,平均检出胎儿特异等位基因3.1个/例。在性别Amelogenin基因座,Y等位基因检出的案例有5例,并且按ABI MiniFilerTM试剂盒的扩增条件,Amelogenin Y等位基因的荧光信号峰高均>50 RFU,平均占Amelogenin X等位基因峰高的8.45%;未检出Amelogenin Y等位基因的有4例,性别Amelogenin基因座的结果与出生后证实的胎儿性别相一致。结论MiniSTR技术适合于孕妇血浆中胎儿游离DNA的检测,在产前分子基因诊断中具有广泛的应用前景。