微量动态显色法定量检测胎牛血清中细菌内毒素含量

目的 探讨微量动态显色法定量检测胎牛血清中的细菌内毒素的可行性,并与凝胶法结果比较。方法 采用微量动态显色法鲎试剂,建立标准曲线,通过预干扰试验确定稀释倍数,测定供试品外加内毒素回收率进行干扰试验,对供试品进行定量检测,并与凝胶法试验结果进行比较。结果 标准曲线的线性范围为0.02~20 EU·mL^(-1),回归方程为lgT=2.9334-0.2883 lgC,相关系数| r |=0.9992,供试品在稀释200倍时无干扰作用,细菌内毒素回收率在50%~200%内,其中3批供试品的内毒素定量检测结果小于规定限值,1批高于限值,检测结果与凝胶法一致。结论 本品可采用微量动态显色法定量检测细菌内毒素含量,进行质量控制。

伊犁河谷猪瘟疫苗及胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒污染情况调查

目前,我国对生猪重大疫病的防控主要依赖疫苗免疫,且猪群疫病商品化疫苗主要以弱毒苗为主。猪瘟弱毒疫苗是预防猪瘟最常用的理想疫苗,但是,部分生产厂家在猪瘟弱毒苗生产过程中,往往由于使用胎牛血清而出现外源病毒感染的情况,如最常见的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。BVDV感染猪群后,可降低猪瘟疫苗的免疫效价,造成疾病传播的风险。为调查伊犁河谷商品化猪瘟疫苗和胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒污染的情况,本文对市售的5家厂商生产的不同种类的猪瘟疫苗和6家厂商生产的不同批号的胎牛血清,采用实时荧光定量RT-PCR方法进行BVDV检测。结果显示,猪瘟疫苗中BVDV核酸检测阳性率为18.2%,胎牛血清中BVDV核酸检测阳性率为8.3%,这为伊犁河谷养猪场及科研单位选用安全可靠的猪瘟疫苗与胎牛血清提供了技术支撑。

基于细胞体外培养筛选最适胎牛血清

为了探索小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)与猪胎儿成纤维细胞(PFF)对胎牛血清(FBS)的需求差异,以期筛选出最适血清,首先采用两种不同来源的FBS培养Sp2/0和PFF,观察细胞形态、克隆形成,分析细胞活率与数量.结果显示:无论采用国产FBS1还是进口的FBS2培养Sp2/0,其细胞克隆数、细胞数量和活率差异均无统计学意义(p>0.05),但进口FBS2培养的PFF,其细胞克隆数、细胞数量和活率均显著高于国产FBS1(p<0.05).随后用进口FBS2的3个不同批号培养PFF,结果显示:3个批号的FBS2均能促进细胞生长,细胞结构清晰,呈梭形;培养7 d,3个批次的FBS2均有细胞克隆形成,但FBS2-1形成的克隆小,且细胞克隆数极显著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01);培养10 d,FBS2-1的细胞数量和细胞活率极显著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01).虽然FBS2-2的细胞克隆数极显著低于FBS2-3(p<0.01),但是FBS2-2的细胞克隆大,且细胞数量极显著高于FBS2-3(p<0.01).结果表明:Sp2/0与PFF对FBS的需求有差异,无论是国产FBS1还是进口FBS2,均能满足Sp2/0体外培养的需要,但PFF在进口FBS2中的生长性能极显著优于国产FBS1,FBS2-2是PFF体外培养的最适血清.

胎牛血清在猪孤雌囊胚玻璃化冷冻后恢复培养中的作用研究

【目的】研究胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)在猪孤雌囊胚玻璃化冷冻后恢复培养中的作用。【方法】本试验以体外培养第5天的猪孤雌激活囊胚为材料,将新鲜和冷冻囊胚分别在含10%FBS(V/V)的胚胎培养液中继续培养48 h,即分为新鲜组(Fresh)、新鲜+FBS组(Fresh+FBS)、冷冻组(Vitrified)、冷冻+FBS组(Vitrified+FBS)。观察各组囊胚的扩张和孵化能力,检测胚胎的细胞膜损伤、凋亡细胞数目、总细胞数目、胞内活性氧(ROS)水平、线粒体活性以及发育相关基因的表达水平。【结果】与Fresh和Vitrified组相比,Fresh+FBS和Vitrified+FBS组的完全扩张率、孵化率和囊胚细胞总数均显著提高(P<0.05),细胞膜损伤率和细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)。与Fresh组相比,Vitrified组ROS水平显著升高(P<0.05),Fresh+FBS和Vitrified+FBS组ROS水平均显著降低(P<0.05)。Vitrified+FBS组的线粒体活性显著高于Vitrified组(P<0.05)、显著低于Fresh+FBS组(P<0.05),与Fresh组无显著差异(P>0.05)。相比于Fresh组,Vitrified组POU结构域与类转录因子1(POU5F1)表达水平显著上升(P<0.05)、过氧化氢酶(CAT)表达水平显著下降(P<0.05)。增殖细胞核抗原(PCNA)、DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、BCL2相关X蛋白(BAX)/BCL2L1的表达水平在Fresh和Vitrified组之间均无显著性差异(P>0.05)。Fresh+FBS和Vitrified+FBS组中PCNA、SOD 1和CAT的表达水平显著高于Fresh和Vitrified组(P<0.05)。【结论】体外培养第5天的新鲜和冷冻猪孤雌囊胚在10%FBS中继续培养,其发育能力及胚胎质量均得到明显改善。

胎牛血清对人胚胎神经干细胞分化的影响

目的 探索胎牛血清对人神经干细胞 (NSCs)的影响。方法 采用细胞培养、免疫组化、流式细胞仪检测的方法 ,观察了不同浓度胎牛血清对人NSC分化的影响。结果 胎牛血清促进人NSC分化为神经系统的主要的 3种细胞 (神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞 ) ,且培养基中胎牛血清浓度为 15 %时 ,人NSC分化为星形胶质细胞的数量占 80 %～90 %。结论 胎牛血清影响人NSC分化为神经元和神经胶质细胞的比例 ,并与胎牛血清的浓度有一定的关系。

自体血清与胎牛血清培养口腔黏膜角质细胞及上皮组织的实验研究

目的探讨自体血清培养人口腔黏膜角质细胞的可行性,为组织工程口腔黏膜用于临床提供理论和技术依据。方法应用自行制备的含10%、20%和30%自体血清的培养液及10%胎牛血清培养液,对人口腔黏膜角质细胞进行培养。对比观察不同浓度自体血清和胎牛血清培养的口腔黏膜角质细胞及上皮组织生长情况,绘制10%自体血清组及10%胎牛血清组细胞生长曲线及计算其倍增时间。并行抗-HLA免疫荧光检测培养上皮。结果各浓度自体血清组和10%胎牛血清组细胞生长及形态无明显差别,10%自体血清组细胞倍增时间为24.02±1.80h,与10%胎牛血清组20.90±0.79h比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组细胞24h克隆形成率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);随自体血清浓度升高获得黏膜上皮面积增大,厚度增加,以20%自体血清组最为明显,与10%胎牛血清组培养黏膜上皮比较,差异有统计学意义(P<0.05)。各组培养上皮经抗-HLA免疫荧光检测为阳性。结论制备的自体血清能完全替代胎牛血清对口腔黏膜角质细胞进行培养,且培养的口腔黏膜上皮组织分化优于胎牛血清。

冷冻保护剂和胎牛血清对牛成纤维细胞冷冻效果的影响

以甘油与DMSO为冷冻保护剂,添加5%-20%胎牛血清的DMEM为基础冻存液,对鲁西黄牛皮肤成纤维细胞进行冷冻保存,结果表明:①同浓度DMSO为冷冻保护剂效果优于同浓度的甘油(P<0.05),但添加50%血清时并不明显(P>0.05),可能与较高血清浓度有关,血清对冻存细胞的影响高于冷冻保护剂的作用。②血清浓度一定时,DMSO和甘油浓度在10%-15%时,冻存效果较好。③当甘油与DMSO浓度一定时,血清浓度越高冷冻保存效果越好。④甘油与DMSO浓度一定时(DMSO浓度5%除外),添加10%和20%血清效果无差异(P>0.05)。因此,在实际应用中,考虑成本等因素,血清浓度达到10%时就已经能达到一般试验要求。

胎牛肝细胞低分子天然抑瘤物的制备及其抗肿瘤作用

目的 :探讨胎牛肝细胞低分子天然抑瘤物 (LMW NTS)的理化性质、生物学特性、急性与长期毒性作用。方法 :从胎牛肝脏中分离提取出LMW NTS ,用高压液相色谱仪测定其分子量 ,紫外分光光度法测定OD2 6 0 及OD2 80 值。采用体外双层软琼脂细胞培养及腹腔注射LMW NTS治疗荷瘤小鼠 ,观察其体内外抗肿瘤作用、急性与长期毒性作用。结果 :胎牛肝细胞LMW NTS的分子量为 70 0 0～ 80 0 0 ,属核酸和多肽类物质 ,性质稳定。体外培养条件下胎牛肝细胞LMW NTS对小鼠S 180细胞较对正常小鼠骨髓粒 巨噬系祖细胞有更强的抑制增殖及集落生成作用 ;腹腔注射胎牛肝细胞LMW NTS治疗荷瘤小鼠能显著延长小鼠寿命 (P <0 .0 0 1)。毒性试验证实胎牛肝细胞LMW NTS无毒副作用 ,长期应用安全。结论 :胎牛肝细胞LMW NTS是一类分子量小、在体内外均有明显抗肿瘤作用、应用安全可靠的抑瘤物。

人脐血清代替胎牛血清培养树突状细胞

为探讨脐血清 (umbilicalcordserum ,UCS)取代胎牛血清 (fetalcalfserum ,FCS)对体外培养体系中树突状细胞分化和功能的影响 ,用脐血清代替FCS培养树突状细胞 ,通过流式细胞术检测细胞表型和MTT法检测混合淋巴细胞反应的能力。结果表明 ,脐血清培养的DC(UCS DC)表面CD83,CD86和HLA DR的表达率明显高于FCS组DC ;而CD1a表达率低于FCS DC ;对混合淋巴细胞反应的刺激能力UCS DC与FCS DC均较对照组明显增强 ,但UCS DC与FCS DC间无明显差别。结论 :脐血清代替FCS可以产生完全不含异种蛋白、表型比含FCS体系培养的DC更成熟 ,且有较强的刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的DC。

IL-1β和胎牛血清对大鼠神经干细胞分化的影响

在成年大鼠纹状体区分离神经干细胞 ,使用白介素 - 1β、神经生长因子、全反维甲酸和不同含量的胎牛血清作为诱导因子 ,通过免疫荧光化学方法和流式细胞仪检测细胞分化。结果表明胎牛血清有助于神经干细胞向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化 ,IL - 1β虽然对神经元数目没有明显影响 ,但对神经干细胞向多巴胺能神经元的分化却有明显促进作用。神经生长因子和全反维甲酸对神经干细胞向神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和多巴胺能神经元的分化数量无明显影响。

人脐血清代替胎牛血清体外培养脐血树突状细胞

目的 探讨人脐血清取代胎牛血清对脐血来源的树突状细胞体外诱导的影响。方法 无菌采集脐血 ,密度梯度离心法获取界面细胞 ,采用Mini MACS分离技术 ,分离CD34+ 造血干细胞 ,分成 3组 :脐血清组 (加入含 10 %UCS的RPMI 16 4 0培养液及细胞因子 ) ,胎牛血清组 (加入含 10 %FCS的RPMI 16 4 0培养液及细胞因子 ) ,对照组 (含10 %FCS但不含细胞因子 )。细胞因子为IL 4、GM CSF和TNF α ,第 8天收集部分细胞做细胞表型分析、形态学观察。结果 脐血清培养的DC(UCS DC)表面CD80、CD5 4和HLA DR的表达率与胎牛血清培养DC(FCS DC)比较无明显差异 ,UCS DC、FCS DC表达率与对照组比较均明显增高。结论 脐血清代替胎牛血清体外培养脐血来源的DC前体细胞 ,可以诱导出成熟DC ,为临床应用提供了一种新的选择。

自体血清与胎牛血清培养兔关节软骨细胞的生物学特性

背景:目前培养软骨细胞多使用胎牛血清。但近年异种血清培养组织向临床应用的安全性受到质疑,因此自体血清培养越来越受到重视。目的:比较体积分数10%兔自体血清与体积分数10%胎牛血清培养兔关节软骨细胞生物学特性的差异。方法:兔自体血清培养液制备后,分离培养兔关节软骨细胞,分别在体积分数10%自体血清和体积分数10%胎牛血清中进行单层传代培养至1,3,5代,采用光镜观察细胞形态变化,绘制生长曲线评估细胞增殖速度,观察甲苯胺蓝染色、Ⅰ,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果,以流式细胞仪分析细胞Ⅰ,Ⅱ型胶原以及CD26,CD44的表达变化。结果与结论:①在细胞形态上自体血清和胎牛血清培养的软骨细胞差异不大。②自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清培养的软骨细胞生长速度更快。③甲苯胺蓝染色结果示,无论是自体血清还是胎牛血清所培养的细胞,染色随代龄的增加逐渐变浅,细胞传至第5代时两组几乎均无异染。对于1代和3代细胞而言,自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清所培养的软骨细胞较为深染。④Ⅰ型胶原的表达随代数的增加而增加,而Ⅱ型胶原的表达则随代数的增加而减少。在3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅰ型胶原的表达水平低于胎牛血清培养的软骨细胞(P<0.05);在1代和3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅱ型胶原的表达水平高于胎牛血清培养的软骨细胞(P<0.05)。⑤CD26表达呈现先升高后降低的趋势,而CD44的表达不随传代数的增加而改变。提示同异体体积分数10%的胎牛血清相比,体积分数10%的自体血清培养的兔软骨细胞生长速度快,且在大部分指标上可以较好地保持细胞表型。

β-catenin在胎牛蹄边缘毛囊形态发生中表达的时空变化

以胎牛为实验动物,应用免疫组化方法定性检测β-catenin在胎牛蹄边缘表皮和毛囊形态发生中表达的时空变化,探讨胎牛蹄边缘毛囊形态发生中β-catenin表达的时空变化规律.结果显示:β-catenin在胎牛蹄边缘毛囊形态发生早期(68～93天)表达于表皮、基底层、基板和毛芽中,其中基底层、基板、毛芽中呈强阳性,表皮中呈中阳性;在毛囊形态发生中期(94～184天)表达于基底层、表皮和毛钉中,其中基底层、表皮、隆突区、内外根鞘和漏斗部呈中阳性;在毛囊形态发生晚期(184～225天)只在表皮及基底层有表达,其中基底层呈弱阳性,表皮呈强阳性.β-catenin表达的时空变化规律提示,在胎牛蹄边缘毛囊的形态发生过程中β-catenin具有重要作用.

臭氧对胎牛血清氧化损伤的表面增强拉曼光谱

对实验室细胞培养用的国产胎牛血清在臭氧作用前后进行了表面增强拉曼光谱测试,范围200～1800cm-1。发现臭氧作用1h后拉曼谱线强度大大减弱,作用3h后谱线强度进一步减弱,但减弱的程度明显减慢,说明臭氧氧化作用具有快速的特点。臭氧作用下蛋白质主链的有序构象(α-螺旋,β折叠)明显减少,对β折叠的损伤更为严重,β回折几乎消失。芳香族氨基酸和半胱氨酸侧链在臭氧作用下氧化损伤非常明显。这些特征谱线的变化,反映了臭氧的氧化作用使蛋白质变性,构象变化以及降解。

在胎牛血清蛋白润滑环境下GO/UHMWPE复合材料的摩擦学性能研究

采用往复式滑动摩擦磨损试验机,考察了在胎牛血清蛋白(BSA)润滑环境下,氧化石墨烯/超高分子量聚乙烯(GO/UHMWPE)复合材料的摩擦学性能.试验结束后,利用高分辨扫描电子显微镜(HR-SEM)和Micro-XAM非接触式三维表面轮廓仪观察试样表面磨痕并计算相应的磨损率.结果表明:在BSA润滑环境下,相对纯UHMWPE,尽管无机增强填料GO的添加可以显著降低复合材料的稳态摩擦系数(COF),但是随GO含量增加无明显变化.然而,复合材料的体积磨损率(WR)却随GO含量增加呈现出逐渐减小的趋势.因此无机填料GO可以显著改善UHMWPE在BSA润滑环境下的摩擦学性能.

二甲基亚砜和胎牛血清对293T细胞冷冻效果的影响

使用含不同体积分数二甲基亚砜(DMSO)(5%、10%、15%、20%)和不同体积分数胎牛血清(FBS)(5%、10%、20%、40%)的细胞冷冻液以三步冷冻法冻存293T细胞.台盼蓝染色法进行活细胞计数后计算出解冻后细胞存活率.结果表明:FBS对293T细胞冷冻效果的影响是显著的(P<0.05),但添加20%和40%FBS的效果无显著差异(P>0.05);DMSO对293T细胞冷冻效果的影响则是极显著的(P<0.01),添加10%DMSO时,细胞的冷冻效果最好;冷冻液中含10%DMSO、40%FBS时的冷冻效果最佳,细胞存活率可达到82.00%.而实际应用中,含10%FBS、10%DMSO或20%FBS、5%～10%DMSO的细胞冷冻液也可达到较理想的冷冻效果,足以达到一般实验的要求.

胎牛及成牛皮胶原性质的研究

采用低温酶解法分别从胎牛及成牛二层皮中提取了可溶性胶原,对其进行了表面形貌、含水量、等电点、热稳定性的测定,并采用红外光谱对其结构特性进行了表征。结果表明:胎牛皮胶原的多孔网状结构明显,内部含水量高于成牛,但热稳定性低于成牛。红外光谱结果表明:与胎牛皮胶原相比,成牛皮胶原中含有更多成熟稳定的交联结构。因此,说明随着动物的年龄增长,由于胶原类型及交联含量的改变,胶原的可溶性逐渐降低。

大鼠骨髓间充质干细胞生长特性和表面标志与培养基中胎牛血清浓度的关系

目的:讨两种浓度胎牛血清培养的不同传代次数的骨髓间充质干细胞探在生长特性及表面标志方面的差异性。方法:实验于2004年在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心进行。取健康Wistar大鼠5只,采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,然后分别以体积分数为0.1和0.15的胎牛血清的L-DMEM培养基进行贴壁培养,观察原代和传代细胞的形态特征、生长曲线及表面标志CD45,CD11b,CD29和CD44的表达(骨髓间充质干细胞表达CD29和CD44,造血前体细胞表达CD45和CD11b)。结果:①两种浓度胎牛血清培养细胞均能获得贴壁梭形骨髓间充质干细胞,但体积分数为0.15的胎牛血清原代培养的细胞分裂增殖较快,集落融合较早,传代时间较短(平均10d)。②体积分数为0.1的胎牛血清传代培养第1,2代细胞均质性相对较差,CD45阳性率分别为23.4%,15.4%,CD11b阳性率分别为16.6%,10.3%,高于体积分数为0.15的胎牛血清培养组(P<0.05),至第3代后两组已无差异,CD45和CD11b阳性率均小于5%,而CD29和CD44阳性率均大于95%。③两组的骨髓间充质干细胞生长曲线相似,但体积分数为0.15的胎牛血清培养的骨髓间充质干细胞对数生长期峰值出现较早,为第6天,而体积分数为0.1的胎牛血清培养组为第7天。结论:体积分数为0.1和0.15的胎牛血清培养的骨髓间充质干细胞在生长特性和表面标志方面存在差异。使用体积分数为0.1的胎牛血清已可满足骨髓间充质干细胞的分离纯化和培养扩增,但要在短期内获得较纯的骨髓间充质干细胞,使用体积分数为0.15胎牛血清优于体积分数为0.1胎牛血清。

含胎牛血清胶原酶消化法培养兔成骨细胞

目的 :用含胎牛血清的胶原酶消化胎兔颅盖骨骨组织 ,进行体外成骨细胞培养。方法 :妊娠 2 8d的孕兔 ,无菌条件下剖腹取出胎兔 ,然后取胎兔的颅盖骨 ,剔净、漂洗、剪碎。用含胎牛血清的胶原酶消化 ,培养成骨细胞。台盼蓝染色测定细胞的存活率 ,细胞内碱性磷酸酶 (ALP)染色鉴定和测定成骨细胞的纯度。结果 :用含胎牛血清的胶原酶消化并培养出成骨细胞 ,台盼蓝染色拒染率高达 98% ,ALP染色阳性区域不少于 95 %。结论 :用含胎牛血清胶原酶消化胎兔颅盖骨骨组织 ,培养出的成骨细胞具有典型的成骨细胞特征 ,且成分单一 。

β-连环蛋白在胎牛睫毛毛囊发育中的表达

以胎牛为实验动物,应用免疫组化检测胎牛睫毛毛囊发育过程中不同阶段β-连环蛋白的表达变化。结果显示β-连环蛋白在毛囊发育早期和中期表达于睫毛毛基、毛芽和毛钉中,其中在隆突区及毛母质中强表达;毛囊发育晚期及成熟期于隆突区、内外根鞘近隆突区强表达,而在毛母质中表达减弱。β-连环蛋白的表达变化提示其在胎牛睫毛毛囊的形态发生及发育中具有重要作用。