体外分步诱导人母体来源胎盘间充质细胞分化为胰岛素分泌细胞

目的建立体外诱导人母体来源胎盘间充质细胞分化为胰岛素分泌细胞的分步诱导分化体系。方法分离纯化人母体来源胎盘间充质细胞,体外扩增后进行分步诱导分化,收获的胰岛素分泌细胞分别行免疫细胞化学和ELISA检测,并通过葡萄糖刺激的胰岛素释放试验(GSIS)评价其体外功能。结果分离纯化的人母体来源胎盘间充质细胞经培养及六步诱导分化后最终可形成胰岛素分泌细胞。免疫细胞化学检测诱导后细胞GLP-1、PDX-1和C-Peptide染色为阳性,ELISA结果显示该诱导细胞培养上清中胰岛素有较高的表达。诱导后的胰岛素分泌细胞在低糖和高糖刺激下的胰岛素释放量分别为(20.42±1.58)μIU/mL和(65.1±7.43)μI-U/mL(P<0.01)。结论通过建立体外人母体来源胎盘间充质细胞分化为胰岛素分泌细胞的分步诱导分化体系,获得具有一定胰岛素分泌能力的细胞,为胰岛移植的细胞来源提供了更有效的新途径。

母体来源人胎盘间充质细胞的分离培养及其分化能力的研究

目的探讨胎盘母体来源间充质细胞的分离、培养方法及其向脂肪和成骨诱导分化潜能。方法采用酶消化获得母体来源胎盘间充质干细胞;体外扩增后,利用流式细胞仪检测其表面标志物;进行诱导分化后,采用油红O及茜素红染色鉴定其向脂肪和成骨诱导分化潜能。结果体外培养的母体来源胎盘间充质干细胞呈长梭形,细胞形态均一;细胞表面标志鉴定:CD73、CD90和CD105呈阳性表达,而CD14、CD34、CD45和HLA-DR呈阴性表达;细胞诱导分化后,经油红O、茜素红染色证实其可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论建立了母体来源胎盘间充质干细胞的分离培养方法;证实其具有成脂、成骨分化潜能,有望成为细胞治疗及组织工程更为理想的种子细胞。

人胎盘间充质干细胞调控TGF-β1/Smad3信号通路抑制肺纤维化的发生

背景:研究表明人胎盘间充质干细胞能有效抑制肺纤维化的发展,但其发挥作用的具体机制目前并不清楚。目的:探究人胎盘间充质干细胞对二氧化硅诱导人胚肺成纤维细胞发生肺纤维化的治疗作用及相关机制。方法:CCK-8法检测不同质量浓度二氧化硅干预不同时间对MRC-5细胞增殖活力的影响,结合免疫荧光染色法筛选出最佳的二氧化硅刺激质量浓度与时间用于后续实验。将MRC-5细胞分为空白组、二氧化硅组、二氧化硅+人胎盘间充质干细胞组,空白组细胞不予任何处理,二氧化硅组MRC-5细胞给予100μg/mL二氧化硅刺激48 h,二氧化硅+人胎盘间充质干细胞组MRC-5细胞先给予100μg/mL二氧化硅刺激48 h后再与人胎盘间充质干细胞共培养24 h。免疫荧光染色检测各组细胞α-平滑肌肌动蛋白、胶原蛋白Ⅰ型蛋白的表达;Western blot检测各组细胞肺纤维化相关蛋白和TGF-β1/Smad 3信号通路相关蛋白表达。结果与结论:①CCK-8结果显示,100μg/mL二氧化硅刺激MRC-5细胞48 h为最佳质量浓度与时间;②免疫荧光染色结果显示,与二氧化硅组相比,二氧化硅+人胎盘间充质干细胞组α-平滑肌肌动蛋白、胶原蛋白Ⅰ型蛋白表达明显降低;③Western blot结果显示,与二氧化硅组相比,二氧化硅+人胎盘间充质干细胞组α-平滑肌肌动蛋白、胶原蛋白Ⅰ型、N-钙黏蛋白、粘连蛋白、转化生长因子β1、p-Smad3、Smad3的蛋白表达均降低,E-钙黏蛋白表达升高,差异均有显著性意义(P<0.05);④结果说明,人胎盘间充质干细胞能够对二氧化硅诱导的肺纤维化有显著的治疗作用;人胎盘间充质干细胞可以通过调控TGF-β1/Smad3信号通路抑制肺纤维化的发生。

胎盘间充质干细胞外泌体通过调控NF-κB信号通路抑制矽肺肺纤维化的进展

目的探讨人胎盘间充质干细胞外泌体(hPMSCs-Exo)对二氧化硅(SiO_(2))诱导小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)肺纤维化(PF)的作用机制。方法采用差速超速离心法提取外泌体,采用蛋白质免疫印迹实验(Western blot)、透射电镜、纳米粒径追踪鉴定外泌体。用MTT实验检测24 h不同浓度SiO_(2)干预MH-S增殖细胞活力影响,结合实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测在MH-S细胞中胶原蛋白Ⅰ型(COL-Ⅰ)和α-平滑肌(α-SMA)的表达,选择SiO_(2)最佳刺激质量浓度进行后续实验。将MH-S细胞分为正常对照(Control)组、SiO_(2)组、SiO_(2)+DMSO组、SiO_(2)+PDTC组,SiO_(2)+DMSO+hPMSCs组、SiO_(2)+PDTC+hPMSCs组、SiO_(2)+DMSO+hPMSCs-Exo组、SiO_(2)+PDTC+hPMSCs-Exo组,采用RT-qPCR检测细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α相对转录水平;采用Western blot检测各组NF-κB信号通路及细胞凋亡相关蛋白表达。结果SiO_(2)刺激MH-S细胞后PF相关基因COL-Ⅰ、α-SMA表达增高,炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达增加,NF-κB通路被激活,其相关蛋白表达量上调,细胞凋亡因子表达量上调(P均<0.01),促进了纤维化的发生;在加入抑制NF-κB信号通路抑制剂PDTC后,NF-κB通路被抑制,其相关蛋白表达量降低,炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达降低,PF相关基因COL-Ⅰ、α-SMA表达减弱,细胞凋亡率降低(P均<0.05),PF的发展被抑制。抑制NF-κB通路后移植hPMSCs细胞和hPMSCs-Exo,PF相关基因表达降低,炎症因子释放减少(P均<0.05),抑制了细胞凋亡,PF的发生被有效干预。结论hPMSCs-Exo可能通过调控NF-κB信号通路来抑制矽肺PF的进展。

旋转生物反应器内球形体培养对人胎盘间充质干细胞炎症因子分泌的影响

背景:生物反应器内球形体培养是既能维持间充质干细胞干性又能大规模扩增的体外培养方法,明确其对干细胞免疫调节作用的影响有利于指导临床应用。目的:探讨旋转生物反应器内球形体培养对人胎盘间充质干细胞炎症因子分泌的影响。方法:从人胎盘组织中分离培养人胎盘间充质干细胞,分别进行二维培养和旋转生物反应器培养,利用倒置相差显微镜、免疫组化染色和CCK-8实验观察细胞形态与增殖能力,RT-qPCR和流式荧光法检测多种炎症因子基因表达与蛋白分泌量。结果与结论:①旋转生物反应器内培养的人胎盘间充质干细胞聚集成多细胞球形体,数量与体积逐渐增加;②苏木精-伊红染色可见旋转生物反应器内培养4 d的人胎盘间充质干细胞在球形体内分布均匀,形态正常;③免疫组化染色显示球形体内有大量人胎盘间充质干细胞的细胞核Ki-67阳性;④CCK-8实验结果显示,生物反应器内球形体培养的人胎盘间充质干细胞活力显著高于二维培养的细胞;⑤RT-qPCR和流式免疫荧光法检测结果显示,旋转生物反应器内球形体培养的人胎盘间充质干细胞中白细胞介素1β、白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素10、白细胞介素17、肿瘤坏死因子α和干扰素α的基因表达量和蛋白分泌量显著高于二维培养的细胞;⑥结果表明,旋转生物反应器内球形体培养能显著提高人胎盘间充质干细胞分泌多种炎症因子的能力,加强人胎盘间充质干细胞的免疫调节作用。

lncRNA H19促进胎盘间充质干细胞成骨分化的相关研究

目的观察lncRNA H19转染人胎盘间充质干细胞后对多个成骨、成血管因子表达的影响,为构建成骨性能良好的骨缺损填充物提供前期研究基础。方法首先进行调控成骨、成血管因子的miRNAs筛选,将目标锁定为miR-29b-3p、miR-29c-3p、miR-137-3p和miR-383-5p。通过进一步的生物信息学检索,lncRNA H19可以同时调控上述四种miRNAs。进而优选其中调控成骨成血管因子较多的miR-137-3p和miR-383-5p为H19的靶标,利用双荧光素酶报告基因实验验证H19与miR-383-5p、miR-137-3p是否具有调控关系。进一步将H19克隆到慢病毒,然后转染到胎盘间充质干细胞,观察干细胞中miR-137-3p和miR-383-5p表达情况,及IBSP、RUNX2、FGF5和BMP2K的表达能力。通过碱性磷酸酶和茜素红染色,观察转染了H19的胎盘间充质干细胞的成骨性能是否得到提高。结果转染lncRNA H19的人胎盘间充质干细胞内miR-137-3p、miR-383-5p表达下调,而RUNX2、IBSP的表达均明显升高(P<0.05),BMP2K和FGF5的表达各组间无明显差异(P>0.05)。胎盘间充质干细胞转染H19后成骨性能得到提升。结论转染lncRNA H19的人胎盘间充质干细胞可以促进某些成骨成血管因子的表达且提高成骨性能,为今后研制成骨性能良好的组织工程骨提供了可能。

人胎盘间充质干细胞及外泌体对更年期雌性大鼠性激素及卵巢储备功能的影响

探讨人胎盘间充质干细胞(human placental mesenchymal stem cells, hPMSCs)及其外泌体(hPMSC-Exos)对更年期雌性大鼠性激素及卵巢储备功能的作用。方法 取人胎盘组织,分离、培养hPMSCs,应用流式细胞术进行鉴定。自培养液中分离hPMSC-Exos,利用透射电镜和Western blotting进行鉴定。将21只更年期大鼠分为三个小组,分别记为对照组、干细胞组和外泌体组。除对照组外,另外两组分别移植hPMSCs、hPMSC-Exos。移植结束后第10天,取大鼠卵巢和子宫称重,计算卵巢和子宫指数,显微镜下观察卵巢组织形态变化。ELISA法检测大鼠血中雌二醇(estradiol, E2)、促卵泡生成素(follicle stimulating hormone, FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormone, LH)、抗苗勒管激素(anti mullerian hormone, AMH)和抑制素B(inhibin B, INHB)水平。结果 分离出的细胞阳性表达CD90、CD29、CD105,阴性表达CD45、CD34、HLA-DR,符合hPMSCs表面标志特征。分离的外泌体直径50-150nm,阳性表达CD9和CD63,符合hPMSC-Exos的特征。与对照比较,干细胞组和外泌体组大鼠卵巢蒌缩程度较轻,各级卵泡数量增多,闭锁卵泡减少;与对照组比较,另外两组的大鼠卵巢指数及子宫指数水平更高,t检验显示,P<0.05;除对照组外,分析另外两组的大鼠卵巢指数及子宫指数水平差异性,经t检验显示,P>0.05。与对照组相比,另外两组的E2、AMH、INHB水平更高,而FSH、FSH/LH水平更低,经t检验,P<0.05;两组组间比较上述指标,t检验显示,P>0.05。结论 hPMSCs及hPMSC-Exos可改善更年期内分泌紊乱和卵巢储备功能。

胎盘间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性研究

目的探讨兔胎盘问充质干细胞（placenta—derived mesenchymal stem cells，PMSCs）和兔骨髓间充质干细胞（bone marrow—derived MSCs，BMSCs）体外分离培养、增殖，对其生物学性状进行比较观察。方法取足月待产新西兰大耳白兔1只，采用密度梯度离心法及贴壁培养技术从兔胎盘对PMSCs进行分离、纯化和传代培养。取2周龄新西兰大耳白兔1只，采用直接贴壁法从后肢骨髓中对BMSCs进行分离、纯化和传代培养。用倒置相差显微镜观察两种细胞形态。免疫组织化学染色对第3代细胞表面标志（CD44、CD105、CD34、CD40L）进行鉴定。将BMSCs与PMSCs第2代细胞分别与生物衍生骨进行复合培养5d，每条材料接种（1．0～1．5）×10^6个细胞，苏木素染色观察细胞与材料复合培养情况。扫描电镜观察两种细胞分别与材料复合培养3d和8d的情况。结果在倒置相差显微镜下观察，两种细胞均为贴壁生长，形态为均一成纤维细胞样。PMSCs增殖力强，细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降，细胞体外培养10代后，生长速度减慢。两种细胞均表达CD44、CD105，不表达CD34、CD40L。复合培养5d，PMSCs和BMSCs在生物衍生骨表面生长，大量黏附，细胞积聚成团，相互连接成网状，孔隙内也可见细胞生长和增殖，并分泌基质。扫描电镜观察：复合培养3d，可见较多量的细胞在生物衍生骨上黏附，呈梭形或多角形；8d两种细胞均已大量增长，呈层状排列，细胞连接紧密，分泌大量基质，细胞周围有较多的网状胶原形成。结论PMSCs与BMSCs有相似的生物学特性，可作为组织工程的另一成体干细胞来源。

胎盘间充质干细胞的应用研究

背景:胎盘间充质干细胞因其具有来源广泛、免疫原性低、不涉及伦理问题等优点成为种子细胞的新来源。目的:阐述胎盘间充质干细胞的来源、生物学特性及应用最新研究进展。方法:检索Pub Med、ScienceD irect、Ovid SP、CNKI数据库相关文章,检索时限为2003至2015年,英lacenta文检索词为"P,Mesenchymal stem cells,The placenta mesenchymal stem cells,Cell transplantation,Application mechanism",中文检索词为"胎盘,间充质干细胞,胎盘间充质干细胞,细胞移植,应用机制",从中筛选出与主题相关且论据可靠的部分文献,最终纳入57篇文章进行归纳综述。结果与结论:目前已成功分离培养出胎盘间充质干细胞,并对其生物学特性进行研究,证明其具有干细胞源性及多向分化潜能。目前有较多关于胎盘间充质干细胞应用于实验动物及临床的研究,在骨组织工程、血管再生及神经组织等修复过程中均显示出了巨大的潜力,但胎盘间充质干细胞的具体应用机制目前尚不清楚,尚处于探索阶段,在胎盘间充质干细胞广泛应用于临床之前,仍有许多问题有待进一步研究明确,以确保其安全性和有效性。

胎盘间充质干细胞低氧培养液对肠黏膜上皮细胞氧化应激损伤的保护作用

目的研究胎盘间充质干细胞(p MSCs)低氧培养液对肠黏膜上皮细胞氧化应激损伤的作用。方法组织块培养法提取p MSCs,流式细胞术检测表面标志,ELISA检测p MSCs常氧(21%O_2)或低氧(1%O_2)培养5 d后培养液中胰岛素样生长因子1(IGF-1)的含量。人结肠腺癌细胞(Caco2)经100μmol/L H_2O_2处理12 h后分别培养于正常培养液、p MSCs常氧培养液或p MSCs低氧培养液,5 d后台盼蓝染色测细胞存活情况,MTT测细胞增殖,Annexin V-FITC/PI双染测细胞凋亡。结果 p MSCs阳性表达CD29,CD44。p MSCs低氧培养液中的IGF-1明显多于p MSCs常氧培养液(P<0.05)。与p MSCs常氧培养液相比,p MSCs低氧培养液中H_2O_2处理的Caco2存活细胞多,增殖快,凋亡少(P<0.05)。向p MSCs低氧培养液中加入IGF-1抗体后,细胞增殖减慢,凋亡增多(P<0.05)。结论 p MSCs低氧培养液对H_2O_2处理的Caco2具有保护作用。机制与IGF-1促进细胞增殖、抑制凋亡相关。

人胎盘与骨髓源性间充质干细胞体外培养及生物学特性对比

背景:组织工程修复大块组织缺损需要高浓度、大量的细胞接种,骨髓间充质干细胞是种子细胞的主要来源,但存在数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化的问题。目的:体外分离培养、扩增人胎盘源性间充质干细胞与人骨髓间充质干细胞,并对其生物学性状进行比较。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-09/2009-02在东直门医院实验室完成。材料:胎盘由解放军空军总医院妇产科提供,骨髓来源于健康成人献髓者。方法:采用密度梯度离心法从胎盘中分离、纯化和传代培养人胎盘源性间充质干细胞;骨髓肝素抗凝后,采用密度梯度离心法分离、纯化和传代培养人骨髓基质干细胞。主要观察指标:用倒置相差显微镜观察两种细胞形态及细胞生长情况,流式细胞仪分析检测第5代细胞表面标志的表达,VonKossa染色及油红O染色检测分化能力。结果:镜下两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样,传5代后细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,体外培养10代后细胞生长速度减慢,但人胎盘源性间充质干细胞扩增倍数较人骨髓基质干细胞平均高出两三个数量级。两种细胞具有均一的细胞表型,均表达CD29,CD44,CD166,不表达CD34,CD45,HLA-DR。两种细胞都具有成骨、成脂分化潜能,但人胎盘源性间充质干细胞分化潜能更强。结论:人胎盘源性间充质干细胞与人骨髓基质干细胞具有相似的生物学特性,且前者具有更强的增殖能力。

玻璃酸钠及胎盘间充质干细胞和诱导的软骨细胞膝关节腔内注射:修复膝骨关节炎

背景:胎盘间充质干细胞已被证实具有较强的增殖能力,能向神经细胞、血管内皮细胞、表皮细胞以及胰岛样细胞等诱导分化,但向软骨细胞诱导分化并修复膝骨关节的研究不多。目的:人胎盘间充质干细胞体外诱导软骨细胞膝关节腔内注射修复兔膝骨关节炎,并比较璃酸钠和胎盘间充质干细胞膝关节腔内注射的修复效果。方法:1选新西兰大白兔制作骨关节炎模型,左后肢膝关节炎造模后石膏固定5.5周,镜下观察关节软骨情况。2利用Ⅳ型胶原酶消化分离培养人胎盘间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标志物,证实为胎盘间充质干细胞。取第3代胎盘间充质干细胞进行实验,将胎盘间充质干细胞加入软骨诱导培养基向软骨细胞分化,倒置显微镜观察结果。3将大白兔随机分成玻璃酸钠膝关节腔内注射组、胎盘来源间充质干细胞膝关节腔内注射组和诱导软骨细胞膝关节腔内注射组,分别给予膝关节腔内注射,连续5周取膝关节软骨镜下观察,比较软骨修复情况。结果与结论:体外诱导培养的人胎盘间充质干细胞增殖形成大量贴壁细胞,贴壁细胞具有典型的间充质细胞形态;应用软骨诱导培养基培养后,细胞只保持微团,不继续增殖形成贴壁细胞,微团基部无贴壁细胞,显示人胎盘间充质干细胞可以分化为软骨细胞。苏木精-伊红染色镜下观察发现,各组兔膝关节软骨细胞均有修复,诱导软骨细胞膝关节腔内注射后兔膝关节软骨修复情况较好,优于玻璃酸钠和胎盘间充质干细胞膝关节腔内注射组。

胎盘间充质干细胞传代后的增殖能力

背景:胎盘间充质干细胞的增殖能力比骨髓间充质干细胞增殖能力强,但是否每个代次胎盘间充质干细胞的增殖能力都相同尚无定论。目的:分析不同代次胎盘间充质干细胞的增殖能力。方法:采用酶消化法分离人胎盘间充质干细胞,并利用流式细胞仪检测干细胞表面标志物,并进行成脂成骨诱导分化。采用细胞计数和BrdU方法检测细胞的增殖能力,根据倍增时间公式计算倍增时间,并进行长期传代。结果与结论:胎盘间充质干细胞阳性表达CD44、CD90和CD105,阴性表达CD14、CD34和CD45;成脂诱导21 d后油红O染色镜下可见红色脂肪滴,成骨诱导35 d茜素红染色镜下可见钙盐结节。细胞从第1代开始计数,直到第15代共获得3.5×1011个细胞。P5代比P10和P15代胎盘间充质干细胞的增殖能力强,倍增时间短。长期传代,胎盘间充质干细胞传代到第25代时,其中3例标本细胞形态完全发生改变,呈铺路石样;另外2例标本几乎无贴壁细胞。提示胎盘间充质干细胞可以长期传代到第25代,不同代次的胎盘间充质干细胞增殖能力不同,P5代增殖能力明显高于P10和P15代,临床应用应以P5代之前为宜。

人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化

背景:胎盘的细胞成分较复杂,其中所包含的滋养细胞在母胎免疫耐受过程中起重要作用,胎盘间充质干细胞具有多向分化潜能以及抑制淋巴细胞增殖的特性,常规分离方法通常难以获得大量且纯度较高的上述两种细胞。目的:拟建立一次操作即可同时获得大量、较高纯度的滋养细胞和胎盘间充质干细胞的操作方案。方法:人胎盘组织洗净剪碎,采用胰蛋白酶和DNAseⅠ共同消化,分3个阶段,每个阶段在恒温37℃下180r/min消化2min。重悬消化产物,200目筛网过滤后采用Percoll密度梯度分离液分离,分别收集滋养细胞层和胎盘间充质干细胞层。滋养细胞层以差速贴壁法去除成纤维细胞,胎盘间充质干细胞直接接种于75cm2培养瓶中培养。观察胎盘组织消化情况,计数滋养细胞数量及其细胞角蛋白7的表达,观察胎盘间充质干细胞生长增殖、表型及成骨分化潜能。结果与结论:经胰蛋白酶和DNAseⅠ消化后,胎盘组织仅剩少许残渣。差速贴壁后,滋养细胞数达(5.48±1.98)×108个,细胞角蛋白7阳性率为(90±4.36)%。胎盘间充质干细胞接种19～21d达90%融合,细胞数为(1.96±0.24)×106个,强表达CD29,CD44和HLA-ABC,不表达CD34,CD45,CD14和HLA-DR,诱导后茜素红染色呈鲜艳橙红色,可向成骨细胞方向分化。提示采用胰蛋白酶和DNAseⅠ共同消化胎盘组织,并结合Percoll不连续密度梯度分离液分离细胞,可同时一次性获得大量的滋养细胞和较多的胎盘间充质干细胞,细胞纯度和活性均较好。

MicroRNA-10a促进人胎盘间充质干细胞向内胚层细胞的分化

目的研究microRNA-10a(miR-10a)参与的转录后调控,提高人胎盘间充质干细胞(PMSC)向内胚层细胞分化的能力。方法利用慢病毒过表达miR-10a前体和反义寡核苷酸抑制miR-10a表达,分析miR-10a与其调控的靶基因Hoxa1的表达关系;并采用实时定量PCR(qRT-PCR)和免疫荧光细胞化学染色检测miR-10a过表达后,PMSC向内胚层细胞分化能力的变化。结果 PMSC中过表达和抑制表达miR-10a,能反向调控其靶基因Hoxa1的表达;miR-10a过表达后,内胚层细胞特异性基因FoxA2、Sox-17、Pdx-1和Cdx2的表达量显著上升,FOXA2、SOX-17和PDX-1阳性细胞数量明显增多。结论 miR-10a在化学诱导向内胚层细胞分化的PMSC中呈现高表达;miR-10a可能通过抑制其靶基因Hoxa1的表达,调控下游内胚层基因表达上调,从而促进胎盘间充质干细胞向内胚层细胞分化。

人胎盘间充质干细胞4种消化分离方法的效果比较

背景:目前已从多种组织器官中分离出间充质干细胞,如何更高效地获取大批量纯度佳的干细胞仍是研究目标之一。目的:对人胎盘间充质干细胞采取4种不同的消化分离方法,比较其分离效果。设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2007-07/2008-01在暨南大学医学院血液病研究所完成。材料:胎盘标本来源于足月正常剖宫产胎儿,由暨南大学附属第一医院提供。胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ为GIBCO产品,羟乙基淀粉为B.BRAUN产品,淋巴细胞分层液为上海试剂二厂产品。方法:胎盘组织剪碎后平均分为4组:胶原酶Ⅳ+羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+淋巴细胞分层液分离组、胶原酶Ⅱ+氯化铵裂解红细胞组,5份标本/组。将第1组置于1g/L胶原酶Ⅳ中,另外3组置于1g/L胶原酶Ⅱ中,37℃消化45min。过筛后收集各组细胞悬液,按组别对应施以羟乙基淀粉沉淀法、淋巴细胞分层液分离法、氯化铵裂解红细胞法进行分离。主要观察指标:观察4种方法在获取细胞数、培养成功率、细胞出现伸展时间、原代培养时间方面的差异,并对培养得到的细胞进行表面标志检测。结果:与胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组比较,其余3组获取的细胞数均明显减少(t=2.92～8.16,P<0.05)。在其他条件相同的情况下,胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组培养成功率为100%,其余3组分别为80%,80%,20%。胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组细胞出现伸展时间及原代培养时间均短于胶原酶Ⅱ+淋巴细胞分层液分离组(t=5.27～5.37,P<0.05),亦短于胶原酶Ⅳ+羟乙基淀粉沉淀组(2.46～2.50,P<0.05)。流式细胞仪检测示第3代人胎盘间充质干细胞强表达透明质酸受体CD44和整合素家族成员CD29,不表达造血干细胞标志CD34和CD45,也不表达内皮细胞标志CD106及HLA-DR。结论:使用胶原酶Ⅱ消化胎盘组织,结合羟乙基淀粉沉淀法能较好地分离人胎盘间充质干细胞。

胎盘源间充质干细胞分离提取的新方法

背景:胎盘是获取间充质干细胞的理想来源,在干细胞治疗和再生医学中具有潜在广泛的用途,建立高效分离提取方法有助于其存储和临床应用。目的:分析组织绞碎加酶液消化法培养人胎盘间充质干细胞的生物学特性。方法:采用组织绞碎加酶液消化法分离、富集胎盘组织中间充质干细胞,应用流式细胞术检测细胞表面标记,MTT法分析增殖能力,并采用诱导剂定向诱导胎盘间充质干细胞成脂、成骨和成软骨分化。结果与结论:胎盘组织来源间充质干细胞在体外可稳定长期传代培养,应用流式细胞仪检测结果显示CD73、CD90、CD105表达阳性,CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR表达阴性。胎盘间充质干细胞增殖活跃,第3-5天进入对数生长期,第6天进入平台期。经诱导后,胎盘间充质干细胞具有向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化的潜能。结果表明联合利用组织绞碎和酶液消化法可高效获取胎盘间充质干细胞,在体外培养过程中生长稳定,增殖能力强,可长期传代。

γ干扰素上调人胎盘间充质干细胞PD-L1表达并增强其诱导脐血和外周血T细胞向IL-10^+T细胞的分化

目的比较人胎盘间充质干细胞(h PMSC)对脐血和外周血IL-10^+T细胞分化的调节作用,并探讨γ干扰素(IFN-γ)在其中的作用机制。方法应用酶消化法分离、培养h PMSC;反转录PCR和流式细胞术分别检测程序性死亡蛋白配体1(PD-L1)在h PMSC的表达;Ficoll密度梯度离心法分离脐血和健康成人外周血单个核细胞,并用红细胞花环法纯化T细胞;用植物血凝素(PHA)活化T细胞并与h PMSC进行共培养,流式细胞术分别检测在阻断型PD-L1 m Ab和IFN-γ预刺激的条件下h PMSC对脐血和外周血T细胞向CD4^+IL-10^+T细胞、CD8^+IL-10^+T细胞分化的诱导作用。结果 h PMSC可诱导脐血和外周血T细胞向CD4^+IL-10^+T细胞、CD8^+IL-10^+T细胞分化,且对外周血T细胞向IL-10^+T细胞分化的诱导能力明显高于对脐血T细胞向该细胞分化的诱导能力;IFN-γ预处理h PMSC后,h PMSC促进脐血和外周血T细胞向IL-10^+T细胞分化能力明显增强;h PMSC高表达PD-L1,IFN-γ可明显上调其在h PMSC上的表达;阻断PD-L1在h PMSC上表达后,脐血、外周血中CD4^+IL-10^+T细胞、CD8^+IL-10^+T细胞比例均明显降低。结论 h PMSC诱导外周血T细胞向IL-10^+T细胞分化的能力明显高于其诱导脐血T细胞向该细胞分化的能力。IFN-γ可通过上调PD-L1在h PMSC上的表达,增强h PMSC对脐血和外周血T细胞向IL-10^+T细胞分化的诱导能力。

胎盘间充质干细胞修复受损子宫内膜

背景:胎盘间充质干细胞来源丰富,易于获取,可向成骨细胞、神经细胞及肝细胞等方向分化,临床应用不存在免疫排斥、不涉及伦理问题等优点,因此被认为是成体干细胞的理想来源。目的:观察同种异体胎盘间充质干细胞移植修复大鼠子宫内膜损伤的情况。方法:取雌性SD大鼠,通过热损伤法建立子宫内膜损伤模型,造模后第15天,将造模成功的40只大鼠随机分为4组,宫腔移植组于宫腔局部注射同种异体胎盘间充质干细胞悬液1 m L,宫腔对照组于宫腔注射等量的PBS,尾静脉移植组于尾静脉注射同种异体胎盘间充质干细胞悬液1 m L,尾静脉对照组于尾静脉注射等量PBS。于大鼠第3个动情期时将造模雌鼠与雄鼠合笼,观察阴栓,在观察到阴栓的当天处死造模大鼠,游离出子宫组织,进行子宫内腺体计数、免疫组织化学及Western blot检测。结果与结论:(1)腺体计数:宫腔移植组子宫内膜腺体数量多于其余3组(P<0.05),尾静脉移植组多于宫腔对照组、尾静脉对照组(P<0.05);(2)子宫内膜整合素αVβ3表达:免疫组织化学及Western blot检测均显示宫腔移植组整合素αVβ3强于其余3组(P<0.05),尾静脉移植组多于宫腔对照组、尾静脉对照组(P<0.05);(3)结果表明:胎盘间充质干细胞移植可不同程度地修复大鼠子宫内膜损伤组织,增加子宫内膜腺体计数,改善子宫内膜容受性。

人胎盘源与人骨髓源间充质干细胞的生物学特性的比较及负性协同刺激分子PD-L1的表达

目的:比较人胎盘源间充质干细胞(PMSCs)与人骨髓源间充质干细胞(BMSCs)的生物学特性,研究负性协同刺激分子PD-L1在胎盘源MSCs的表达和生物学意义。方法:采取酶消化法分离人胎盘组织,用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,分别进行贴壁分离和传代培养,通过倒置相差显微镜观察细胞形态,并用免疫荧光标记和流式细胞仪检测细胞表面标志的表达做比较性分析。混合淋巴细胞反应,3H-TdR掺入和PD-L1单克隆抗体阻断实验进行免疫功能检测。结果:在贴壁生长、呈成纤维细胞样形态、表达CD29、CD105、CD166和不表达CD34、CD45、CD80、CD86及HLA-DR分子以及向成脂肪细胞方向诱导分化等方面,人PMSCs与BMSCs细胞生物学特性表现相同或相似。表型分析发现PMSCs高表达PD-L1,而BMSCs较低表达PD-L1。PMSCs表达的PD-L1具有对T细胞体外增殖的抑制作用。结论:人胎盘源MSCs与人骨髓源MSCs有相似的细胞生长特性,却有不同的表达负性协同分子PD-L1的特性。