小鼠胚胎干细胞条件培养液培养的人角膜内皮细胞在脱细胞猪角膜基质上单层细胞片的构建

背景 目前角膜供体来源短缺,且体外培养的人角膜内皮细胞（HCECs）难以再生和扩增,为临床上角膜移植的开展带来了很大困难,组织工程角膜的构建仍是研究的主要课题.前期研究已证实,小鼠胚胎干细胞条件培养基（ESC-CM）能够促进体外HCECs的增生,脱细胞猪角膜基质（APCS）是较好的支架材料,但ESC-CM培养的HCECs是否能在APCS上融合成单层细胞鲜见研究. 目的 研究ESC-CM培养的HCECs在APCS上是否能够形成单层细胞. 方法 用小鼠ESC-CM培养液培养小鼠ES-E14细胞,收集培养上清液,离心后按体积比1∶3与人角膜内皮细胞培养液（CEM）混合,制备体积分数25％ ESC-CM液.取穿透角膜移植术后剩余的供体人角巩膜缘组织,采用组织块培养法用ESC-CM对HCECs进行培养和传代,采用逆转录PCR法检测HCECs中Ⅷ型胶原蛋白（ColⅧ）与神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达以鉴定细胞.取猪角膜,利用磷脂酶A2和碳酸氢盐溶液脱细胞法制备APCS,将第2代HCECs混合液按照800/mm2的密度种植于灭菌的APCS上进行培养,于倒置相差显微镜下观察细胞形态,采用苏木精-伊红染色法观察培养细胞的组织结构;采用免疫荧光法检测构建的HCECs单细胞片中闭锁小带蛋白-1（ZO-1）和Na＋-K＋-ATP酶的表达. 结果 体外培养的HCECs呈典型的六角形,内皮特异性标志物ColⅧ和NSE mRNA表达阳性.脱细胞APCS呈白色透明状,苏木精-伊红染色显示APCS中无角膜细胞,但角膜胶原纤维排列规则.第2代HCECs复水后可在APCS上生长并贴附,培养后7d融合成单层细胞片,细胞片上HCECs的细胞密度为（2 694± 143）/mm2.构建的HCECs片中内皮细胞泵功能相关蛋白ZO-1和Na＋-K＋-ATP酶均呈阳性表达,呈红色荧光. 结论 25％ESC-CM可促进HCECs的生长并维持细胞的正常形态,APCS可为HCECs片的构建提供支架和较好的生存微环境.在APCS形成的HCECs单细胞片可表达HCECs泵功能,是角膜移植的良好供体.

骨髓基质细胞条件培养液调节神经干细胞分化有效成分的蛋白质微阵列分析

目的检测骨髓基质细胞条件培养液(N-CM)中诱导神经干细胞(NSCs)向神经元方向分化的细胞因子,探讨骨髓基质细胞(BMSCs)调节NSCs分化的机制。方法将收集到的N-CM混匀后经超滤浓缩分为大于5kD和小于5kD两部分,用这两部分培养液分别培养NSCs,确定其中能促进NSCs分化为高比例神经元的部分并进行大鼠蛋白质微阵列检测。结果N-CM分子量大于5kD的部分可以促进NSCs分化为高比例神经元,并通过蛋白质微阵列检测,与单纯骨髓基质培养液相比,有7种细胞因子的表达量上调了1.5倍,分别是CINC-3、CNTF、IFN-γ、IL-1α、MCP-1、TIMP-1和VEGF。结论BMSCs分泌的可溶性分子对NSCs分化为神经元有促进作用,其中某些分子量大于5KD的细胞因子可能在这一调节作用中发挥效应。

条件培养液对兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响

目的 :观察条件培养液对兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响。 方法 :分离兔骨髓 ,培养骨髓基质细胞 ,传代细胞分别用标准培养液和加入 β 甘油磷酸钠 ,地塞米松和抗坏血酸制成的条件培养液培养 ,观察不同培养液下骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素含量。 结果 :在条件培养液下 ,骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素含量明显高于标准培养液下的含量。 结论

ERK1/2信号转导通路对骨髓基质细胞条件培养液诱导大鼠中脑神经干细胞分化作用的影响

目的:探讨ERK1/2信号转导通路在骨髓基质细胞条件培养液(BMSCs-CM)诱导大鼠中脑神经干细胞(NSCs)分化中的作用。方法:将神经干细胞球种植干预先包被多聚赖氨酸的35 mm的培养皿中.神经干细胞球约30 min后贴壁.自然分化组将培养液换为含2%B27的neurobasal培养液,对照组换为BMSCs-CM.抑制剂组将培养液换为含有信号转导通路抑制剂PD98059(5μmol/L)的BMSCs-CM.7 d后采用免疫荧光染色方法观察NSCs后代细胞中神经元和星形胶质细胞的数量比例与形态差别。结果:用成年大鼠BMSCs-CM体外培养新生大鼠中脑NSCs.自然分化组NSCs分化的神经元为(15.7±10.3)%[低干对照组的(51.17±10.30)%.P<0.05],星形胶质细胞为(66.9±14.8)%[明显高于对照组的(23.26±5.60)%.P<0.05]。而抑制剂组神经元所占比例为(39.48±7.29)%[明显低于对照组.P<0.01].星形胶质细胞的比例为(31.01±8.96)%[明显高干对照组,P<0.01]。结论:BMSCs-CM可以提高神经干细胞分化为神经元的比例.并且同时降低了其分化为星形胶质细胞的比例,这两种作用很可能是通过ERK1/2信号转导通路实现的。

三类骨髓基质细胞条件培养液体外扩增巨核系细胞

为了研究骨髓成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞条件培养液对巨核细胞的体外扩增作用,本文通过分离纯化骨髓成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞,收集无血清骨髓成纤维细胞条件培养液(fibroblast conditioned medium,F-CM)、骨髓内皮细胞条件培养液(endothelial cell conditioned medium,E-CM)和骨髓巨噬细胞条件培养液(macrophage conditioned medium,M- CM),分别离心、超滤,获得原液、分子量(MW)>10 kDa组分及MW<10 kDa组分。将三种无血清条件培养液及其> 10 kDa组分和<10 kDa组分,分别加入巨核细胞体外液体培养体系,观察成熟巨核细胞的生成。结果表明:F-CM和E-CM 及其>10 kDa组分加入培养体系后,成熟巨核细胞的生成显著增多,分别为对照组的(287.33±16.77)%、(141.21±17.47)%、(236.67±39.72)%和(179.03±30.98)%;F-CM的作用明显大于E-CM(P<0.001);F-CM和E-CM的<10 kDa组分、M-CM 及其>10 kDa组分和<10 kDa组分加入培养体系后成熟巨核细胞数无明显改变。分别将F-CM、E-CM、M-CM加入巨核细胞液体扩增体系,24 h后取细胞作巨核细胞集落形成单位(colony forming unit-megakaryocyte,CFU-Meg)的测定。结果表明:F-CM和E-CM对CFU-Meg生成均有促进作用,M-CM对CFU-Meg生成无明显影响,扩增强度分别为扩增前的(168.18 ±30.24)%、(215.17±17.4)%和(85.0±7.0)%。逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT- PCR)实验结果表明:骨髓成纤维细胞表达促血小板生成素(thrombopoietin,TPO),不表达转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1);骨髓内皮细胞表达TGF-β1,不表达TPO。上述结果提示:F-CM、E-CM及其>10 kDa组分均对巨核系成熟细胞及巨核系祖细胞体外扩增有促进作用;F-CM对巨核系成熟细胞体外扩增的促进作用强于E-CM。

骨髓基质细胞条件培养液联合TPO体外扩增巨核系细胞

目的:探讨骨髓成纤维细胞条件培养液(F-CM)和骨髓内皮细胞条件培养液(E-CM)分别联用TPO对巨核系细胞的体外扩增作用。方法:分别收集纯的F-CM和E-CM,观察它们分别与TPO联用后对体外扩增成熟巨核细胞和巨核系祖细胞的作用。结果:F-CM或E-CM与TPO联用后对巨核系成熟细胞的扩增作用明显优于F-CM或E-CM单用(P<0.01或P<0.05);F-CM+TPO的扩增效果明显优于E-CM+TPO或SCF+TPO+IL-3+IL-6的扩增效果(P<0.01或P<0.05);F-CM或E-CM联合TPO后对祖细胞的扩增作用无明显改变(P>0.05)。结论:F-CM与TPO联用后可显著提高它们对成熟巨核细胞体外扩增的效率,其作用优于SCF+TPO+IL-3+IL-6;F-CM或E-CM与TPO联用后对巨核系祖细胞体外扩增作用与二者单用无显著差异。

人胎肝基质细胞培养上清液中造血生长因子的分析

采用人胎肝造血基质细胞的体外液体培养技术,结合造血干细胞和祖细胞的体外测试方法,研究了造血基质细胞所释放的造血生长因子与造血干细胞和祖细胞之间的相互作用。结果表明,在适宜的条件下,人胎肝造血基质细胞可在体外传代培养达100d之久。培养过程中,对不同时间收集的培养上清液进行测试的结果表明,这些贴壁细胞可以不断地释放多种造血活性物质。在100d培养过程中,上清液中始终都可以检出CFU-S增殖刺激物活性。培养第24天的上清液中还可检出BPF和GM-CSF活性。这些造血活性物质对CFU-S的生理状态和祖细胞的增殖与分化有着深刻的影响。但是在培养上清液中未检出IL-3样活性物质。

小鼠胎肝造血基质细胞株的建立及生物学特性和功能研究

小鼠胎肝造血基质细胞经原代和传代培养并克隆成细胞株。该细胞株单层贴壁生长,核分裂相较多,有丝分裂指数较高,生长有赖于马血清的存在,有密度依赖抑制现象,染色体众数4n近80者常见。在半固体培养中无集落形成,ConA凝集试验阴性。该细胞株能双向调控红系和粒系造血,其刺激性影响主要由体液因子介导,其抑制性作用尚含细胞间短距离的调节因素。其培养上清液包括无血清培养上清液具有支持红系和粒系造血祖细胞增殖分化的活性,文中讨论了实验结果与胎肝临床疗效间的可能关系。

人蜕膜基质细胞条件培养液对滋养细胞浸润功能的影响

胎盘滋养细胞的适度浸润是成功妊娠过程中胚胎植入与胎盘形成的必要条件。有研究表明母体的蜕膜微环境能影响滋养细胞的浸润能力。然而，目前滋养细胞有节制侵入子宫内膜的机制尚不明确。本研究通过体外培养人早孕正常蜕膜基质细胞，收集基质细胞条件培养液（DSCM）用以处理正常人早孕滋养细胞系（B6Tert），

小鼠胎肝基质细胞高活性造血刺激因子的纯化及性能研究

对我室克隆的小鼠胎肝基质细胞林(MFLSC株)的无血清培养上清中的造血活性物质进行了初步纯化。通过离子交换层析和凝胶过滤层析两步分离,从中得到一高活性的造血刺激因子,称为基质细胞造血刺激因子-1(SHF-1)。经凝胶过滤及电泳结果估测,此因子是分子量约为70kD的单体蛋白,耐碱,较耐热。在体外它对小鼠骨髓粒系、红系祖细胞、多向祖细胞及多能造血干细胞均有刺激作用。

小鼠胎肝基质细胞造血刺激因子体外生物活性研究

本实验对基质细胞造血刺激因子－１（ＳＨＦ－１）的体外生物活性进行了研究。结果表明，ＳＨＦ－１可刺激小鼠骨髓ＣＦＵ－Ｅ、ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｍｉｘ集落的形成，它产生的这些广泛造血刺激作用是其自身所具活性的直接影响。正常小鼠骨髓细胞与ＳＨＦ－１在体外孵育４ｈ，其中ＣＦＵ－Ｓ的自杀率可提高约１０％，显示它对造血干细胞也有诱导增殖作用。

鼠根端乳头条件培养基诱导下的牙周膜细胞膜片与牙本质管和煅烧骨间的牙周膜再生

目的利用鼠根端乳头条件培养基(APTG-CM)与牙周膜细胞(PDLCs)建立间接共培养体系,探讨牙周组织再生的研究。方法胶原酶联合组织块法获得人PDLCs,用波形蛋白和角蛋白鉴定PDLCs的来源。APTG-CM诱导PDLCs 28 d,通过免疫细胞化学法检测PDLCs中骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原(COLⅠ)、骨涎蛋白(BSP)的表达;观察细胞外部形态。体外构建牙本质管与牙周膜细胞膜片和煅烧骨(CBB)颗粒移植体,植入裸鼠皮下8周,观察牙周组织再生情况。结果体内实验结果显示:经过APTG-CM诱导后,PDLCs在牙本质和CBB表面均有牙骨样基质形成,且在CBB表面有纤维组织的黏附和垂直嵌入。对比而言,PDLCs的生长在CBB的表面要好于在牙本质管。而对照组无纤维的垂直嵌入。结论经过APTG-CM孵育的PDLCs有向成牙骨质细胞谱系转化的功能,APTG-CM有利于牙周组织再生。

小鼠胎肝和骨髓造血基质细胞贴壁层对红系祖细胞生长的影响

本实验以Dexter培养体系作小鼠胎肝和骨髓造血基质细胞贴壁培养。在所获的基质细胞贴壁层上作红系造血祖细胞集落培养,观察两种来源造血基质细胞对红系集落生长的影响。实验结果表明,胎肝造血基质细胞贴壁层能明显促进早期红系造血祖细胞(BFU-E)形成集落,却不明显影响晚期红系造血祖细胞(CFU-E)的生长。成年小鼠骨髓造血基质细胞贴壁层对BFU-E和CFU-E均有刺激生长的作用;但对前者生长的刺激性影响较胎肝造血基质细胞贴壁层为弱。造血基质细胞贴壁层对红系集落生长的促进作用主要是通过体液因子实现的,细胞间短距离调节的影响亦不能除外。

2类小鼠胎肝基质细胞的生物学特征及表达谱分析

目的·探究不同类型小鼠胎肝基质细胞在细胞形态、分子特征和生物学功能上的差异。方法·通过体外贴壁培养的方式获取13.5 d小鼠胎肝基质细胞,根据细胞形态及其表面标志物CD44、CD29、CD106、CD45及Sca-1的表达差异,区分不同的细胞类型。使用小鼠基因组阵列4302.0基因芯片在P<0.05、差异倍数>3或<-2的标准下筛选差异基因,并使用IPA(ingenuity pathway analysis)软件对典型信号通路和生物学功能进行分析。结果·依据细胞形态的不同,分离出2类胎肝基质细胞,即短梭形细胞(CD45^+CD106^-CD29^+CD44^+Sca-1-)和成纤维样细胞(CD45^-CD106^+CD29^+CD44^+Sca-1^-)。前者共筛选出1485个高表达基因,主要参与免疫炎症相关的信号通路;后者共筛选出3374个高表达基因,主要参与细胞外基质形成及细胞间黏附。结论·小鼠胎肝基质细胞在生物学特征及功能上具有较强的异质性,在促进造血干细胞的增殖方面可能存在差异。

小鼠胎肝基质细胞体外扩增骨髓来源的LTC-IC

基质细胞是胎肝造血微环境的主要成分 ,参与造血干 祖细胞的自我更新、增殖分化的调控。为了研究小鼠胎肝基质细胞在造血微环境中的功能 ,采用转染SV40大T抗原基因的方法建立了小鼠胚胎期第 12 5天 (Embry onicday 12 5 ,E12 5d)胎肝基质细胞系A4、B3 ,并进一步鉴定基质细胞系的一般细胞生物学特性和造血支持功能。结果 :A4、B3为细胞形态、生长行为以及表面分子表达不同细胞系 ,二者均可维持骨髓源长期培养启动细胞 (Long termculture initiatingcell,LTC IC)至少 4周并且有不同程度的扩增LTC IC能力 ,其中B3扩增LTC IC的能力是A4的8 3倍。外源性细胞因子组合SCF +IL 3 +IL 6+Epo在本实验体系中不影响LTC IC数量的维持和扩增。暗示E12 5d胎肝造血微环境中基质细胞的功能是不同的 。

非转化集落来源的胎肝基质细胞系的建立及鉴定

为研究胎肝基质细胞在调控造血方面的作用,需要对基质细胞进行分离和扩增。利用早期胎肝细胞原代培养上清液具有刺激基质细胞增殖的活性,得到了4个集落来源的胎肝基质细胞系,其中最长的体外培养时间达3个多月。基质细胞经液氮冻存复苏后能保持生长增殖能力。基质细胞系的细胞化学染色显示碱性磷酸酶阴性(AkP)、酸性磷酸酶阳性(AcP^+)和非特异性酯酶阳性(NSE^+)。基质细胞有吞噬鸡红细胞的功能。免疫细胞化学染色的结果为:波形蛋白阳性(vimentin^+)、巨噬细胞抗体-1阳性(macrophage Ab-1^+),巨噬细胞抗体-2 阳性(macrophage Ab-2^+),CD15^-,CD45RA^-,CD71^-,纤连蛋白阳性(fibronectin^+)和胶原IV型阴性(collagen IV^-)。研究表明此基质细胞系的成分为巨噬细胞。建立非转化的、集落来源的胎肝基质细胞系的方法是可重复的。所获得的基质细胞系为研究胎肝造血微环境中基质细胞的作用提供了基础。

小鼠胎肝基质细胞系MFLC自发分泌多种细胞因子

在无外源刺激条件下,我室所建小鼠胎肝基质细胞系MFLC可自发分泌多种类型细胞因子,其中IL-6及化学趋化因子水平较高,GM-CSF水平较低,但未检测到IL-3及IL-7活性。此细胞上清对小鼠骨髓造血干细胞有明显的促集落形成效应,并呈现剂量依赖关系,所形成的集落以CFU-GMM及CFU-GM为主;此细胞上清还促进5-Fu耐受小鼠骨髓造血干细胞的集落形成,提示上清中存在SCF样活性成份。上述结果表明,MFLC的建立有利于分析干细胞在胎肝内如何向pro-T细胞分化发育的机理并有利于阐明细胞因子网络调节在其中的作用。

甲胎蛋白及其异质体、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和基质金属蛋白酶2联合检测在肝细胞癌中的诊断价值

目的检测血清中甲胎蛋白(AFP)及其异质体(AFP-L3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)和基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达水平,探讨四项指标的联合检测对HCC的诊断价值。方法选取2019年12月至2020年12月于成都市公共卫生临床医疗中心住院的60例肝细胞癌患者为肝癌组,均经肝组织学检查确诊。60例肝硬化患者为肝硬化组,60例慢性乙型肝炎患者为慢性乙肝组,诊断符合防治指南。选择同期体检的60例健康者作为对照组。使用化学发光法及酶联免疫双抗体夹心法分别检测外周血清AFP及AFP-L3、GPC3、MMP2的水平。统计分析各组研究对象血清标志物的差异,计算联合检测的诊断效率。结果肝癌组的血清AFP、AFP-L3和GPC3、MMP2水平均明显高于慢性乙肝组、肝硬化组及对照组(M=122.3μg/L、88.33μg/L、53.45pg/ml、701.3μg/L;H=125.8、167.5、209.4、210.4;均P<0.05)。4项指标联合检测的诊断准确率为89.3%,灵敏度与特异度分别为84.87%与84.59%,其曲线下面积(AUC)为0.905,均高于单项检测,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论AFP及AFP-L3、GPC3和MMP2均为HCC的危险因素,其联合检测可以提高HCC的阳性检出率,有助于其高危患者肿瘤的早期诊断、治疗,延长患者生存时间,提高生存率。

人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析

为了筛选在主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞中差异表达的基因,以药物流产的孕30-35天的人胚胎AGM区来源基质细胞为“实验方”,以源自意外而致流产的孕4-5月的水囊引产的胎儿肝组织的基质细胞为“驱动方”,建立了在人AGM区基质细胞中差异表达基因的消减杂交文库。进一步用基因芯片技术对所建立的抑制消减杂交文库进行筛选,并挑选其中明显差异表达的18个克隆进行序列测定和同源性分析。结果表明在所构建的AGM抑制消减杂交文库中,经过PCR鉴定有特异性扩增带且扩增带分子量在200-700bp的克隆有211个,阳性率高达76.4%。经过基因芯片筛选,挑选出ratio值大于5的克隆共18个进行序列测定显示,在测序的18个明显差异表达的阳性克隆中,4个为未知基因,14个为已知基因,其中这些已知基因分别参与了细胞迁移、分化、生长、细胞周期、信号转导及血管发生等细胞重要生命过程。这些基因大多数在胚胎分化造血发育中的作用尚未见报道。结论筛选AGM区基质细胞中差异表达的基因为进一步研究胚胎造血发育的分化调控的分子机理提供了必要的理论基础。