人胎肝cDNA文库的免疫学筛选

用人胎肝组织粗提物多克隆抗体对构建的人胎肝ｃＤＮＡ文库进行免疫学筛选，筛选约１０６重组子后，得到９株阳性克隆。５株阳性克隆核苷酸序列表明：３株为α１珠蛋白ｃＤＮＡ序列，２株为未报道序列。

人胎肝cDNA文库的构建

从水囊引产的5^+月孕龄胎儿肝脏中提取RNA,分离含poly(A)尾的信使RNA[poly(A)^+mRNA],合成双链cDNA,定向插入λgtll表达载体,转染Y1090受体菌,构建了人胎肝cDNA文库。该文库有1.35×10~6个噬菌体,重组率为87.5％,可用寡核苷酸探针和单克隆抗体两种方法筛选目的基因。

20周人胎脑cDNA文库的构建

为了研究舰船有害气体、噪声、磁场等特殊环境下人脑特异性基因表达的变化情况 ,构建了一个 2 0周人胎脑cDNA文库 ,实验从胎脑组织中抽提总mRNA后 ,经过一系列酶反应后合成cDNA ,分级分离柱除去小片段后克隆到λgt1 0载体 ,转染宿主菌E .coli.C6 0 0hf1后文库的包装效率为 4 .6× 1 0 6pfu/μg ,cDNA平均插入片段大于 1 .

人胎肝cDNA文库的构建

从水囊引产的4～5个月孕龄胎儿肝脏中提取mRNA,合成单、双链CDNA,用离心式柱层析去除短的cDNA片段,加上EcoRI接头,与去磷酸化的λgt 11 DNA-EcoRI长、短臂连接,体外包装后感染Y1090,建成含4.05×10~5重组子的表达型人胎肝cDNA文库。白斑噬菌体DNA经酶切鉴定表明均含1kb以上大小不等的CDNA片段。

HNP-3相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

目的筛选胎肾上腺cDNA文库中与人中性粒细胞多肽(HNP-3)成熟肽具有相互作用的蛋白分子。方法通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功获得HNP-3成熟肽基因,并将其插入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转染酵母细胞AH109,而后经缺陷性培养基上培养并观察pGBKT7-HNP-3在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能。同时收集胎肾上腺,提取RNA,通过自我检测、分析、报告技术(SMART技术)制备人胎肾上腺cDNA文库。并采用Match-maker LexA酵母双杂交系统从胎肾上腺cDNA文库中筛选与HNP-3成熟肽相互作用的蛋白。最后通过PCR筛选获得阳性克隆并测序,通过回转实验,谷胱甘肽巯基转移酶沉降技术(GST pull down)以及免疫共沉淀实验再次验证二者的相互作用关系。结果成功构建诱饵质粒pGBK-T7-HNP-3以及胎肾上腺cDNA文库并在酵母细胞中正确表达,筛选获得HNP-3成熟肽相互作用的蛋白——促肾上腺皮质激素受体(ACTH-R)2、钙粘着蛋白关联蛋白1(CTNNB1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)、成对样同源域转录因子2(PITX2)等。最终选定ACTH-R作为主要研究对象,且经GST pull down以及免疫共沉淀实验获得了证实二者间具有相互作用的相应的条带。结论从胎肾上腺cDNA文库中成功筛选得到α防御素HNP-3成熟肽相互作用蛋白——ACTH-R。

人巨细胞病毒UL135蛋白结合蛋白的酵母双杂交筛选

目的利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL135编码蛋白相互作用的蛋白。方法将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL135转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA转化到含有pGBKT7-UL135的酵母细胞中,筛选与HCMVUL135编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果最终确认60个克隆与HCMVUL135编码蛋白相互作用,其中2个克隆与Thy-1高度同源。结论成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMVUL135编码蛋白相互作用的蛋白,其中Thy-1在HCMV感染致病过程中可能起重要作用。

人巨细胞病毒UL145相互作用蛋白的筛选和功能分析

目的应用酵母双杂交系统筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL145编码蛋白相互作用的来源于人胎脑cDNA文库的组织蛋白。方法采用聚合酶链式反应扩增HCMV UL145片段,酶切及纯化扩增的目的片段及酵母表达载体p GBKT7,连接HCMV UL145片段及载体p GBKT7,将连接后的重组诱饵表达载体p GBKT7-UL145转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA也转化到酵母AH109中,筛选与HCMV UL145编码蛋白相互作用的蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果最终确认多个克隆与HCMV UL145编码蛋白相互作用,BLAST结果显示3个与FOXG1高度同源。结论利用酵母双杂交系统成功筛选出与HCMV UL145编码蛋白相互作用的人胎脑c DNA文库蛋白FOXG1,推测该目的蛋白在HCMV感染所致神经系统损伤过程中起重要作用。

与人巨细胞病毒UL132编码蛋白相互作用蛋白的初步筛选和鉴定

目的:探讨应用酵母双杂交系统筛选出与人巨细胞病毒(HCMV)UL132编码蛋白相互作用的人胎脑cDNA文库组织蛋白,阐明其在先天性巨细胞病毒感染中可能的致病机制。方法:采用聚合酶链式反应扩增HCMV UL132片段,酶切、纯化扩增的目的片段及酵母诱饵表达载体pGBKT7,连接HCMV UL132片段到载体pGBKT7上,将连接后的重组体pGBKT7-UL132转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA也转化到酵母AH109中,筛选与HCMV UL132编码蛋白相互作用的人胎脑文库蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果:成功构建诱饵表达载体pGBKT7-UL132,双酶切鉴定可见800及7 500bp 2条目的条带;转化文库质粒后计算转化效率为6.6×103 cfu·μg-1,显色反应显示有95个菌落呈蓝色,最终确认10个克隆与HCMV UL132编码蛋白相互作用,Blast结果显示7个克隆与CAML高度同源。结论:利用酵母双杂交系统成功筛选出与HCMV UL132编码蛋白相互作用的人胎脑cDNA文库蛋白CAML,推测该目的蛋白可能在HCMV感染所致神经系统损伤、病毒的入侵和增殖过程中发挥重要作用。

利用酵母双杂交筛选与DAT1的LIM2相互作用的蛋白质

目的 利用酵母双杂交系统筛选人胎脑组织中能与多巴胺相关转录因子DAT1的LIM2相互作用的蛋白质, 以初步了解DAT1的功能。方法 构建酵母双杂交诱饵质粒pLexA-LIM2,筛选人胎脑cDNA文库,并用酵母交配试验初步 验证。结果 获得3个能与DAT1的第2个LIM结构域LIM2结合的相互作用蛋白,通过酵母结合试验证实了它们在酵母 中的结合。结论 DAT1的第2个LIM结构域LIM2可与唐氏综合征关键区基因2(SimilartoDownsyndromecriticalregion gene2,DSCR2)、钙 整合素结合蛋白(calciumandintegrinbindingprotein,CIB)、和HSPC170(CD34+hematopoieticstem/progenitor cells,HSPCs)结合。

与人巨细胞病毒UL130编码蛋白相互作用蛋白的筛选

目的利用酵母双杂交技术筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL130表达产物有相互作用的细胞蛋白及其编码基因,了解其在宿主基因组中的地位功能。方法将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL130转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA转化到含有pGBKT7-UL130的酵母细胞中,筛选与HCMVUL130编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果最终确认9个克隆与HCMVUL130编码蛋白相互作用,其中2个克隆与突触小体相关蛋白(SNAP)高度同源。结论成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMVUL130编码蛋白相互作用的蛋白,其中SNAP在HCMV感染致病过程中可能起重要作用。

酵母双杂交技术筛选人巨细胞病毒UL131A的相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL131A编码蛋白相互作用的蛋白.方法:将成功构建的酵母诱饵表达载体pGB-KT7-UL131A转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA转化到含有pGBKT7-UL131A的酵母细胞中,筛选与HCMV UL131A编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对筛选得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果:成功构建酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL131A,并将其与人胎脑cDNA文库共转化到酵母细胞AH109中,最终确认有23种人胎脑文库蛋白与HCMV UL131A编码蛋白相互作用,其中一种与Thy-1蛋白高度同源,其同源性高达99%.结论:成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL131A编码蛋白相互作用的蛋白,其中Thy-1在HCMV感染致病过程中可能起重要作用.

人巨细胞病毒UL141编码蛋白相互作用蛋白的筛选和分析

目的应用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库中与人巨细胞病毒(HCMV)UL141编码蛋白相互作用的蛋白,以进一步研究HCMV UL141的生物学功能,为揭示HCMV先天感染机制奠定基础。方法采用PCR技术扩增HCMV-UL141基因片段,将其插入到pGBKT7载体中,构建成诱饵质粒pGBKT7-UL141。然后将pGBKT7 UL141转化到酵母感受态细胞AH109中,于一缺培养基(SD/Trp)上筛选生长。再将人胎脑cDNA文库质粒转化到含有pGBKT7-UL141质粒的AH109菌株中,在四缺培养基(SD/Trp/Leu/His/Ade)中筛选相互作用的人胎脑cDNA文库蛋白。通过显色反应挑选显蓝色的阳性克隆,提取相应质粒将其转化到大肠杆菌中,并进行回转验证。最后对筛选得到的阳性克隆进行测序及生物信息学分析。结果诱饵质粒pGBKT7UL141构建成功。筛选获得6个克隆与HCMV-UL141编码蛋白相互作用,其中1个基因编码人类染色质解旋酶DNA结合蛋白3(CHD3)。结论成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV-UL141编码蛋白相互作用的人体组织蛋白——CHD3,提示UL141蛋白可能与病毒的免疫逃避,干扰正常细胞的生长、分化相关。

人类ERMAP基因在不同胎龄胚胎组织中的表达

人类ERMAP（human erythroid membrane associated protein,hERMAP）基因是从人胎肝cDNA文库中筛选出来的新基因。通过Northern blot检测，提示其高度特异表达于胎肝、成人骨髓等造血组织以及K562细胞；通过荧火蛋白转染试验证实其位于292T细胞膜和其他胞质小体上，通过对其所编码的蛋白分子的分析显示其为一跨膜蛋白分子，属免疫球蛋白超家族成员。

人类抗砷相关基因hARRG全长cDNA的克隆和在E.coli中表达

通过对构建的人胎脑cDNA文库进行大规模测序 ,发现一条人类新基因 ,序列与仓鼠asr2序列高度同源 ,达 88% ,命名为人类抗砷相关基因 (humanarsenicresistancerelatedgene ,hARRG) .hARRG与抗砷基因相关序列ARS2 (AF0 82 871)几乎完全同源 ,仅比它短 2 5 3bp .hARRG并不是全长基因而仅是一个cDNA片段 .为了获得hARRG全长cDNA ,运用Northernblot ,电子RACE和 5′ SMART RACE的方法克隆了一条 2 999bp的hARRG全长cDNA ,通过Unigene染色体定位于 7q2 1.3,经过生物信息学分析发现 ,该cDNA有完整的读码框 ,编码一个 788个氨基酸的蛋白质 .预计分子质量为 89 2ku ,并在大肠杆菌中获得了成功表达 .

同卵双胎心脏畸形差异表达基因的分析

目的 寻找单卵双胎其一患房间隔缺损、肺动脉瓣狭窄 ,另一为正常儿童之间的差异表达基因。方法 依据该单卵双胎儿童的白细胞RNA合成cDNA探针 ,差示筛选 8～ 1 0周龄胎儿心脏cDNA文库 ,测定各组克隆的序列 ,结果与GenBank/EMBL/DDBJ核酸数据库进行同源性比较 ,所获ESTs进行功能分类 ,并比较患儿与正常儿童表达基因谱的差异。结果 获得在正常儿童表达高于患病儿童 ,或正常儿童表达而患病儿童不表达的已知基因有 34个 ,新ESTs有 5个 ;患病儿童表达高于正常儿童 ,或患病儿童表达而正常儿童不表达的基因有 4 1个 ,新ESTs有 7个。结论 一患先天性心脏病另一正常之单卵双胎儿童进行差示筛选 ,是寻找先天性心脏病相关基因和与心脏发育相关基因的有效方法。本研究发现了一些与先天性房间隔缺损、肺动脉瓣狭窄发生相关的ESTs。

筛选与分析与人巨细胞病毒UL133编码蛋白相互作用的蛋白

目的应用酵母双杂交技术筛选人胎脑c;;DOI:10.3969/j.issn.NA文库中与人巨细胞病毒(HCMV)UL/b′UL133编码蛋白相互作用的蛋白,为研究UL/b′编码蛋白的生物学功能,揭示HCMV先天感染的致病机制奠定基础。方法设计特异性引物,在引物上下游分别引入NdeⅠ和BamHⅠ限制性内切酶识别位点,采用PCR技术扩增HCMV临床分离株H株的UL133基因片段,将其扩增产物与载体pGBKT7同时使用NdeⅠ和BamHⅠ进行双酶切,纯化后,将UL133片段插入到pGBKT7载体上,构建诱饵质粒pGBKT7-UL133,并测序分析。利用醋酸锂小量酵母转化方法 ,将测序正确的诱饵质粒pGBKT7-UL133转化入AH109酵母感受态细胞中,然后将转化的菌液涂布在色氨酸缺陷型培养基(-Trp)上,筛选阳性菌落。再将人胎脑c;;DOI:10.3969/j.issn.NA文库质粒转化到含pGBKT7-UL133质粒的AH109菌株中,在四缺培养基(-Ade/-H is/-Leu/-Trp)中筛选,在铺有X-Gal的滤纸上进行显色反应,提取显蓝色的阳性酵母筛选质粒,运用电穿孔方法将其转化到TG1的大肠杆菌中,并行PCR鉴定,提取大肠杆菌中的文库质粒,并将其回转到含诱饵质粒pGBKT7-UL133的酵母菌株中,进行回转验证。对筛选到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果用于酵母双杂交筛选的诱饵质粒pGBKT7-UL133成功构建,含有诱饵质粒的酵母菌株在-Trp上生长。转化有人胎脑c;;DOI:10.3969/j.issn.NA文库和诱饵质粒pGBKT7-UL133的酵母菌AH109,在四缺培养基中观察到有28个酵母菌落生长,通过显色反应、酵母质粒转化及回转酵母细胞筛选得到4个阳性克隆。通过序列比对,发现在这些基因中,其中一个基因编码人类还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NA;;DOI:10.3969/j.issn.PH)依赖性氧化还原酶1。结论成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL/b′区UL133编码蛋白相互作用的蛋白-NA;;DOI:10.3969/j.issn.PH,提示UL133蛋白可能在增加病毒毒力和传染性,干扰细胞间的信号传导和细胞的生长、分裂、凋亡等方面发挥重要作用。

与人巨细胞病毒UL128两种不同结构蛋白相互作用蛋白的筛选与分析

目的 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与两种不同转录结构的人巨细胞病毒（HCMV）UL128编码蛋白相互作用的蛋白,比较两者相互作用蛋白之间的异同点.方法 通过3＇RACE和5＇RACE技术扩增出两种HCMV UL128片段,其大小分别为519 bp和642 bp,并将其成功构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7中.将以上两种酵母表达载体分别转化到酵母菌AH109中,再将文库DNA转化到已含有酵母表达载体的AH109中,筛选与两种片段大小不同的UL128编码蛋白相互作用的人胎脑蛋白,并对筛选得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果 筛出EFEMP2与UL128-519 bp编码蛋白相互作用,THY-1与UL128-642 bp编码蛋白相互作用.结论 成功构建pGBKT7 UL128-519 bp和pGBKT7 UL128-642 bp,并应用酵母双杂交系统分别筛选出EFEMP2和THY-1与UL128-519 bp和UL128-642 bp编码蛋白相互作用,在所筛选得到的相互作用蛋白之间未发现有相同的蛋白,UL128-519 bp和UL128-642 bp所编码的蛋白在HCMV感染致病过程中可能发挥不同的作用.