L-肉碱对H_2O_2诱导氧化应激FHM细胞的影响

[目的]本文旨在研究L-肉碱对氧化应激状态下胖头鱥肌肉细胞系(fathead minnow muscle cell line,FHM)细胞活力、脂质过氧化及抗氧化功能的影响。[方法]以FHM细胞为研究对象,以H_2O_2为氧化应激因子,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定不同浓度L-肉碱(0.001、0.01、0.1、0.5、1.0和5.0 mmol·L^(-1))预处理6 h分别对0.2和0.6 mmol·L^(-1)H_2O_2诱导的细胞氧化应激活力的影响,并采用生物化学方法检测L-肉碱预处理对氧化应激FHM细胞中脂质过氧化程度及抗氧化酶的变化。[结果]0.2和0.6 mmol·L^(-1)H_2O_2刺激FHM细胞1 h,细胞活力分别降低至72%和58%。与H_2O_2组相比,0.001~1.0 mmol·L^(-1)L-肉碱预处理使低氧化水平(0.6 mmol·L^(-1)H_2O_2)的FHM细胞活力显著升高;且0.001、0.5和1.0 mmol·L^(-1)L-肉碱均显著降低不同氧化水平细胞中MDA含量。与0.2 mmol·L^(-1)H_2O_2组相比,0.001、0.01、0.1和1.0 mmol·L^(-1)L-肉碱显著提高细胞T-GSH含量;0.001、0.01和1.0 mmol·L^(-1)L-肉碱显著提高细胞中T-SOD活性;0.5~5.0 mmol·L^(-1)L-肉碱组细胞中CAT活性显著增加;添加0.001~1.0 mmol·L^(-1)L-肉碱显著提高细胞GPx活性,但γ-GCS活性只有0.5 mmol·L^(-1)L-肉碱组显著升高。与0.6 mmol·L^(-1)H_2O_2组相比,0.001~1.0 mmol·L^(-1)L-肉碱显著提高细胞中T-GSH含量,0.01~5.0 mmol·L^(-1)L-肉碱显著提高细胞中CAT活性,0.001 mmol·L^(-1)L-肉碱显著提高细胞T-SOD活性,0.01 mmol·L^(-1)L-肉碱显著提升细胞γ-GCS活性;同时,L-肉碱的处理显著增强细胞GPx活性。[结论]高浓度(0.6 mmol·L^(-1))H_2O_2对FHM细胞的损害较大;0.001~1.0 mmol·L^(-1)L-肉碱可提高FHM细胞活力和抗氧化能力,并对细胞抵抗H_2O_2诱导的不同程度氧化应激有积极作用。

基于Nrf2/HO-1启动子筛选抗水生病毒药物的方法

为建立基于Nrf2、HO-1启动子活性的抗病毒药物筛选方法,实验以胖头鱥上皮细胞系(FHM)为材料,构建Nrf2、HO-1启动子重组质粒,利用双荧光素酶报告系统检测不同浓度(0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0μg/mL)的白藜芦醇、水飞蓟宾、穿心莲内酯及姜黄素对启动子活性的影响,并利用鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)和蛙虹彩病毒(rana grylio iridovirus,RGV)验证阳性药物的抗病毒效果。结果显示,Nrf2、HO-1启动子序列中存在FOX家族、IRF家族等多种转录因子的结合位点,并分别存在1个和3个与甲基化相关的CpG岛。双荧光素酶报告实验显示,水飞蓟宾、穿心莲内酯及姜黄素可激活Nrf2、HO-1启动子。药物浓度梯度实验显示,6.3μg/mL的姜黄素和穿心莲内酯可显著上调Nrf2和HO-1的启动子活性。病毒感染后的细胞病变效应、病毒的复制及病毒滴度结果均表明姜黄素和穿心莲内酯可抑制SVCV和RGV的感染。综上,本实验建立的pGL3-Nrf2和pGL3-HO-1启动子报告质粒,可用于抗水生病毒药物的筛选,也为Nrf2、HO-1转录调控机制的研究提供了工具。