甜菜夜蛾胚胎发育的研究(Ⅰ)——卵裂、胚盘、胚带的形成及胚层分化

本文详细研究了甜菜夜蛾spodopteraexigua(H櫣ｂｎｅｒ)胚胎发育的卵裂、胚盘、胚带的形成和胚层分化。甜菜夜蛾卵的周质分两层 ;卵裂时子核以“彗星”状活质体向卵表面迁移 ,形成胚盘 ;卵黄逐渐形成卵黄球 ,内有 1～ 2个消黄细胞 ;卵腹面的胚盘细胞逐渐增厚为胚带 ,其他胚盘细胞发育成浆膜 ,浆膜刚一形成 ,羊膜即开始发生 ;随着原肠沟的出现 ,胚带分化为里、外两层 ,外层将来形成外胚层 ,里层形成中胚层和内胚层。

中胚层分化蛋白2对视网膜色素上皮细胞吞噬功能的影响

目的:观察中胚层分化蛋白2对视网膜色素上皮细胞吞噬功能的影响。方法:采用人D407细胞和体外培养新生小鼠视网膜色素上皮细胞,加入不同剂量的纯化中胚层分化蛋白2,通过共聚焦显微镜及流式细胞术观察视网膜色素上皮细胞结合和内吞视杆细胞外节盘膜的情况。结果:中胚层分化蛋白2主要表达在视杆细胞外节盘膜层,与视杆细胞外节盘膜生物标志物视紫红质完全共定位,纯化的中胚层分化蛋白2可刺激人D407细胞及小鼠原代视网膜色素上皮细胞吞噬视杆细胞外节盘膜,吞噬体生物标志物Rab7与摄入的视杆细胞外节盘膜共定位,D407细胞吞噬视杆细胞外节盘膜与中胚层分化蛋白2的浓度呈剂量依赖性,但在达到饱和浓度后其吞噬能力下降,中胚层分化蛋白2可结合至视杆细胞外节盘膜及D407细胞表面。结论:中胚层分化蛋白2对视网膜色素上皮细胞吞噬功能有促进作用。

组蛋白去乙酰化修饰对非洲爪蛙胚胎发育及胚层分化的影响

目的:探讨组蛋白乙酰化修饰对非洲爪蛙胚胎早期发育以及三胚层分化的影响。方法:用400 nmol/L的曲古抑菌素A(trichostation A,TSA)处理2细胞时期的胚胎,观察胚胎发育的情况,并通过整体原位杂交的方法检测胚层标记基因的表达;通过显微注射组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1,HDAC1)特异性的反义寡核苷酸(HDAC1MO)实现HDAC1基因的敲降,利用整体原位杂交检测胚层标记基因的表达。结果:TSA处理造成胚胎发育异常,TSA处理和敲降HDAC1影响胚层标记基因的表达。结论:组蛋白去乙酰化酶在胚胎早期发育的过程中参与胚层的分化。

DNA甲基化修饰对非洲爪蛙胚层分化的影响

目的:探讨DNA甲基化修饰对非洲爪蛙三个胚层分化的影响。方法:用30μmol/L的5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-AZACdR)处理胚胎,抑制早期胚胎细胞内DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)的活性,观察胚胎的表型,并收集原肠期胚胎通过原位杂交检测三胚层标记基因的表达情况;显微注射DNMT1特异的反义寡核苷酸(DNMT1MO)以敲降胚胎细胞内DNMT1的表达,然后通过原位杂交检测胚层标记基因的表达情况。结果:5-AZA-CdR处理导致胚胎早期发育异常,抑制中胚层标记基因Xbra的表达。敲降DNMT1促进背部中胚层标记基因GSC和Chordin的表达,抑制腹部中胚层标记基因Wnt8的表达。结论:DNA甲基化转移酶参与调节非洲爪蛙三胚层分化形成的过程。

高浓度RA对拟胚体胚层分化的影响

目的 探讨维甲酸（RA）在拟胚体分化中对胚层分化的影响.方法 将胚胎干（ES）细胞悬浮培养形成胚胎小体（Embryonic bodies,EBs）,用高浓度RA诱导,利用免疫荧光和RT-PCR方法比较RA对三胚层分化的影响.结果 高浓度RA诱导EBs中神经外胚层的基因和蛋白表达,抑制中胚层和内胚层的基因和蛋白表达.结论 RA在胚胎干细胞分化早期就决定了胚层的分化,高浓度RA促进神经胚层分化.

三氧化二砷通过下调TET2促进Nanog甲基化并抑制胚胎干细胞向中胚层分化

目的研究三氧化二砷(ATO)调节胚胎干细胞(ESC)的中胚层分化和分化相关基因的表达。方法构建10-11易位2蛋白(TET2)的敲低慢病毒载体(shTET2)和过表达慢病毒载体(pVd-TET2),阴性对照分别为shNC和pVd-null,并转染培养的ESC细胞(CGR8)。使用ATO联合pVdTET2处理CGR8。细胞分为对照组、ATO、shNC、shTET2、ATO+pVd-null、ATO+pVd-TET2。Western blot检测以上各组ESC干性蛋白Nanog、Oct4、Rex-1,分化相关蛋白AFP、cleaved-CASP3、PARP-1(p85),中胚层标志物APOA1、EOMES,及外胚层标志物PAX6、TFAP2B、ZIC1的表达量。免疫缺陷小鼠体内注射ATO、shNC、shTET2处理的CGR8细胞,10周后,免疫组织荧光法检测小鼠畸胎瘤组织中Nanog的阳性率。结果ATO抑制CGR8细胞的增殖率,增加Nanog甲基化水平,上调ESC干性蛋白和外胚层标志物的表达,下调TET2以及分化相关蛋白和中胚层标志物的表达量(均P<0.05)。在CGR8细胞中沉默TET2后表现出于ATO一致的结果。然而,与ATO+pAd-null组比,ATO+pVd-TET2组降低Nanog甲基化水平,下调ESC干性蛋白和外胚层标志物的表达,上调TET2以及分化相关蛋白和中胚层标志物的表达量(均P<0.05)。ATO和shTET2细胞都抑制体内畸胎瘤中Nanog的标记的中胚层分化(均P<0.05)。结论ATO通过抑制TET2促进Nanog甲基化并抑制中胚层的分化。

胚胎干细胞向中内胚层分化的调控研究

胚胎干细胞(ESC)在不断发育过程中逐渐分化为内胚层、中胚层与外胚层,其中内胚层又会进一步朝着终末细胞分化,为产生消化道以及肝脏、胰腺等器官的基础。内胚层的形成过程会经历不同的分化阶段。本文从TGF-β信号通路、Wnt信号通路以及FGF信号通路方面去解析胚胎干细胞向中内胚层分化的调控机制,希望与该领域研究者一起分享学术观念。

HOXB6启动人胚胎干细胞向中胚层分化

HOXB6在胚胎发育过程中发挥重要作用,但在人胚胎干细胞中胚层分化中的作用尚不清楚。该研究利用人胚胎干细胞中胚层分化模型结合RNA-seq分析发现,HOXB6在中胚层分化过程中显著上调,敲降HOXB6的表达抑制人胚胎干细胞向中胚层分化,提示HOXB6在中胚层分化过程中发挥功能。通过建立HOXB6诱导性过表达的人胚胎干细胞株发现,HOXB6过表达抑制人胚胎干细胞多能性标志分子的表达,并且显著上调中胚层标志分子的表达。该研究表明,HOXB6单独过表达能够启动人胚胎干细胞向中胚层分化,为理解人类早期发育和建立人胚胎干细胞高效诱导分化体系提供了理论依据。

Iws1参与小鼠胚胎干细胞中胚层分化发育

目的揭示Iws1在小鼠胚胎干细胞分化发育中的作用。方法利用CRISPR-Cas9基因编辑建立稳定敲除Iws1的小鼠胚胎干细胞细胞系后,利用悬滴法诱导培养拟胚体(embryoid body,EB),在体外探究该基因是否会影响中胚层的发育。同时分离分别出生1天、7天、21天、56天的小鼠心肌细胞进行该基因的定量检测。并使用GeneMANIA数据库确定该基因的潜在靶标。此外,使用WebGestalt进行基因功能(gene ontology,GO)与信号通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。结果在小鼠胚胎干细胞诱导分化体系中,Iws1敲除抑制EB中胚层的发育。该基因在出生后21天的小鼠心肌细胞表现出高表达。Iws1具有19种潜在靶向基因。GO和KEGG分析表明,这些潜在靶基因与氧化还原反应,C型瘦蛋白受体信号通路和其他生理过程有关。结论Iws1参与小鼠胚胎干细胞中胚层分化,可能潜在调控中胚层源性终末分化器官的发育。

SMAD2和SMAD3在人胚胎干细胞分化过程中的不同调控作用

目的·探究转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)家族下游的关键转录因子SMAD蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)——SMAD2和SMAD3在人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)体外分化过程中的不同作用。方法·在hESC中,通过蛋白质印迹法(Western blotting)检测SMAD2和SMAD3在分化过程中的蛋白表达水平。通过CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)技术构建SMAD2敲除(SMAD2 knockout,SMAD2KO)和SMAD3敲除(SMAD3 knockout,SMAD3KO)的细胞系。利用免疫荧光染色检测SMAD蛋白丢失对多能性因子八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)和性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2,SOX2),神经外胚层(neuroectoderm,NE)标志因子配对盒因子6(paired box 6,PAX6)和性别决定区Y框蛋白1(sex determining region Y-box 1,SOX1)以及中内胚层(mesendoderm,ME)标志因子SOX17的表达影响;同时使用流式细胞术鉴定SMAD2敲除或SMAD3敲除对NE标志因子PAX6以及ME标志因子SOX17、脱中胚蛋白(eomesodermin,EOMES)和C-X-C模体趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)表达的影响。在SMAD2KO和SMAD3KO细胞中分别过表达SMAD2和SMAD3质粒,通过Western blotting检测SMAD2和SMAD3蛋白回补的效果,并利用实时定量PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)检测SMAD蛋白回补后对分化过程中的ME关键因子EOMES、叉头框转录因子A2(forkhead box A2,FOXA2)和GSC同源盒(goosecoid homeobox,GSC)表达的影响。结果·虽然SMAD2和SMAD3的蛋白序列较为相似,但是SMAD2才是hESC中主要表达的蛋白因子。免疫荧光染色结果表明,SMAD2敲除和SMAD3敲除并不会影响hESC多能性因子OCT4和SOX2的表达;同时流式细胞术发现,SMAD蛋白的缺失也不会影响NE标志因子PAX6和SOX1的表达。SMAD3敲除对hESC向ME分化没有显著的影响,而SMAD2敲除严重阻碍了hESC表达ME标志因子SOX17、EOMES和CXCR4。通过qRT-PCR检测显示在SMAD2KO细胞中过表达外源性SMAD2可以有效地恢复ME基因EOMES、FOXA2和GSC的表达,而在SMAD3KO细胞中回补SMAD3对这些ME基因的表达无影响。结论·SMAD2和SMAD3在hESC向ME分化过程中的调控作用不同。SMAD2而非SMAD3是决定hESC表达ME基因的关键。

基于CRISPR/Cas9n技术建立携带mT-F2A-EGFP报告系统的小鼠胚胎干细胞系

目的·通过CRISPR/Cas9n(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 nickase)介导的同源定向修复(homologous-directed repair,HDR)技术在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)的中内胚层关键调控分子T-box转录因子Brachyury(即T基因)末端依次敲入手足口病毒2A(foot-and-mouth disease virus 2A,F2A)和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)以建立T荧光报告细胞系(mTF2A-EGFP)。方法·首先,针对T基因构建特异性单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)质粒和包含F2A-EGFP的供体质粒。利用电穿孔将这2种质粒递送到mESC E14Tg2a(E14)内,通过HDR在T基因末端插入F2A-EGFP。然后,通过药物筛选和基因测序验证所获得的单克隆细胞,并将其诱导形成类胚体(embryonic body,EB)进行分化。通过荧光显微镜和流式细胞技术分别监测mT-F2A-EGFP细胞克隆在分化前后的荧光信号变化,并进行实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR)来检测多能性标志基因、中内胚层以及外胚层标志基因的转录水平变化。同时,检测克隆细胞的周期、生长曲线,并利用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色检测候选克隆干细胞特性。最后,挑选克隆细胞系T1进行了EB分化。利用流式细胞技术分选出分化细胞群中EGFP荧光表达细胞(EGFP+)和无荧光表达的细胞(EGFP-),并检测各谱系基因的表达情况。结果·EGFP被正确插入到E14细胞的T基因,其荧光强度能正确反映T基因表达水平且未产生明显的不良反应。当T1报告克隆分化时,通过流式细胞技术分选出的包含mT-F2A-EGFP的荧光细胞主要高表达中内胚层标志基因。结论·成功构建携带mT-F2A-EGFP的mESC,可实现对T基因调控程度的快速监测,并实时追踪分化过程中表达T基因标记EGFP的中内胚层细胞。

人诱导性多潜能干细胞系的建立

背景:诱导性多潜能干细胞与肿瘤干细胞的发生过程极其相似,而且具有的干细胞特性极其接近人胚胎干细胞。因此,研究诱导性多潜能干细胞有利于人们进一步认识并了解人类发育以及肿瘤的发生过程。目的:掌握建立人诱导性多潜能干细胞系的技术,以便为特异性疾病细胞的重编程建立技术平台,从而利用重编程技术研究疾病的发病机制。方法:将含有Oct4、Sox2、Klf-4和c-Myc 4个转录因子的反转录病毒感染人皮肤成纤维细胞(HS27细胞),在人胚胎干细胞培养条件下诱导产生人胚胎干细胞样的克隆。挑取并进一步扩增,通过克隆形态、碱性磷酸酶活性、免疫荧光检测是否有人胚胎干细胞标记物Oct4、Sox2、c-Myc、Klf-4的表达,悬滴法检测HS27细胞来源的克隆形成畸胎瘤的能力和验证向3个胚层的分化能力。结果与结论:经病毒感染诱导产生的胚胎干细胞样克隆呈绿色荧光蛋白阴性,克隆在细胞形态方面与人胚胎干细胞克隆相似,进一步扩增经碱性磷酸酶检测克隆呈阳性,免疫荧光检测克隆表达Oct4、Sox2、c-Myc、Klf-4,并且HS27细胞来源的克隆注入免疫缺陷小鼠体内可以形成畸胎瘤并经苏木精-伊红染色显示具有向三胚层分化能力。实验成功构建了人诱导性多潜能干细胞系,为下一步开展疾病细胞特异性重编程研究奠定了良好的实验基础。

妊娠期肾脏结构和功能生理性变化及特点

肾脏是人体不可全缺的重要器官,对于维持体内代谢平衡和机体的健康发挥至关重要的作用。妊娠期为保胎儿正常生长发育和母胎安全,肾脏结构和功能发生一系列适应性改变。本文重点阐述妊娠状态时肾脏结构和功能的生理性变化。为了解这些变化及产生的原因,必须先清楚非孕状态时肾脏的结构和功能。

银屑病患者皮损间充质干细胞同源异型盒B族基因表达情况的研究

银屑病是一种以T细胞为主介导的、多种免疫细胞、炎症因子共同参与的慢性炎症性皮肤病。虽然其发病机制目前尚未完全明确,但其主要发病特点已得到公认。间充质干细胞（MSCs）是由中胚层分化而来的一类具有高度增殖、自我更新及多向分化潜能的成体干细胞。

多器官未发育畸形胎儿组织结构观察

目的:为研究畸形胎儿的分类和三胚层分化异常的机理积累资料。方法:HE染色,光镜下观察多器官未发育畸形胎儿的组织结构。结果:胎儿几处组织呈正常发育状态,未见神经组织。结论:胎儿多器官未见发育,属罕见畸形。能见组织呈正常发育状态,三胚层分化不全。

质膜下线性致密(SLDs)在电镜诊断中的意义

质膜下线性致密(Subplasmalemmal lineardensity,简称SLDS)是在电镜观察中有时遇到的一种超微结构,过去人们认为它可见于各类正常细胞(组织细胞、蛛网膜细胞)和病变的组织中,(如在球形细胞脑白质营养不良中球形细胞和慢性肉芽肿的上皮样细胞中)。然而。

介绍几个实用生物记忆口诀

针对生物学科记忆量较大的特点,在理解的基础上运用恰当的识记方法、能使学生较快的掌握复杂的生物过程。 (一) 细胞有丝分裂过程口诀 1.植物细胞分裂口诀: 前中后末分裂期, 前期出现染色体, 核膜解体核仁失, 中央形成纺锤体。“两体”清晰是中期,

维持Oct-4基因表达对小鼠胚胎干细胞分化的影响

通过导入外源性表达的Ｏｃｔ－４基因，使小鼠胚胎干细胞（ＥＳ细胞）在维甲酸诱导分化后仍继续维持Ｏｃｔ－４基因的表达，建立了Ｏｃｔ－４基因维持表达的ＥＳ－Ｏ细胞株．研究发现，在缺乏干细胞分化抑制因子ＬＩＦ的情况下，Ｏｃｔ－４基因的维持表达本身并不能维持ＥＳ－Ｏ细胞的干细胞特性；在ＬＩＦ存在时，Ｏｃｔ－４基因的维持表达增强了ＥＳ－Ｏ细胞维持干细胞未分化状态的能力，而且部分抑制了维甲酸诱导的细胞分化，说明Ｏｃｔ－４基因与ＬＩＦ协同作用才能维持ＥＳ细胞的未分化状态．在细胞分化过程中，ＥＳ－Ｏ细胞倾向于向神经细胞分化，提示Ｏｃｔ－４基因的维持表达可能与神经外胚层分化相关．

早期胚胎细胞谱系研究--揭示生命发育早期的黑盒子

哺乳动物的早期胚胎发育,通过多个层次的细胞命运决定,建立了胚胎器官发生、形态建成的整体发育蓝图,是生命体最重要的分子事件之一。早期胚胎发育过程伴随了全能性的维持和分化,以及各种多能干细胞命运的次序决定,任何发育进程上的缺陷都会对整个胚胎个体产生深远的影响。因此,研究早期胚胎谱系建立的过程、不同胚层和组织前体细胞的命运决定及其发生与发展的调控机制,不仅仅是面对国家人口政策的变化以及优生优育的需求,预防和减少早期发育疾病,还能够指导胚胎干细胞及各种多能干细胞的分化和进一步转化医学应用,因而具有极其重要的生物学意义。