黄瓜胚性愈伤组织的诱导保存和再生

【目的】对黄瓜胚性愈伤组织的诱导保存和再生进行研究,为黄瓜高频率遗传转化奠定基础。【方法】以欧洲温室型黄瓜自交系14-1子叶节为外植体,在MS培养基上附加1.5 mg/L 2,4-D,进行25 d的胚性愈伤组织诱导培养后,取胚性愈伤组织在添加30,60,90,100,110,120,130,140和150 g/L蔗糖及1.5 mg/L 2,4-D的MS培养基进行继代培养,每30 d继代1次,观察胚性愈伤组织的褐变情况及胚性分化能力,并用电子天平在超净工作台中记录胚性愈伤组织质量的变化。继代培养60 d后,将保存的胚性愈伤组织和体细胞胚移至含1.5 mg/L 2,4-D的MS培养基上,待出现体细胞胚后移至MS培养基进行萌发,观察再生小植株的生长情况。【结果】将欧洲温室型黄瓜自交系14-1的子叶节,接种到附加1.5 mg/L 2,4-D的MS培养基上进行诱导培养后,子叶节一端的愈伤组织集中聚集于下胚轴处,之后有黄色胚性愈伤组织产生。在继代培养过程中,当培养基中添加的蔗糖为60~150 g/L时,胚性愈伤组织能保持胚性愈伤状态达60 d。之后将继代培养60 d后的胚性愈伤组织转接至附加1.5 mg/L 2,4-D的MS培养基上,在蔗糖质量浓度为60 g/L条件下保存的胚性愈伤组织可诱导出正常胚状体,且能形成健康小植株。【结论】由黄瓜子叶节诱导出的胚性愈伤组织可在MS+60 g/L蔗糖的培养基上保存达60 d,之后能正常萌发形成胚状体,进而形成正常小植株。

生长素和细胞分裂素诱导植物胚性愈伤组织研究进展

植物胚性愈伤组织在植物研究与应用中是一种重要的试材,有很多关于植物胚性愈伤组织诱导方法研究的报道。生长素和细胞分裂素被广泛应用于胚性愈伤组织的诱导,是胚性愈伤组织诱导的关键因子。阐述了生长素和细胞分裂素在植物胚性愈伤组织诱导及体细胞胚胎发生过程中的作用,讨论了其在植物胚性愈伤组织诱导中的作用、使用方法与原则,为愈伤组织诱导、愈伤组织胚性化诱导等研究中植物生长调节剂的使用提供依据。

番木瓜均质胚性细胞悬浮系的建立和高效植株再生

【目的】提高番木瓜体细胞胚发生的同步性及其植株再生率,为番木瓜大量快繁、细胞工程和分子育种技术研发提供技术基础。【方法】以紫晖110~120 d果实的未成熟合子胚为外植体,经胚性愈伤组织诱导、液体悬浮培养和体细胞胚发生过程,建立均质胚性细胞悬浮系和高效植株再生技术体系,重点比较了不同质量浓度2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)对胚性愈伤组织诱导、不同质量浓度6-苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA)+萘乙酸(1-naphthlcetic acid,NAA)组合和活性炭(activated carbon,AC)对子叶期体细胞胚萌发与生根的影响。【结果】4 mg·L^(-1)2,4-D可诱导62.86%未成熟合子胚形成胚性愈伤组织。经5个继代周期的筛选培养,可建立由单细胞和小细胞团组成的均质胚性细胞悬浮系。采用液体培养方式能诱导大量球形胚的形成,被转移至含5 g·L^(-1)AC的半固定培养基成熟培养30 d后,可获得大量子叶期体细胞胚。在含0.4 mg·L^(-1)6-BA+0.02 mg·L^(-1)NAA的萌发培养基中体细胞胚萌发率为97.58%,胚根端愈伤化比率为95.48%,补充5 g·L^(-1)AC后可获得92.62%体细胞胚同步萌发和生根,并显著降低愈伤化比率至33.10%;在不添加任何植物生长调节剂、仅含5 g·L^(-1)AC的成熟培养基中,体细胞胚同步萌发和生根率为88.33%,愈伤化比率降低至11.67%。正常萌发生根的体细胞胚在含0.1 mg·L^(-1)6-BA+2 mg·L^(-1)吲哚丁酸(3-Indolebutyric acid,IBA)+10 g·L^(-1)AC的再生培养基中可获得81.36%的植株再生率。【结论】以紫晖110~120 d未成熟合子胚为外植体,最佳的胚性愈伤组织诱导培养基为1/2 MS培养基+4 mg·L^(-1)2,4-D+400 mg·L^(-1)谷氨酰胺+60 g·L^(-1)蔗糖。最优体细胞胚发生方案为胚性细胞悬浮系(embryogenic cell system,ECS)经液体培养方式诱导球形胚形成,在含1/2 MS盐+MS维生素+50 mg·L^(-1)肌醇+400 mg·L^(-1)谷氨酰胺+30 g·L^(-1)蔗糖+5 g·L^(-1)AC的培养基中促进体细胞胚的成熟及后续的同步萌发和生根,可有效缓解胚根端愈伤化现象。

桂糖42号胚性愈伤组织高效诱导及相关内源激素的动态变化

以优良甘蔗品种桂糖42号心叶为外植体,以MS为基本培养基,探究不同浓度2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)及营养成分[水解酪蛋白(CH)和椰汁(CW)]对甘蔗胚性愈伤组织诱导效果的影响,优化甘蔗胚性愈伤组织诱导培养基;测定诱导胚性愈伤组织发生过程中不同组织样品的4种激素[玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA3)、生长素(IAA)和脱落酸(ABA)]含量。结果表明,甘蔗心叶在添加3.0 mg/L 2,4-D的MS培养基中其愈伤组织诱导率达93.33%,第一代愈伤组织转接于添加3.0 mg/L 2,4-D和100.0 mL/LCW的MS培养基,其胚性愈伤组织诱导率达83.33%;在甘蔗胚性愈伤组织诱导过程中,内源激素ZR和GA3含量呈下降趋势,IAA和ABA含量呈上升趋势,胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织间的4种激素含量均存在显著差异(P<0.05),其中,胚性愈伤组织的GA3含量是非胚性愈伤组织的1.77倍。本研究将甘蔗愈伤组织诱导培养基优化为MS+3.0 mg/L 2,4-D,继代培养基优化为MS+3.0 mg/L 2,4-D+100.0 mL/LCW,并初步揭示甘蔗胚性愈伤组织诱导过程中内源激素含量的变化规律,可作为甘蔗优质胚性愈伤组织培养的参考依据。

白花油茶胚性愈伤诱导及植株再生

本研究以白花油茶未成熟胚为外植体,对其消毒方式及胚性愈伤组织培养进行研究。结果表明,未剥果皮的外植体先用75%乙醇浸泡60 s后转入0.1%HgCl_(2)浸泡8 min,再转入2%NaClO中浸泡8 min,成活率最高,达86.67%。未成熟胚切块接种于MS+0.5 mg·L^(-1)2,4-D+2.0 mg·L^(-1)6-BA中,胚性愈伤组织诱导最好,诱导率最高,达89.63%;将绿色愈伤组织转接至MS+0.2 mg·L^(-1)NAA+1.0 mg·L^(-1)6-BA时,愈伤组织表面及其周围产生大量体细胞胚,呈球形、心形、鱼雷状和子叶状等多种形状,且多种相互重叠生长,胚状体诱导率最高,达68.89%;不同配比的6-BA和NAA诱导体细胞胚产生不定芽的效率差异明显,其中2.25 mg·L^(-1)6-BA+0.5 mg·L^(-1)NAA和3.0 mg·L^(-1)6-BA+1.0 mg·L^(-1)IBA不定芽分化效果最好,诱导率均达90%以上。待不定芽长至1.5~2.0 cm切下进行生根培养,发现添加5 mg·L^(-1)NAA和添加5 mg·L^(-1)NAA+5 mg·L^(-1)IBA的生根效果较好,分别达77.78%和81.11%,前者只有主根,侧根较少产生,后者主根生长健壮,侧根稠密。初步建立了白花油茶胚性愈伤组织诱导及植株再生体系,为遗传转化提供技术支撑。

甘蓝型油菜胚离体胚性生长培养体系的构建

甘蓝型油菜种子含油量受母体基因型、胚基因型、细胞质基因型等遗传效应及大田环境因素的影响。独立研究含油量影响因素就需要建立一个维持胚性生长的胚离体培养体系。结果显示,以甘蓝型油菜ZY 511第22 DAP(Days after pollination)幼胚为材料,B 5为基本培养基,8%蔗糖、0.6%琼脂、0.05 mg/L NAA(萘乙酸)、0.15 mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)时,胚性生长率最高(94.64%)。以此建立的胚离体培养最佳胚性生长体系为油菜种子含油量的遗传机制研究提供了技术支撑。

紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导与增殖的研究

为在不同栽培苜蓿(Medicago sativa)品种上,建立稳定、快速且高效的组织培养体系,本试验以品种‘游客’、‘Paola’和‘Sardi7’为研究材料,探究了苜蓿外植体、激素配比及金属离子(Cu 2+、Ag+),对其胚性愈伤组织的诱导效果。结果表明:下胚轴为诱导愈伤组织的最佳外植体;MS+1 mg·L^(-1)2,4-D+0.2 mg·L^(-1)KT为培养基时‘游客’和‘Paola’胚性愈伤诱导率分别为24.7%,16.7%;MS+2 mg·L^(-1)2,4-D+0.2 mg·L^(-1)KT为培养基时‘Sardi7’胚性愈伤诱导效果最佳为27.3%;1μmol·L^(-1)和5μmol·L^(-1)Cu^(2+)均能显著促进‘Sardi7’‘游客’和‘Paola’愈伤组织的诱导;5μmol·L^(-1)Ag^(+)显著诱导‘游客’和‘Paola’形成胚性愈伤组织,诱导率分别提高25.3%,46.7%(P<0.05)。本研究探索了诱导苜蓿愈伤组织的最佳外植体及其培养条件、金属离子促进不同苜蓿品种再生的作用,为突破同源四倍体栽培苜蓿品种基因型上的限制、提高胚性愈伤组织出愈率提供了思路。

番木瓜胚性细胞悬浮系高效遗传转化体系的建立

【目的】建立番木瓜高效遗传转化体系,为番木瓜基因功能研究和重要农艺性状改良提供新的技术支撑。【方法】以紫晖番木瓜胚性细胞悬浮系(embryogenic cell suspensions,ECS)为遗传转化受体,利用植物表达载体pCAMBIA1301和农杆菌介导法进行遗传转化,对抗生素浓度筛选、侵染时间、继代培养、抗性胚的诱导与萌发以及植株再生整个过程进行探索,最后获得抗性再生植株。【结果】通过设置不同浓度的头孢霉素和潮霉素处理,观察ECS细胞状态,筛选、确定头孢霉素和潮霉素最适处理质量浓度分别为200 mg·L^(-1)和5 mg·L^(-1)。工程菌和ECS共培养侵染2 d后转到含有头孢霉素和潮霉素的液体筛选培养基上进行继代培养,继代周期为14 d。经GUS染色验证,表明继代3次后的ECS几乎全部为转化细胞。将以上ECS转移到液体胚诱导培养基中进行培养,2个月后可获得大量球形体细胞胚,且GUS组织染色为蓝色。将球形体细胞胚转到半固体成熟培养基上培养,2个月后可获得成熟子叶期体细胞胚。子叶期体细胞胚在萌发培养基上光培养30 d后,可获得再生芽。任意选取再生芽进行GUS染色,均可染成蓝色。抗性再生芽经促根培养可成功获得再生植株。利用PCR检测抗性再生植株,可以确定GUS基因已经整合到番木瓜基因组中。【结论】成功建立了一种以番木瓜ECS为转化受体的农杆菌介导的高效遗传转化体系。在该技术体系中,经农杆菌侵染后的ECS继代筛选3次后,几乎全部为转化细胞,这些转化细胞经体胚诱导、成熟、萌发和生根过程可成功获得再生植株,抗性体胚得胚率为43.65%,抗性体胚萌发率为73.26%,植株再生率为80.55%,大大提高了番木瓜遗传转化效率。该体系为番木瓜基因功能研究和分子育种提供了新的途径。

小麦胚性非再生细胞中游离氨基酸分析

利用毛细管电泳技术分析了小麦胚性非再生细胞中游离氨基酸的组成与含量。与已经发表的胚性再生细胞游离氨基酸浓度比较发现,两类胚性细胞中游离氨基酸的含量差异明显:在9种可以分开的游离氨基酸中,胚性再生细胞中的游离精氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸分别是胚性非再生细胞中的10、3、2和2倍,其它氨基酸的浓度在两类细胞中没有明显的变化。本研究不但为检测植物细胞氨基酸成分提供了方便快捷的方法,而且为进一步探索小麦两类胚性细胞在分子水平上的差异和形成机理提供了生化基础。

抗性湿地松胚性愈伤组织的维持与增殖

将抗松针褐斑病湿地松愈伤组织转接至不同培养基及多种添加物中,开展了不同愈伤组织类型、不同浓度肌醇与麦芽糖、不同2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、激动素(KT)浓度组合、添加维生素(VC)、添加硝酸银(AgNO3)、不同基因型胚性愈伤组织、多次继代后胚性愈伤组织与培养基的适应性等研究。结果表明:湿地松不同愈伤组织类型在增殖过程中成活率及增殖状况都存在很大差异;当麦芽糖浓度为15 g/L,肌醇浓度为1000 mg/L时最有利于胚性胚柄细胞团(ESM)的增殖;高浓度的2,4-D、6-BA不利于湿地松胚性愈伤组织的增殖,最佳增殖培养基及激素组合DCR+1.0 mg/LNAA+0.32 mg/L6-BA+0.31 mg/LKT、DCR+1.0 mg/LNAA(萘乙酸)+1.55 mg/L6-BA+0.064 mg/LKT;添加维生素(VC)浓度为10 mg/L时,对湿地松愈伤的褐化有明显抑制作用,但浓度过高则会增加愈伤的褐化率;添加3.4 mg/L的AgNO3促进了湿地松胚性愈伤组织的增殖;湿地松不同家系不同基因型间增殖能力差异显著,20#2和10#1增殖很快明显优于10#4、10#5和20#3;湿地松胚性胚柄细胞团在同样的培养基上多次继代后,愈伤组织增殖变慢,中心褐化较多,有些还会出现水渍状,可能导致其胚性丧失。湿地松不同愈伤组织类型在增殖过程中,成活率及增殖状况都存在很大的差异。Ⅲ型、Ⅳ型愈伤可能同时含有胚性愈伤和非胚性愈伤,在培养基条件适合的情况下胚性愈伤转化成胚性胚柄细胞团,但是转化频率极低。而Ⅴ型、Ⅵ型愈伤在后期培养过程中基本褐化死亡。

甜瓜松散型胚性愈伤组织诱导

为建立甜瓜松散胚性愈伤组织再生体系,给分子标记辅助育种、转基因育种、诱变育种等新型的育种技术提供优质材料,以甜瓜成熟叶片为外植体,调节培养基中激素、蔗糖浓度以及愈伤组织继代次数诱导甜瓜松散型胚性愈伤组织。结果表明,在2,4-D的作用下叶片能诱导出愈伤组织,在MS+0.1 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2,4-D+20 g/L蔗糖的培养基上,可以获得结构松散、质地较软呈黄绿色的愈伤组织;诱导松散型愈伤组织最佳培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖,经过3次继代后可以获得生长速度较快,结构松散、质地较硬呈黄绿色的松散型愈伤组织;在MS+0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D+40 g/L蔗糖的培养基上愈伤组织胚性化最好,继代5次,可获得结构松散、质地较硬,生长速度较快的松散型胚性愈伤组织。

香蕉胚性愈伤组织的诱导及胚性细胞悬浮系的建立

分别以3个香蕉品种的多芽体茎尖和5个香蕉品种的未成熟雄花为外植体,诱导产生胚性愈伤组织.结果分别从2个基因组类型为AAA的品种的多芽体茎尖和未成熟雄花获得了胚性愈伤组织,而未能从基因组类型为AAB或ABB的香蕉品种中获得胚性愈伤组织.胚性愈伤组织的诱导率受基因组类型、品种和培养条件等因素的影响.以上述4个品种的胚性愈伤组织为起始材料成功建立了胚性细胞悬浮系,不同香蕉品种,从其胚性愈伤组织建立胚性细胞悬浮系的难易程度有所不同.

落叶松不同类型胚性和非胚性愈伤组织的生理生化差异

以华北落叶松继代、增殖培养的不同类型的胚性及非胚性愈伤组织为材料 ,测定其氨基酸、糖类、酚酸、激素以及离子的含量 ,结果表明 :氨基酸含量的差异十分明显 ,质地硬的非胚性愈伤组织中 18种游离氨基酸含量为胚性愈伤组织的 2倍以上 ,经ABA处理后 ,胚性愈伤组织中多糖及邻苯二酚含量急剧升高 ;三糖含量与不同基因型密切相关 ;乙烯释放量在非胚性愈伤组织中高于胚性愈伤组织 ;金属离子CO+ + 的含量 ,胚性愈伤组织是非胚性愈伤组织的 12倍 ,胚性愈伤组织中铵态氮 (NH+4)与硝态氮 (NO-3)的比值是非胚性愈伤组织中的 10倍以上 ;实验结果为进一步探讨针叶树体细胞胚胎发生的生理生化机理提供依据。

陆地棉品种“珂字201”胚性与非胚性愈伤组织生化代谢产物的比较研究

利用生理生化分析技术对陆地棉品种“珂字201”体细胞胚胎发生中生化代谢产物进行了初步研究。胚性愈伤组织中主代谢物质,如蛋白质和 RNA 的含量较高,它们可能由其它主代谢物质如糖和淀粉转化而来。而次生代谢物质如酚类物质和色素类物质等在胚性愈伤组织中含量较低。胚性愈伤组织中某些特定氨基酸的含量高于非胚性愈伤组织。胚性愈伤组织中 IAA 的代谢旺盛,且 IAA 与 ABA 的比值较高。两类愈伤组织中各种酶的活性也有很大差别。所以,初步认为,主代谢与次生代谢的协调性、一些酶活性的不同、内源激素的含量和平衡状态、某些特异氨基酸的不同等,可能是胚胎发生与否的重要生化基础。

利用未成熟种子建立野生阿宽蕉胚性细胞悬浮系和植株再生的研究

以纵切的野生阿宽蕉60d龄未成熟种子为外植体,在MI1愈伤组织诱导培养基(MS大量和微量元素及铁盐+MorelandWetmore维生素+0.1mmol/LKH2PO4+87mmol/L蔗糖+4.5μmol/L2,4-D+1g/LGelrite)中培养60d后开始出现浅黄色松散的胚性愈伤组织,150d后愈伤组织诱导率为(15.11±1.95)%。该类愈伤组织被转移到含18μmol/L2,4-D的MI2培养基中继代60d后,可获得状态均一的理想的胚性愈伤组织。胚性愈伤组织悬浮培养后,通过2个月的筛选和继代培养,可得到均质的胚性细胞悬浮系。理想的胚性愈伤组织在体细胞胚诱导培养基中培养10d后可见到白色半透明体细胞胚的发生,体细胞胚诱导率为7.70×105个/gFW。成熟体细胞胚的萌发率为(33.33±3.37)%,植株再生率为(20.83±1.68)%。

白皮松胚性和非胚性愈伤组织生理生化特性研究

【目的】探讨白皮松体细胞胚胎发生过程中各项生理生化指标与体细胞胚胎发生、发育的关系。【方法】以白皮松体细胞胚发生诱导阶段不同发育时期的胚性愈伤组织(EC)和非胚性愈伤组织(N-EC)为材料,对其不同培养时间(5,15,25和35 d)的可溶性蛋白质、可溶性糖和淀粉含量及抗氧化物酶(POD,SOD,CAT)活性进行研究。【结果】EC中可溶性蛋白质和可溶性糖含量均在培养25 d时达到峰值,N-EC中可溶性蛋白和可溶性糖含量在培养15 d时达到峰值;EC中淀粉含量呈现先上升后下降再上升的变化趋势,N-EC淀粉含量一直呈下降趋势。EC中抗氧化物酶活性明显高于N-EC,SOD活性在培养15 d时达到峰值,表明SOD在体细胞胚诱导初期起主导作用;EC的CAT和POD活性均在培养25 d时达到峰值,说明CAT和POD在体细胞胚发生过程中对胚性细胞的进一步分化和发育起主导作用。【结论】白皮松体细胞胚胎发生诱导阶段,EC的生理生化代谢活性高于N-EC。

甘薯胚性悬浮系的建立及其细胞生长特性研究

徐薯 18叶片接种在附加 2mg/L 2 ,4 D的MS固体培养基上 ,形成了质地松散的胚性愈伤组织 ,胚性愈伤组织在附加 1mg/L 2 ,4 D的MS液体培养基中进行悬浮培养 ,建立了增殖迅速、分散度良好的具有较高体胚分化能力的细胞悬浮系 .小型细胞团 (直径小于 35 0 μm)以 2 %～ 4%的接种量转移到无激素MS液体培养基中 ,可分化出大量体胚 .在继代初期 ,悬浮系 pH值呈下降趋势 ,细胞处于旺盛分裂时期 ,导致悬浮系鲜质量、干质量、细胞紧实体积(PVC)的显著升值 ;4d以后 ,pH值逐渐回升 ,细胞分裂缓慢而体积增长迅速 ,导致鲜质量、PVC增加而干质量少有变化 ;6d以后

仙客来(Cyclamen Persicum Mill)胚性愈伤形态和组织结构的动态观察

用仙客来 (Cyclamenpersicum Mill)成苗叶柄作为外植体 ,培养在附加 2 ,4 D和KT的 1/2MS培养基上诱导体细胞胚性愈伤组织的发生 ,对体细胞胚性愈伤组织发生过程中外部形态和组织细胞学结构进行了动态观察 .结果表明 ,叶柄组织脱分化的起始部位在维管束的维管束鞘细胞 ,启动时间是培养后 2d ;叶柄外植体培养至 2 0d左右 ,愈伤组织呈松散透明状态 ,胚性细胞出现 ,标志着进入胚性愈伤组织阶段 ,胚性细胞多发生在所形成的愈伤组织的表层或近表层细胞 ,细胞大而壁薄 ,与非胚性细胞联系疏松 ,细胞核大 ,并位于细胞中央 ,细胞质浓厚 ,分别观察有单细胞。

马唐胚性与非胚性愈伤组织生理差异的初步研究

马唐幼穗的胚性愈伤组织中游离氨基酸含量与种类均少于非胚性愈伤组织,而可溶性蛋白质含量却高于后者;前者可溶性蛋白质、过氧化物酶、酯酶及淀粉酶的同工酶电泳谱带亦此后者多。

Kao's有机化合物与T维生素对小麦幼胚胚性愈伤组织发生的影响

试验研究MS基本培养基中加入Kao's有机化合物与T维生素对小麦幼胚胚性愈伤组织发生的影响结果表明,加入Kao's有机化合物与T维生素的MC和MD诱导培养基可显著提高胚性愈伤组织诱导率,且ME与MF分化培养基明显增加绿原基分化率和出苗率。