橡胶树热垦525胚性悬浮细胞系的建立及其胚性能力的维持

易碎胚性愈伤组织和胚性悬浮细胞系都是基因工程和细胞工程的理想受体材料。然而橡胶树(Hevea brasil-iensis)易碎胚性愈伤组织诱导频率低、耗时长,且其胚性能力通常随继代次数的增加而下降甚至完全丧失,限制了相关研究的持续开展。因此,快速获得易碎胚性愈伤组织,建立具有高效体胚发生能力的胚性悬浮细胞系,并尽可能较长时间维持其胚性能力是当前橡胶树基因工程和细胞工程研究的重要内容。本研究以橡胶树热垦525未成熟花药为外植体进行愈伤组织的诱导和胚性悬浮细胞系的建立,分析比较固液2种长期继代方式对维持其胚性能力的影响。结果表明:花药外植体在愈伤诱导培养基中获得的黄色致密初代愈伤组织体胚发生能力低,分散性差,不适合进行悬浮培养。将初代愈伤组织转移至胚性愈伤组织诱导培养基中培养70~80 d后,可观察到有胚性结构的形成和早期体细胞胚发生,同时周围长出鲜黄色小颗粒状易碎胚性愈伤组织。通过常规方法建立的Ⅰ型胚性悬浮细胞系具备胚性细胞的典型特征,体胚发生能力显著高于胚性愈伤组织,但在体胚发生过程中容易重新愈伤化;而通过筛选特定形态的胚性愈伤组织低密度启动悬浮培养建立的Ⅱ型胚性悬浮细胞系,在显微镜下可观察到细胞处在有序的胚性结构中,其体胚发生频率可达100%。在含2 mg/L2,4-D的液体培养中持续继代2 a后细胞明显老化且增殖缓慢,体胚发生能力几近丧失;而在去除2,4-D并添加低浓度脱落酸(0.1 mg/L)和水解酪蛋白(0.5 g/L)的固体培养基上持续继代2 a后,体胚发生能力仍能维持在较高水平。所建立的Ⅱ型胚性悬浮细胞系可为橡胶树遗传转化及原生质体培养等相关研究长期提供优质充足且状态相对稳定的材料来源。

番木瓜均质胚性细胞悬浮系的建立和高效植株再生

【目的】提高番木瓜体细胞胚发生的同步性及其植株再生率,为番木瓜大量快繁、细胞工程和分子育种技术研发提供技术基础。【方法】以紫晖110~120 d果实的未成熟合子胚为外植体,经胚性愈伤组织诱导、液体悬浮培养和体细胞胚发生过程,建立均质胚性细胞悬浮系和高效植株再生技术体系,重点比较了不同质量浓度2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)对胚性愈伤组织诱导、不同质量浓度6-苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA)+萘乙酸(1-naphthlcetic acid,NAA)组合和活性炭(activated carbon,AC)对子叶期体细胞胚萌发与生根的影响。【结果】4 mg·L^(-1)2,4-D可诱导62.86%未成熟合子胚形成胚性愈伤组织。经5个继代周期的筛选培养,可建立由单细胞和小细胞团组成的均质胚性细胞悬浮系。采用液体培养方式能诱导大量球形胚的形成,被转移至含5 g·L^(-1)AC的半固定培养基成熟培养30 d后,可获得大量子叶期体细胞胚。在含0.4 mg·L^(-1)6-BA+0.02 mg·L^(-1)NAA的萌发培养基中体细胞胚萌发率为97.58%,胚根端愈伤化比率为95.48%,补充5 g·L^(-1)AC后可获得92.62%体细胞胚同步萌发和生根,并显著降低愈伤化比率至33.10%;在不添加任何植物生长调节剂、仅含5 g·L^(-1)AC的成熟培养基中,体细胞胚同步萌发和生根率为88.33%,愈伤化比率降低至11.67%。正常萌发生根的体细胞胚在含0.1 mg·L^(-1)6-BA+2 mg·L^(-1)吲哚丁酸(3-Indolebutyric acid,IBA)+10 g·L^(-1)AC的再生培养基中可获得81.36%的植株再生率。【结论】以紫晖110~120 d未成熟合子胚为外植体,最佳的胚性愈伤组织诱导培养基为1/2 MS培养基+4 mg·L^(-1)2,4-D+400 mg·L^(-1)谷氨酰胺+60 g·L^(-1)蔗糖。最优体细胞胚发生方案为胚性细胞悬浮系(embryogenic cell system,ECS)经液体培养方式诱导球形胚形成,在含1/2 MS盐+MS维生素+50 mg·L^(-1)肌醇+400 mg·L^(-1)谷氨酰胺+30 g·L^(-1)蔗糖+5 g·L^(-1)AC的培养基中促进体细胞胚的成熟及后续的同步萌发和生根,可有效缓解胚根端愈伤化现象。

番木瓜胚性细胞悬浮系高效遗传转化体系的建立

【目的】建立番木瓜高效遗传转化体系,为番木瓜基因功能研究和重要农艺性状改良提供新的技术支撑。【方法】以紫晖番木瓜胚性细胞悬浮系(embryogenic cell suspensions,ECS)为遗传转化受体,利用植物表达载体pCAMBIA1301和农杆菌介导法进行遗传转化,对抗生素浓度筛选、侵染时间、继代培养、抗性胚的诱导与萌发以及植株再生整个过程进行探索,最后获得抗性再生植株。【结果】通过设置不同浓度的头孢霉素和潮霉素处理,观察ECS细胞状态,筛选、确定头孢霉素和潮霉素最适处理质量浓度分别为200 mg·L^(-1)和5 mg·L^(-1)。工程菌和ECS共培养侵染2 d后转到含有头孢霉素和潮霉素的液体筛选培养基上进行继代培养,继代周期为14 d。经GUS染色验证,表明继代3次后的ECS几乎全部为转化细胞。将以上ECS转移到液体胚诱导培养基中进行培养,2个月后可获得大量球形体细胞胚,且GUS组织染色为蓝色。将球形体细胞胚转到半固体成熟培养基上培养,2个月后可获得成熟子叶期体细胞胚。子叶期体细胞胚在萌发培养基上光培养30 d后,可获得再生芽。任意选取再生芽进行GUS染色,均可染成蓝色。抗性再生芽经促根培养可成功获得再生植株。利用PCR检测抗性再生植株,可以确定GUS基因已经整合到番木瓜基因组中。【结论】成功建立了一种以番木瓜ECS为转化受体的农杆菌介导的高效遗传转化体系。在该技术体系中,经农杆菌侵染后的ECS继代筛选3次后,几乎全部为转化细胞,这些转化细胞经体胚诱导、成熟、萌发和生根过程可成功获得再生植株,抗性体胚得胚率为43.65%,抗性体胚萌发率为73.26%,植株再生率为80.55%,大大提高了番木瓜遗传转化效率。该体系为番木瓜基因功能研究和分子育种提供了新的途径。

贡蕉胚性细胞悬浮系的建立和植株再生

鲜食蕉品种的高度不育性和多倍性制约了用传统育种方法培育生产实践中所需的新品种 ,建立稳定的胚性细胞悬浮系是香蕉生物技术育种的前提。以目前国内尚未建立该体系的鲜食蕉品种贡蕉 (AA)未成熟雄花序的第 1～ 15位花梳为外植体 ,对胚性细胞悬浮系的建立和植株再生体系进行了优化。结果表明 ,5～ 6个月的培养后可获得分生小球体和浅黄色、松散易碎的胚性愈伤组织。 9μmol L 2 ,4 D对外植体愈伤组织的诱导效果最好 ,诱导率为 4 0 96 % ,胚性愈伤组织诱导率可达7 4 5 % ,其中 5 79%的胚性愈伤组织来源于第 6～ 12号位置的花梳。胚性愈伤组织悬浮培养后 ,通过 3个月的筛选和继代培养 ,可得到均质的胚性细胞悬浮系。该培养体系合适继代周期为 15d ,继代时合适的起始接种量为每 30mL培养基加 2mLPCVECS。培养 6个月的胚性细胞在体细胞胚诱导培养基中培养 15d后可见到白色半透明体细胞胚的发生 ,体细胞胚诱导率为 2 80× 10 3个 mLPCV。成熟体细胞胚的萌发率为 17 2 8% ,其中发育成正常的再生植株的百分率为 14 16 %。

香蕉胚性愈伤组织的诱导及胚性细胞悬浮系的建立

分别以3个香蕉品种的多芽体茎尖和5个香蕉品种的未成熟雄花为外植体,诱导产生胚性愈伤组织.结果分别从2个基因组类型为AAA的品种的多芽体茎尖和未成熟雄花获得了胚性愈伤组织,而未能从基因组类型为AAB或ABB的香蕉品种中获得胚性愈伤组织.胚性愈伤组织的诱导率受基因组类型、品种和培养条件等因素的影响.以上述4个品种的胚性愈伤组织为起始材料成功建立了胚性细胞悬浮系,不同香蕉品种,从其胚性愈伤组织建立胚性细胞悬浮系的难易程度有所不同.

水稻胚性悬浮细胞系建立过程中生理生化变化——Ⅱ.氨基酸、多胺及内源激素的变化

以水稻广亲和中粳品系02428为材料,分析了其胚性悬浮细胞系建立过程中氨基酸、多胺及内源激素的变化。结果表明:1.游离氨基酸的总量是FP_(15)>MP_(45)>LP_(90),其中FP_(15)游离精氨酸的含量很高,而在MP_(45)和LP_(90)中含量剧降。蛋白质氨基酸和蛋白质合成能力正好和游离氨基酸的总量变化相反。2.从FP_(15)→MP_(45)→LP_(90),腐胺含量呈上升、精胺含量呈下降趋势。腐胺/(精胺+亚精胺)上升了近20倍。悬浮细胞经脱壁而成游离原生质体后,其总多胺、尸胺和腐胺的含量与悬浮细胞相比均大幅度下降,而精胺和亚精胺则有所升高。3.植物内源激素IAA、2ip的含量是LP_(90)>MP_(45)>FP_(15),ABA、ZRs的含量是FP_(15)>MP_(45)>LP_(90)。上述变化在一定程度上解释了胚性悬浮细胞即后期悬浮细胞适合于进行原生质体培养的生理生化机理。

利用未成熟种子建立野生阿宽蕉胚性细胞悬浮系和植株再生的研究

以纵切的野生阿宽蕉60d龄未成熟种子为外植体,在MI1愈伤组织诱导培养基(MS大量和微量元素及铁盐+MorelandWetmore维生素+0.1mmol/LKH2PO4+87mmol/L蔗糖+4.5μmol/L2,4-D+1g/LGelrite)中培养60d后开始出现浅黄色松散的胚性愈伤组织,150d后愈伤组织诱导率为(15.11±1.95)%。该类愈伤组织被转移到含18μmol/L2,4-D的MI2培养基中继代60d后,可获得状态均一的理想的胚性愈伤组织。胚性愈伤组织悬浮培养后,通过2个月的筛选和继代培养,可得到均质的胚性细胞悬浮系。理想的胚性愈伤组织在体细胞胚诱导培养基中培养10d后可见到白色半透明体细胞胚的发生,体细胞胚诱导率为7.70×105个/gFW。成熟体细胞胚的萌发率为(33.33±3.37)%,植株再生率为(20.83±1.68)%。

棉花胚性细胞悬浮系的建立及其影响因素分析

对棉花悬浮细胞系建立过程中激素的配比和浓度、培养基成分、悬浮细胞的生长过程及衰老过程中PCD的发生系统研究结果表明:MS+2,4 D0.5mg·L 1+KT0.1mg·L 1和MS+2,4 D0.1mg·L 1+KT0.1mg·L 1培养基有利于细胞分裂,能产生体积较大,均匀一致,细胞活力强的单细胞和小细胞团,适合于进行细胞生长调控等研究。而MS+IBA0.5mg·L 1+KT0.1mg·L 1和MS+IBA0.1mg·L 1+KT0.1mg·L 1培养基则有利于形成大的细胞团和不同时期的胚状体,适合于进行胚状体的发育研究。钾盐、肌醇有利于细胞的分裂增殖,且能抑制胚状体的发生。可通过增加钾盐(K+)、肌醇含量来调节细胞的生长状态和细胞活性,以建成分裂增殖快、细胞活性强的悬浮细胞系。在悬浮培养过程中,管状细胞渐渐消失,被球状的单细胞和小细胞团所替代。棉花胚性愈伤悬浮细胞的生长曲线呈S形,在起始培养的0～3d是生长的延迟期;在第3～15天是指数增长期;到第15天以后,生长速度降低,是静止期。悬浮培养的棉花细胞必须在15d以前进行继代,以保持其旺盛的分裂能力和细胞活性。

甘薯胚性悬浮系的建立及其细胞生长特性研究

徐薯 18叶片接种在附加 2mg/L 2 ,4 D的MS固体培养基上 ,形成了质地松散的胚性愈伤组织 ,胚性愈伤组织在附加 1mg/L 2 ,4 D的MS液体培养基中进行悬浮培养 ,建立了增殖迅速、分散度良好的具有较高体胚分化能力的细胞悬浮系 .小型细胞团 (直径小于 35 0 μm)以 2 %～ 4%的接种量转移到无激素MS液体培养基中 ,可分化出大量体胚 .在继代初期 ,悬浮系 pH值呈下降趋势 ,细胞处于旺盛分裂时期 ,导致悬浮系鲜质量、干质量、细胞紧实体积(PVC)的显著升值 ;4d以后 ,pH值逐渐回升 ,细胞分裂缓慢而体积增长迅速 ,导致鲜质量、PVC增加而干质量少有变化 ;6d以后

从香蕉胚性细胞悬浮系获得再生植株

2个主栽香蕉品种的未成熟雄花诱导产生的胚性愈伤组织接种至液体培养基中, 经3～4个月的继代培养后长成质地均匀的胚性细胞悬浮系(ECS),悬浮系中60%～80%是胚性细胞团。ECS接种至体胚再生培养基上约4～5周后开始出现再生体胚,萌发的体胚以MS培养基培养后可获得再生植株。

甘薯胚性细胞悬浮培养系的建立(英文)

对甘薯胚性细胞悬浮培养系的建立进行了研究。将12个基因型的长约0.5mm的茎尖培养在含有0.2mg/L或2.0mg/L2,4-D的MS培养基上,形成了胚性愈伤组织。胚性愈伤组织的形成率因基因型和2,4-D浓度不同而有很大差异,为0％～75.7％。一方面,将胚性愈伤组织继续培养在含有2,4-D的MS培养基上,它们形成了处于各发育时期的体细胞胚。将具有体细胞胚的胚性愈伤组织转移到MS基本培养基上,体细胞胚发育成植株。再生植株的胚性愈伤组织频率为5.9％～56.4％。另一方面,将培养8周后形成的高系14号和新大紫的胚性愈伤组织用于细胞悬浮培养,建立了增殖迅速、分散程度良好的胚性细胞悬浮培养系。在含有2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基中振荡培养17周后,将直径约1.0mm的细胞团转移到含有2.0mg/L 2,4-D的MS培养基上,并进一步转移到含有1.0mg/L ABA的MS培养基和MS基本培养基上,实现了高频率的体细胞胚胎发生。在高系14号和新大紫中分别达到100.0％和53.6％,获得了大量再生植株。这些再生植株未有形态学变异。这样的胚性细胞悬浮培养系将成为细胞水平突变、体细胞杂交和遗传转化的理想供体。

荔枝胚性悬浮细胞系的快速建立及其体胚植株的再生

荔枝幼胚诱导的胚性培养物在低糖条件下连续继代4～6次左右,可筛选到颗粒细小、不含原胚的松散型胚性愈伤组织;以这种松散的胚性愈伤组织作为起始材料,在附加2,4-D2mg/L或2,4-D2mg/L、KT1mg/L、AgNO35mg/L的MS液体启动培养基上振荡培养(100～120r/min)10～14d,即可建立起分散性良好的胚性悬浮细胞系。采用激素减半的2种启动培养基交替继代培养或周期性固体-液体轮回培养,可以长期保持胚性悬浮细胞系。荔枝胚性悬浮细胞在附加NAA0.1mg/L、KT或Ze5mg/L、肌醇100mg/L、蔗糖50g/L、琼脂10g/L的MS固体培养基上诱导体胚,25～40d后可形成大量胚状体,诱导体胚数量达10,000个/gFW以上。经过成熟培养后,正常的体胚75%以上萌发再生完整植株。

水稻胚性悬浮细胞系建立过程中的生理生化变化

本文详细分析了水稻广亲和中粳品系02428胚性悬浮细胞系建立过程中的培养液渗透值、pH值,呼吸作用,过氧化物酶同工酶,碳、氢及矿质元素的变化。结果如下:1、前期、中期和后期悬浮细胞系（即胚性悬浮细胞系）的培养液渗透值在一次继代培养的0—3天期间剧升,并继续上升至第5天达峰值,尔后有所回降;培养液pH值的变化正好相反。2、中期和后期悬浮细胞比前期悬浮细胞更多地利用氨基酸作为代谢底物。后期悬浮细胞的EMP途径相对稍低,而HMP、TCAC途径较前期、中期稍强。3、从前期→中期→后期,过氧化物酶同工酶阴极区带显著变窄、减弱。后期的阳极区过氧化物酶同工酶也较前期为弱。4、后期悬浮细胞和前、中期悬浮细胞相比较,氮、镁的含量较高,而钙、铁的含量较低。上述生理生化变化与悬浮细胞能否适合于进行原生质体培养有一定的相关性。

抗冻蛋白(afp)基因表达载体的构建及对香蕉胚性细胞悬浮系的转化

通过PCR从‘京都七寸人参'胡萝卜基因组DNA中扩增抗冻蛋白基因,测序结果表明该基因的核苷酸序列与从宁夏‘吴忠'胡萝卜中克隆的完全一致。先后将获得的胡萝卜afp基因克隆和亚克隆至pMD18-T和pBI121,构建植物表达载体pBI121-afp。通过冻融法将pBI121-afp导入根癌农杆菌EHA105中。以香蕉栽培品种‘北大矮蕉'的胚性细胞悬浮系为受体,采用农杆菌介导法将胡萝卜afp基因导入其中,然后在Kanamycin的选择压力下通过体细胞胚发生途径进行植株再生。共获得抗性再生植株9株,其中两株经PCR检测呈阳性,可初步确定目的基因已经整合到这两株转基因香蕉植株的基因组中。

香蕉分生小球体途径胚性细胞悬浮系的建立

以 7个香蕉品种未成熟雄花为外植体均获得了分生小球体 (meristematicglobules)。分生小球体的诱导率因基因组型和品种而异 ,为 15%～ 81% ,分生小球体的特点及开始出现的时间也受基因组型和品种的影响。以分生小球体为起始材料 ,建立了‘广东 2号’、‘华农 7号’及‘河口龙牙’ 3个品种的胚性细胞悬浮系 。

马尾松胚性细胞悬浮增殖培养体系的建立

本研究利用马尾松未成熟胚诱导的胚性愈伤组织,首次建立马尾松胚性愈伤组织悬浮增殖培养体系。实验中定期对细胞生长参数沉淀细胞体积（SCV）、细胞活力进行了测定,研究了初始接种量,继代细胞密度对悬浮增殖培养体系建立的影响。研究结果表明：不同初始接种量、继代转接细胞密度显著地影响马尾松胚性细胞悬浮培养的效果;在悬浮培育过程中,胚性细胞的生长周期曲线呈＂S＂型,细胞活力呈现先急剧上升,后缓慢下降的趋势;本研究建立的马尾松胚性细胞悬浮增殖培养体系为：在30 mL的培养基中,初始接种1.0 g胚性细胞（平均增殖系数达12.097）,继代培育以1/6作为继代细胞密度,且继代周期为8～12 d为宜。本研究为优化调控马尾松体细胞胚胎发生胚性愈伤组织稳定增殖提供了技术支撑,同时为采用遗传转化及细胞融合等技术进行马尾松新品种选育奠定了研究基础。

四川‘竹根姜’胚性细胞悬浮系的建立与植株再生

选用四川省地方品种‘竹根姜’的茎尖组织建立了体细胞胚性细胞悬浮系,并通过悬浮培养获得了姜再生植株。结果表明悬浮细胞干质量受pH影响。接种量和AgNO3对悬浮细胞的生长都有影响:最佳接种量为1·0%,最适AgNO3浓度为6·0mg·L-1。胚性细胞悬浮系增殖后,接种到前期筛选的成熟分化培养基上获得了再生植株。

快速建立胚性细胞悬浮系的培养程序初探

为了缩短建立胚性细胞悬浮系的进程 ,快速获得松脆胚性愈伤组织 ,以普通小麦、大麦和多花黑麦草为材料 ,采用能促进植株再生的高浓度铜离子作为毒害筛选因子 ,以MSD培养基为基本配方 ,2 .5mg L的 2 ,4 D浓度 ,不同梯度浓度的铜离子处理愈伤组织。结果表明 ,0 .1mmol L的Cu2 + 对愈伤组织具有较好的筛选作用 ,能使松脆胚性愈伤组织保存下来 ,而其它类型愈伤组织褐化死亡。产生的松脆性愈伤组织能很快适应悬浮培养 ,从而快速建立胚性细胞悬浮系。用密实细胞体积及其斜面高度评价细胞悬浮系的特点 ,发现悬浮细胞不仅具有很强的生长势 ,提高了愈伤对营养缺乏的忍受度 。

宽皮橘蕉柑的胚性愈伤组织诱导、悬浮细胞系建立及植株再生

取蕉柑花后 5周幼果的幼胚接种于含不同浓度BA、KT与IAA组合的MT培养基上 ,结果表明 ,暗培养条件是蕉柑胚性愈伤组织诱导成功的关键 .胚状体在后期发育中畸形胚的比例很高 ,经切割后 ,在MT +BA2 .0mg·L-1+IAA0 5mg·L-1+蔗糖 0 0 3kg·L-1培养基上可诱导产生丛芽 ,诱导率为 2 6 7% .幼芽在 1/ 2MT +NAA 1 0mg·L-1培养基上生根率达到了 87 0 % .蕉柑胚性愈伤组织在MT液体培养基中不断地继代培养 ,可形成生长稳定的胚性悬浮细胞系 ,体胚诱导实验证明悬浮细胞系具有很强的体细胞胚胎发生能力 .

刺槐胚性细胞悬浮体系的建立

以刺槐（Robinia pseudoacacia L.）未成熟合子胚为外植体材料,通过对外植体取材时期、基本培养基营养物质质量浓度、细胞起始密度、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）质量浓度等影响悬浮培养的因素的研究,建立了良好的刺槐胚性细胞悬浮系。研究结果表明：授粉后55 d的未成熟合子胚是为刺槐细胞悬浮培养提供胚性愈伤组织的最佳起始材料;添加有2.5 mg·L^-1NAA和0.5 mg·L^-16-BA的1/2MS培养基为刺槐细胞悬浮培养的最适培养基;建立悬浮系的最适p H值范围在5.0-5.7;起始质量为2.0 g的悬浮系统其生长量增速较快,且细胞保持持续增长;当起始质量为3.0 g时,培养16 d后细胞进入缓慢增长期,且生长量有回落的趋势,起始质量为1.0 g时,细胞增殖速度非常缓慢,且容易出现褐化死亡的现象。