TP53BP2基因真核表达载体的构建及在人胚肾Expi293F细胞中蛋白表达、纯化及活性鉴定

目的构建人肿瘤抑制因子p53结合蛋白2(tumor suppressor p53-binding protein 2,TP53BP2)的重组真核表达载体,转染人胚肾Expi293F细胞,获得高纯度的重组人全长TP53BP2蛋白并对其进行生物学活性鉴定。方法利用UniProt网站查询TP53BP2基因序列,并进行Expi293F表达系统序列优化,通过同源重组连接至pcDNA3.1(+)-P2Ae GFP载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pcDNA3.1(+)-P2A-eGFPTP53BP2质粒瞬时转染至Expi293F细胞,荧光显微镜观察转染效率,收集实验组及对照组细胞,利用免疫印记试验(Western blot,WB)检测TP53BP2重组蛋白表达水平。通过His标签纯化试剂盒及Superdex 20010/300GL层析柱进行蛋白纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)对纯化后重组蛋白进行鉴定。利用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测重组人全长TP53BP2蛋白与p65蛋白结合情况。利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测重组人全长TP53BP2蛋白与p65蛋白共定位。利用表面等离子体共振(surface-plasmon resonance,SPR)技术,检测纯化后的重组人全长TP53BP2蛋白与TP53BP2抗体的相互作用。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP-TP53BP2构建成功。经荧光显微镜观察结果显示转染效率约为60%,WB结果表明TP53BP2蛋白在Expi293F细胞中过表达,证明转染成功。SDS-PAGE结果表明纯化后重组蛋白纯度在90%以上,证明纯化成功。Co-IP结果表明,TP53BP2重组蛋白可与p65蛋白相互作用。IF结果表明,His标签蛋白、TP53BP2蛋白及p65蛋白存在共定位,表明三者之间存在相互作用。SPR结果表明,纯化的重组人TP53BP蛋白与TP53BP2抗体具有较好的结合活性。以上结果均证明重组人全长TP53BP2蛋白具有生物学活性。结论成功构建了TP53BP2基因真核表达载体并在人胚肾Expi293F细胞中成功表达出具有生物学活性的重组人全长TP53BP2蛋白,为进一步研究TP53BP2的结构和功能奠定了基础。

茶多酚和维生素C对人胚肾293细胞缺糖缺氧损伤保护作用的比较

目的从细胞水平研究茶多酚(TP)对人胚肾293细胞缺糖缺氧性损伤的保护作用,并与抗氧化剂维生素C(VC)进行比较。方法采用缺糖培养基并以连二亚硫酸钠消除培养基中的氧,诱导产生缺氧缺糖损伤模型,测定细胞的存活率、乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及总抗氧化能力,并计算IC50。结果在细胞损伤模型中,TP和VC均表现出极强的抗氧化能力,TP能显著提高细胞的存活率、SOD活性和总抗氧化能力并抑制LDH的活性,TP的作用均大于VC。结论TP和VC体外具有强大的自由基清除作用,且呈现明显的剂量依赖性,TP在细胞损伤模型中的抗自由基作用均大于VC。

超声联合SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的研究

目的探讨超声协同微泡造影剂SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的方法。方法以不同的超声辐照时间、超声机械指数和不同浓度的微泡造影剂SonoVue的参数组合,将含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人胚肾293T细胞,接种于6孔板中,以荧光显微镜观察观察293T细胞中的绿色荧光蛋白表达情况并用流式细胞仪测算转染率。结果当微泡造影剂SonoVue浓度为40%、超声机械指数为1.0、辐照时间5 min时,质粒的转染率最高(28.11±1.63)%。结论超声联合微泡造影剂SonoVue能够作为载体介导质粒转染细胞,但需优化各项超声辐照的条件以达到最佳效果。

改构型酸性成纤维细胞生长因子对紫杉醇诱导的人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293损伤的保护作用

目的观察紫杉醇对人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293的毒性作用,及加入改构型酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)后对紫杉醇引起的肝肾细胞损害的保护,并探讨其可能机制。方法用紫杉醇诱导人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293损伤,同时加入aFGF对肝、肾细胞进行保护,并测定培养上清液中的SOD,MDA,LDH值,MTT法测定肝、肾细胞活性。结果紫杉醇在体外对人胚肝细胞L-O2、人胚肾细胞293有一定的毒性作用,使用aFGF对肝、肾细胞进行保护后,IC50值有明显的提高,SOD值与未加aFGF组相比明显升高,而MDA,LDH值明显降低(P<0.05)。结论 aFGF可有效对抗紫杉醇引起的肝、肾细胞损伤。

20(S)-原人参二醇对人胚肾293细胞生长的抑制作用

目的:研究20(S)-原人参二醇(PPD)对人胚肾293细胞(HEK-293细胞)生长抑制作用。方法:采用台盼蓝染色和噻唑蓝(MTT)法观察PPD对HEK-293细胞增殖的抑制作用,同时通过Hoechst33258染色和DNA Ladder方法测定PPD对HEK-293细胞凋亡影响。结果:PPD可明显降低HEK-293细胞存活率和细胞活性,半数抑制浓度(IC50)为21.8μmol/L。PPD处理后HEK-293细胞核出现典型的凋亡形态学的改变,琼脂糖电泳呈现明显的DNALadder条带。结论:PPD对HEK-293细胞生长有明显的抑制作用并有剂量依赖关系。

再生基因4(REG4)真核表达载体的构建及其蛋白在HEK293T细胞中的表达、纯化

目的构建再生基因4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV(regenerating islet-derived protein IV,Reg IV)。方法根据NCBI数据库REG4基因序列进行基因优化、合成,将其克隆至pCDNA3.4载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pCDNA3.4-REG4质粒瞬时转染至HEK 293T细胞(实验组),同时以pEGFP-C1质粒作为转染对照组,未转染重组质粒的HEK 293T细胞作为空白对照组。荧光显微镜观察转染对照组转染效率,分别收集实验组及空白对照组细胞和细胞培养液上清,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)与免疫印迹试验(Western-Blot,WB)检测Reg IV蛋白表达水平。通过镍柱及丙烯葡聚糖凝胶S-400(Sephacryl S-400)柱进行蛋白纯化,SDS-PAGE及WB对纯化后重组蛋白进行鉴定。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pCDNA3.4-REG4构建成功。转染对照组(pEGFP-C1质粒)荧光显微镜观察结果显示转染效率约50%,表明转染成功。WB结果显示仅在实验组(pCDNA3.4-REG4质粒)的细胞中检测到RegIV蛋白。镍柱纯化时目的蛋白无法与镍柱填料有效结合,SephacrylS-400凝胶柱层析纯化获得了此重组蛋白。结论成功构建了REG4基因真核表达载体并在HEK 293T细胞中成功表达,为深入研究Reg IV蛋白的作用机理及开发潜在的抗癌靶向药物奠定了基础。

葡萄籽原花青素对顺铂诱导人胚肾细胞凋亡的拮抗作用

目的:探讨葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin,GSPE)对顺铂(cisdiamminedichloroplatinum,CDDP)诱导人胚肾细胞HEK293凋亡及相关凋亡基因的影响,并探讨可能的机制。方法:体外培养正常HEK293细胞,噻唑蓝法测定GSPE、CDD P分别对HEK293细胞生长的影响以及GSPE对CDDP诱导HEK293细胞毒性的保护作用,流式细胞仪测定GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡率的变化,Western blotting测定GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。结果:GSPE对CDDP所致HEK293细胞毒性具有拮抗作用,可减轻CDDP所致HEK293细胞凋亡,减弱Bax表达、增强Bcl-2表达。结论:GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡具有拮抗作用,其机制可能与GSPE降低促凋亡基因Bax,升高抗凋亡基因Bcl-2的表达有关。

低聚葡萄籽原花青素对顺铂所致人胚肾细胞线粒体损伤的保护作用

目的:探究低聚葡萄籽原花青素(oligomeric grape seed proanthocyanidins,O-GSP)对顺铂(cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)导致的人胚肾细胞HEK293中线粒体损伤的保护作用及其作用机制。方法:通过试剂盒检测O-GSP、CDDP及O-GSP+CDDP处理后细胞中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、活性氧(reaction oxygen species,ROS)含量、细胞质内糖代谢酶(己糖激酶和乳酸脱氢酶)活力和线粒体糖代谢酶(苹果酸脱氢酶)活力变化情况,并采用流式细胞术对各组细胞ATP含量、线粒体膜电位变化以及细胞凋亡率进行检测。结果:O-GSP预处理极显著改善了CDDP引起的细胞内MDA含量升高,还原型GSH、ROS、ATP含量及线粒体膜电位降低和糖代谢异常(P<0.01),从而减轻了CDDP诱发的线粒体损伤,对HEK293细胞凋亡有极显著的缓解作用(P<0.01)。结论:O-GSP对CDDP所致HEK293细胞线粒体损伤具有拮抗作用,并且该作用与O-GSP的抗氧化活性有关。

构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体调控胚肾细胞增殖

背景:研究发现SMARCAL1在人类发育和成熟肾脏的多种细胞类型中选择性表达,表明其在肾脏发育过程中发挥着重要的功能作用。目的:探讨SMARCAL1过表达对于胚肾细胞增殖功能的影响。方法:取293T细胞和HEK293细胞的第3代细胞用于实验。选用pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO载体构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体,转染293T细胞包装慢病毒。实验分为3组:空白组为无处理的HEK293细胞;阴性对照组为转染空载病毒的HEK293细胞;SMARCAL1过表达组为转染SMARCAL1过表达病毒的HEK293细胞。对SMARCAL1过表达慢病毒转染后用嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞株。通过观察转染率来检测病毒滴度;荧光定量PCR和Western印迹法验证稳转细胞株;CCK-8和EdU染色法检测细胞增殖情况;进一步通过荧光定量PCR探讨对Wnt通路的影响。结果与结论:①SMARCAL1过表达质粒基因序列与目的基因一致,经慢病毒包装后测得SMARCAL1过表达慢病毒滴度为1×108 TU/mL,空载慢病毒滴度为3×108 TU/mL;②与空白组和阴性对照组比较,SMARCAL1过表达慢病毒转染后细胞中SMARCAL1 mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05),细胞增殖活力明显下降(P<0.05),Wnt通路中CTNNB1和WNT4基因表达水平降低(P<0.05);③实验结果表明,SMARCAL1过表达慢病毒载体构建成功并能够在细胞中顺利表达;SMARCAL1基因可能通过Wnt通信号通路参与调节胚肾细胞增殖,进而影响肾脏发育。

白花丹素的体外肾毒性及酸性成纤维细胞生长因子对白花丹素所致肾损伤的保护作用

目的:观察白花丹素在体外对人胚肾细胞293的毒性,以及酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对白花丹素所致肾损伤的保护作用。方法:采用四噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度白花丹素对人胚肾细胞293的毒性,以及aFGF对白花丹素IC50值的影响,并测定培养上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二酰二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性。结果:白花丹素在体外对人胚肾细胞293的毒性呈现剂量依赖性,24、48和72 h的IC50值分别为(150.421±3.014)、(88.426±1.965)和(84.811±1.035)μg/mL。在aFGF作用下,24、48和72 h的IC50值分别升至(342.624±2.887)(、176.835±1.097)和(133.278±1.124)μg/mL。aFGF保护组与白花丹素损伤组的SOD、MDA和LDH测定结果有显著性差异(P<0.05)。结论:白花丹素可抑制人胚肾细胞293的增殖,对肾脏有一定的毒性。aFGF对白花丹素所致肾损伤有明显的保护作用。

氯化两面针碱对肝、肾的毒性及酸性成纤维细胞生长因子对其的保护作用研究

目的:观察氯化两面针碱在体外对人胚肝细胞L-02,人胚肾细胞293的毒性作用,及酸性成纤维细胞生长因子(aF-GF)对氯化两面针碱引起的肝、肾细胞损伤的保护作用。方法:采用MTT法检测不同浓度氯化两面针碱对人肝、肾细胞的毒性,及加入aFGF后对肝、肾细胞的IC50值的影响。采用紫外分光光度法测定培养上清液中的SOD、MDA、LDH值。结果:aFGF可明显提高人胚肝细胞L-02、人胚肾细胞293的IC50值。aFGF保护组与氯化两面针碱损伤组的SOD、MDA和LDH测定结果有显著性差异(P<0.05)。结论:氯化两面针碱对人胚肝细胞L-02和人胚肾细胞293有一定毒性,加入aFGF后,可明显减轻氯化两面针碱对人胚肝细胞L-02和人胚肾细胞293的毒性作用。

6种人DNA甲基转移酶3B典型异构体的克隆、表达及对293A细胞增殖的影响

目的构建6种人DNA甲基转移酶(DNMT)3B典型的异构体的真核表达载体并对其进行过表达,初步探讨其在人胚肾细胞系293A中的生物学作用。方法以人HCT116 c DNA为模板,采用高保真PCR获得DNMT3B1和DNMT3B2的全长,并以DNMT3B2为模板,利用特异的引物扩增出DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5和DNMT3B7,将PCR产物连接到真核表达载体p CMV-2B上,并对上述载体进行Bam HⅠ、EcoRⅠ双酶切和测序鉴定,鉴定正确后,将重组质粒转染293A细胞并利用G418筛选出稳定表达的克隆株,MTT法检测细胞增殖活力。结果双酶切和测序结果表明克隆了6种人DNMT3B异构体CDS序列,经蛋白印迹检测,DNMT3B异构体在293A细胞中获得稳定表达;稳定过表达DNMT3B3、DNMT3B4和DNMT3B7可以抑制细胞增殖。结论构建了人DNMT3B异构体真核表达载体及获得了其稳定表达细胞株,DNMT3B异构体蛋白对胚肾细胞系293A的增殖有不同的作用。

人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

背景:人端粒酶反转录酶是端粒酶的重要组成之一,可使端粒酶表现活性从而拮抗端粒缩短或细胞衰老。目的:构建人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基真核表达载体,并在人胚肾细胞293T表达,为其在细胞内定位研究奠定基础。方法:以人端粒酶反转录酶cDNA为模板,PCR扩增出带有酶切位点其C端936-1132氨基序列片段,并与真核表达载体pcDNA3.1-HisA连接,构建出重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132,将重组质粒转染入人胚肾细胞293T中,使蛋白表达,并对蛋白进行免疫印迹鉴定。结果与结论:经双酶切和基因测序等方法证实,人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132构建成功,经免疫印迹鉴定可检出融合蛋白。

HEK-293细胞复苏培养及冻存

目的通过对人胚肾293细胞的复苏培养及其冻存的研究,为进一步行干细胞标记实验奠定基础。方法复苏培养人胚肾293细胞,倒置显微镜观察人胚肾293细胞的生长状况,计算细胞贴壁率,绘制细胞生长曲线,冻存保留细胞。结果人胚肾293细胞在普通培养条件下生长良好,6h后大部分细胞已经贴壁,8h细胞已完全贴壁。结论人胚肾293细胞采用改进方法复苏培养及冻存是简便可行的,为进一步行干细胞标记实验奠定了坚实的前期基础。

LC3真核表达载体构建及其在293T细胞中自噬诱导研究

【目的】构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并将其转染进人胚肾细胞293T,通过Earle's盐平衡液(Balanced salt solution,EBSS)饥饿诱导观察细胞自噬现象。【方法】RT-PCR扩增LC3基因,并将其插入pEGFP-N1真核表达载体构建重组质粒。将重组质粒转染至人胚肾细胞293T,显微镜观察、Western blot检测GFP-LC3融合蛋白表达情况。对转染细胞进行Earle's盐平衡液饥饿诱导,通过Western blot验证自噬指标,激光共聚焦显微镜观察自噬泡形成。【结果】成功构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并在293T细胞中成功表达目的蛋白,在进行Earle's盐平衡液饥饿诱导后观察到自噬泡的形成,Western blot检测到LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化。【结论】本实验为研究自噬在癌细胞病理进程中的机制提供了实验素材。

人CD7 cDNA在HEK293细胞中的表达

目的建立表达人白细胞分化抗原 CD7蛋白的哺乳动物细胞模型 ,为深入研究 CD7的功能奠定基础。方法采用 PCR方法扩增 CD7c DNA,将目的片段定向克隆于真核表达载体 pc DNA3 ,限制性内切酶酶切分析重组质粒并进行序列测定 ;通过电穿孔法将重组真核表达载体 pc DNA 3 / CD7转染于人胚肾 2 93细胞 ( HEK2 93 ) ,经 G4 18筛选得到抗性克隆 ;利用FCM检测 CD7分子在 HEK2 93细胞的表达。结果得到了含 CD7全长 c DNA的重组真核表达载体 pc DNA3 / CD7。FCM分析表明 :转染了 pc DNA3 / CD7的 HEK2 93细胞表达人 CD7蛋白。结论为深入研究

溶质转运体26A家族在HEK-293细胞中的表达和功能

目的构建能在HEK-293细胞膜上表达的溶质转运体26A家族(SLC26A)的蛋白质粒,并对其生理功能进行检测。方法构建多种人类SLC26A转运体-绿色荧光蛋白的融合质粒,并使用瞬时转染技术将其表达在人胚肾293细胞(HEK-293)中。用全细胞膜片钳技术记录表达有SLC26A蛋白的HEK-293细胞的膜电容。结果每个SLC26A转运体均能在HEK-293细胞的细胞膜上表达,并表现出和离子相互作用的生理功能。SLC26A转运体与离子结合的数目与其在细胞膜上的表达程度正相关并具有一定的离子选择性。结论 SLC26A转运体家族能够在HEK-293细胞上表达并具有与转运离子结合的生理功能。在HEK-293细胞系中表达SLC26A转运体家族的研究方法,为进一步研究此家族成员转运功能及其转运机制提供了可能。

不同浓度的多壁碳纳米管对HEK293细胞的影响

目的研究多壁碳纳米管(MWCNT)对正常人胚肾293细胞的增生及细胞活性的影响。方法采用离体培养的正常人胚肾293细胞株,接种入96孔板,细胞生长18h后加入不同浓度的单壁碳纳米溶液,碳纳米溶液作用于人胚肾293细胞48个h后,使用MTT(methyl thiazolyl tetrazoliun)比色法测每个孔的吸光值,计算人胚肾293细胞的生长抑制率并绘制细胞活性曲线。结果不同浓度的多壁碳纳米管对人胚肾293细胞具有不同程度的抑制作用,且当其浓度达到0.5μg/ml时对细胞出现显著的抑制作用。结论多壁碳纳米管能通过正常人胚肾293细胞膜进入细胞内,一定程度地影响细胞的活性,到达一定剂量时,细胞增生能力显著降低。因此,可以推测多壁碳纳米管对正常细胞生长作用有一定的安全剂量范围。

亚硫酸钠对人胚肾293细胞的毒性作用与胞内蛋白水平变化的关系

目的研究食品添加剂亚硫酸钠(Na2SO3)对人胚肾293细胞(HEK293)的毒性作用与胞内重要蛋白质p53、增殖细胞核抗原(PCNA)和三磷酸腺苷(ATP)结合转运子G2(ABCG2)含量改变之间的关系。方法采用细胞毒性试验(MTS)法观察Na2SO3对HEK293细胞的毒性作用,用蛋白印记法检测HEK293细胞中p53、PCNA和ABCG2蛋白水平。结果0.625～10mmol/L NaSO3处理组的细胞活性与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),说明NaSO3对HEK293细胞有明显的毒性作用;蛋白印记分析发现最高剂量组10mmol/L Na2SO3可同时降低细胞内p53、PCNA和ABCG2蛋白水平,而其余剂量组0.039～2.5mmol/L Na2SO3对HEK293细胞内p53、PCNA和ABCG2蛋白的水平无明显影响。结论在本试验条件下,当Na2SO3的接触浓度达到一定水平时对人胚肾293细胞具有明显的毒性作用,这种毒性作用很可能与其降低肾细胞内的蛋白水平,干扰肾细胞的正常功能相关。