苯并[a]芘和1-羟基芘诱导人胚胎干细胞分化心肌细胞ROS、CYP基因表达和DNA损伤

多环芳烃(PAHs)化合物中的苯并[a]芘和PAHs暴露检测标志物1-羟基芘与心脏功能障碍有关,但其生物学机制尚不清楚。为研究苯并[a]芘和1-羟基芘对心脏的毒性作用,基于人胚胎干细胞分化心肌细胞(hESC-CM)研究了苯并[a]芘和1-羟基芘对心肌细胞活性氧(ROS)生成、CYP基因表达和DNA损伤等的影响。结果表明,苯并[a]芘和1-羟基芘对h ESC-CM活性无影响,但能显著增强细胞ROS水平,诱导DNA损伤。此外,苯并[a]芘还能诱导细胞线粒体促凋亡基因的表达。研究表明,苯并[a]芘和1-羟基芘能通过诱导氧化应激和DNA损伤事件导致h ESC-CM损伤,在一定程度上解释了多环芳烃暴露导致心脏疾病的分子机制。

小鼠胚胎干细胞分化心肌细胞过程中基因表达情况和电生理特性研究

目的:探讨小鼠胚胎干细胞在体外分化心肌样细胞过程中αMHC、Anf、MLC2v基因的表达情况以及分化的心肌样细胞的电生理特点。方法:将转染PαMHC-EGFP小鼠D3胚胎干细胞系,体外诱导分化心肌样细胞,应用RT-PCR检测0d、3d、5d、7d、10d、14d拟胚体(EB)细胞中αMHC、Anf、MLC2v基因的表达情况,同时应用膜片钳技术,观察心肌样细胞的电生理特性。结果:在EB形成的7d和8d可见EB内出现有绿色荧光蛋白表达的心肌样细胞群;RT-PCR结果显示αMHC基因表达在EB体形成第7d,而在10d、14d跳动的心肌样细胞中该基因表达增强(P<0·05),而Anf、MLC2v基因的表达仅出现在心肌样细胞;膜片钳记录的心肌样细胞动作电位显示,73·5%(n=34)的细胞记录到典型心房肌细胞动作电位[APD90=(78·4±3·1)ms];20·5%细胞表现为起搏细胞动作电位[APD90=(112·6±5·5)ms];1个细胞显示了典型的心室肌细胞动作电位的特征(APD90=200ms)。结论:在心肌样细胞分化的早期可见αMHC、Anf、MLC2v基因的表达,这3种基因可为心肌发育过程中的特征性基因并对心肌发育起调节作用。而此干细胞系分化的心肌样细胞主要为心房肌细胞和起搏细胞。

溶血磷脂酸对胚胎干细胞分化心肌细胞L型钙通道电流的影响

目的诱导小鼠胚胎干(ES)细胞向心肌细胞分化并观察溶血磷脂酸(LPA)对分化心肌细胞L型钙通道电流(ICa-L)的影响。方法采用悬滴培养法诱导小鼠ES细胞向心肌细胞分化,逆转录-聚合酶链式反应及免疫荧光检测心肌细胞特异性标志物,全细胞膜片钳记录LPA0.1,1.0和10μmol/L对小鼠ES细胞分化心肌细胞ICa-L的影响。结果小鼠ES细胞成功向心肌细胞分化。0.1,1.0和10.0μmol/LLPA使分化心肌细胞ICa-L峰电流密度分别由用药前-6.8±0.7pA/pF增加到-8.9±1.2,-12.6±2.9和-16.6±3.5pA/pF(P<0.01或P<0.05)。结论LPA呈浓度依赖性促进小鼠ES细胞分化的心肌细胞ICa-L。

小鼠胚胎干细胞分化心肌细胞毒蕈碱受体的表达特征

为了探讨胚胎干细胞分化心肌细胞(ESCM)毒蕈碱受体的表达规律及β肾上腺素能系统对M2受体表达的影响,采用10-4mol/L维生素C体外诱导小鼠M13胚胎干细胞分化为心肌细胞,用RT-PCR检测到分化后的细胞表达心肌细胞特异性基因Nkx2.5和β肌球蛋白重链;用免疫荧光法检测到分化后的细胞表达心肌细胞特异性标志物α辅肌动蛋白.小鼠胚胎干细胞分化前表达M1和M2毒蕈碱受体,在分化过程中,M1受体表达逐渐下降,M2受体表达在第3d显著下降,此后表达逐渐增加,在第14d达到高峰;Western印迹结果显示,异丙肾上腺素明显抑制M2受体的表达,选择性β1肾上腺素受体拮抗剂CGP20712A明显上调其表达,而选择性β2肾上腺素受体拮抗剂ICI118551对其表达无影响.本实验表明,小鼠胚胎干细胞分化心肌细胞表达毒蕈碱受体,β肾上腺素能系统对M2受体表达有调控作用.

小鼠胚胎干细胞分化心肌细胞血管紧张素Ⅱ 1型和2型受体的表达特征

胚胎干细胞(ESC)具有无限增殖和分化为体内3个胚层来源的各种类型组织细胞的潜能,经过体外诱导能够分化为心肌细胞,亦称为胚胎干细胞分化心肌细胞(ESCM).本研究探讨了ESC诱导分化心肌细胞过程中血管紧张素Ⅱ受体(ATR)的亚型AT1R和AT2R的表达特征.10-4mol/L维生素C体外诱导小鼠R1胚胎干细胞分化为自发搏动的心肌细胞,用免疫荧光法检测分化后的细胞表达心肌细胞特异性标志物α辅肌动蛋白.小鼠胚胎干细胞在诱导分化为心肌细胞以后,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时定量RT-PCR(Real-timeRT-PCR)方法检测到ESCM表达AT1R,并且呈时间依赖性逐渐增加的特点,在第14d达到高峰.Western印记法检测AT1R表达特征与RT-PCR结果相符.Western印记法的结果显示,血管紧张素Ⅱ(10-6mol/L)可作为AT1R激动剂激活AT1R,并使其下游的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)磷酸化水平上调,预孵育AT1R抑制剂Losartan(10-6mol/L),此作用被抑制.RT-PCR方法显示,与新生小鼠心室肌细胞相比,ESCM的AT2R表达水平较低.

L-抗坏血酸促进人胚胎干细胞向心肌细胞分化的研究

目的用不同浓度的L-抗坏血酸(VitC)作为分化基础培养液中的诱导剂,观察其对人胚胎干细胞(hESC)分化为心肌细胞的影响,探寻一种成分明确、成本低廉且高效的诱导方法。方法复苏hESC,使用干细胞培养液培养至细胞融合度90%后,分别用含不同浓度(0、10、20、30、40、50、60、70μmol/L)VitC的分化培养液对其进行诱导分化,在光学显微镜下观察分化过程。用实时定量聚合酶链式反应(real-time PCR)分别检测干细胞特异性标志物Nanog和性别决定因子同源盒2(Sox2),心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心脏特异性同源盒转录因子(Nkx2.5)的表达。用免疫荧光检测Nanog、cTnT、Nkx2.5的蛋白表达变化。结果在分化基础培养液中,低浓度VitC(10~30μmol/L)不能诱导h ESC向心肌分化,随着VitC浓度的增高,干细胞逐渐往心肌方向分化,心肌分化效率逐渐提高,Nanog和Sox2的表达量逐渐下降;VitC浓度为40μmol/L或50μmol/L组在第8天开始出现自发跳动细胞,且有cTnT和Nkx2.5阳性表达。realtime PCR结果显示随分化时间延长,cTnT和Nkx2.5的mRNA表达逐渐增加,心肌表面标志物Nkx2.5、cTnT的mRNA表达量在VitC浓度40μmol/L和50μmol/L要比60μmol/L和70μmol/L的诱导效果更高。提示浓度大于60μmol/L就开始出现抑制分化的作用。结论实验研究证实VitC在hESC向心肌分化中是不可或缺的因子,研究还明确了VitC诱导h ESC分化为心肌细胞的适宜浓度范围。

巨噬细胞迁移抑制因子对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的影响

背景:巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一种具有多效性作用的细胞因子,可以在不同类型干细胞中自分泌并且能调控细胞的增殖、分化和迁移。课题组前期研究证实人胚胎干细胞自分泌MIF,且在培养液中浓度基本固定。然而,MIF是否参与了人胚胎干细胞的存活、增殖和分化尚不清楚。目的:探究MIF对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的作用。方法:(1)培养人胚胎干细胞H9,CCK-8法检测并绘制细胞生长曲线,采用酶联免疫吸附法定量检测培养基中MIF水平。(2)为了明确外源性MIF对人胚胎干细胞存活、增殖的影响,分为:对照组,细胞在干细胞培养基中正常培养;外源性MIF组,在干细胞培养基中分别添加30,100,300 ng/m L的MIF;MIF抑制剂ISO-1组,在干细胞培养基中分别添加2,7,21μmol/L的ISO-1;MIF+ISO-1组,在不同浓度ISO-1组中分别添加100 ng/m L MIF,采用CCK-8法检测上述各组细胞活力。(3)为进一步阐明MIF基因对人胚胎干细胞存活、增殖的影响,采用CRISPRCas9技术构建MIF敲除的H9细胞系,观察建系情况。(4)为了明确高浓度MIF对人胚胎干细胞初步分化是否有影响,在培养基中分别添加100 ng/m L MIF和100 ng/m L CXCR4中和抗体,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)、免疫细胞荧光、蛋白质印迹法(Western blot)检测干细胞自我更新因子(KLF4、c-MYC、NANOG、OCT4、SOX2)及分化转录因子(FOXA2、OTX2)的表达水平。结果与结论:(1)人胚胎干细胞H9的对数生长期为3-6 d,正常生长的情况下自分泌MIF水平约为20 ng/m L,与细胞量无关;(2)与对照组相比,添加不同质量浓度MIF对人胚胎干细胞的增殖无影响(P>0.05);ISO-1明显抑制人胚胎干细胞的增殖,ISO-1浓度越大,抑制越明显(P<0.05);ISO-1中添加MIF可以减少ISO-1的抑制作用(P<0.05);(3)RT-q PCR检测MIF基因敲除约50%后,人胚胎干细胞生长活力显著降低并且无法建系成功;(4)在培养基中添加100 ng/m L外源性MIF,自我更新转录因子KLF4的m RNA、蛋白及荧光表达水平均下降;分化因子FOXA2的m RNA、蛋白及荧光表达水平均上升;(5)在培养基中添加100 ng/m L CXCR4中和抗体,KLF4的m RNA及蛋白表达水平均上升;FOXA2的m RNA及蛋白表达水平均下降,与MIF组表达趋势相反。综上所述,人胚胎干细胞自分泌的MIF是其存活所必需的;培养基中额外添加MIF并不能促进人胚胎干细胞增殖,但可以使自我更新因子KLF4表达下降,转录因子FOXA2表达上升,为下一步探明MIF对人胚胎干细胞分化的影响及机制提供了线索,MIF-CXCR4轴在其中起到一定的调控作用。

利用胚胎干细胞骨分化实验评价Cry1Ab蛋白的发育毒性

目的通过小鼠胚胎干细胞骨分化实验研究Cry1Ab蛋白对胚胎干细胞成骨分化过程的影响,以评估Cry1Ab蛋白的发育毒性。方法以Cry1Ab蛋白为受试物,设置5个剂量(125,250,320,1000,2000 ng/ml)染毒小鼠胚胎干细胞形成的拟胚胎体(embryonic body,EB),设置溶剂对照和阳性对照,同时向培养基中添加β-甘油磷酸盐(10 mmol/L)、抗坏血酸(50μg/ml)和维生素D3(500μmol/L)诱导EB向骨细胞分化,通过茜素红S染色和吸光度检测确定骨细胞钙化结节生成情况;收集EB制备细胞裂解液,通过BCA法测量细胞总蛋白浓度,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒检测细胞裂解液中ALP活性;收集EB样本提取总RNA,通过qPCR检测骨细胞分化相关标志物Runx2、SPARC和I型胶原的基因表达情况。结果与对照组相比,不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的EB细胞团大小、钙化结节数量无统计学差异(P>0.05);Cry1Ab蛋白各浓度组的细胞总蛋白浓度和ALP活性与对照组相比无统计学差异(P>0.05);Cry1Ab蛋白各浓度组的Runx2、SPARC和I型胶原基因表达水平与对照组相比均无统计学差异(P>0.05)。结论本次试验中,未观察到Cry1Ab蛋白对小鼠胚胎干细胞成骨分化过程产生影响,125~2000 ng/ml的Cry1Ab蛋白不具有发育毒性。

机械牵张对人诱导多能干细胞分化来源的心肌细胞成熟的影响

目的通过使用标准的化学定义和基于小分子诱导方案(chemically defined medium,3 components,CDM3)获得人诱导多能干细胞分化来源的心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs),进一步对其施加机械牵张,探讨机械牵张对hiPSC-CMs成熟的影响及潜在机制。方法复苏、培养和鉴定hiPSCs后,将hiPSCs接种到覆有基质胶的传统培养皿上。24 h后在荧光显微镜下通过DAPI荧光观察细胞生长情况,并通过八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)荧光进行hiPSCs干性鉴定,在细胞汇合度达到80%时更换CDM3分化培养基,分化6 d后将获得的hiPSC-CMs分为对照组和机械牵张组,拉伸结束后重新种板培养24 h后在荧光显微镜下通过DAPI荧光观察细胞生长情况,通过心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)和肌球蛋白轻链2V(myosin light chain 2V,MLC2V)荧光进行hiPSC-CMs心肌细胞标志物鉴定,Piezo1荧光进行潜在机制研究。结果hiPSCs培养24 h免疫荧光显示:OCT4发出绿色荧光,hiPSCs保持干性。DAPI发出蓝色荧光:细胞呈克隆生长,细胞形态均一。机械牵张结束后重新种板培养,24 h后免疫荧光显示机械牵张组较对照组心肌标志物cTnT和MLC2V表达增高(P<0.05);机械牵张组较对照组机械敏感型离子通道Piezo1蛋白表达增高(P<0.05)。结论机械牵张可以促进人诱导多能干细胞分化来源心肌细胞的成熟,这可能与Piezo1蛋白表达增高有关。

丹参诱导pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞分化的作用

目的:观察丹参对pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞分化的诱导作用。方法:采用悬浮法,从拟胚体形成的第4、5、6、7d起在培养液中加入不同浓度的丹参诱导pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞分化,计数第8、9、10、11、12d心肌细胞的分化率。用RT-PCR方法检测分化的心肌细胞αMHC、Anf、MLC2v基因的表达。结果:10、30、50、70mg/ml丹参在拟胚体形成的第10、11、12d均可明显提高心肌细胞的分化率(P<0.01)。RT-PCR结果αMHC、Anf、MLC2v基因在分化的心肌细胞中表达。结论:丹参可以体外提高pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞的分化率。

胚胎干细胞体外分化为心肌细胞诱导因素的探讨

目的：用胚胎干细胞（ＥＳＣ）体外诱导分化为心肌细胞，从分子水平上研究早期心脏发育相关基 因及其功能。方法：（１）胚胎干细胞的培养。（２）胚胎于细胞的分化培养。（３）被分化的心肌细胞鉴定：ＲＮＡ的 提取；心脏特异性引物的合成和ＲＴ－ＰＣＲ反应；探针标记、纯化和比放射活性测定；ＲＮＡ斑点杂交。结果：用最 适条件培养液对ＦＳＣ定向诱导分化，可使８０％以上的ＥＳＣ分化为心肌细胞。心肌细胞以同步的方式进行收缩。 反转录ＰＣＲ和斑点杂交的结果显示：心肌在早期发育就开始表达其特异性基因。结论：胚胎干细胞体外能诱导 分化为心肌细胞。胎牛血清、二甲基亚砜和维甲酸的浓度及它们之间的组成不同，对ＥＳ细胞定向诱导为心肌 细胞均有影响。最佳诱导条件是用２ｎｍｏｌ／Ｌ维甲酸、０．６％二甲基亚砜和２０％胎牛血清组成的条件培养液。

体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的初步研究

目的 :5 -氮胞苷作为分化诱导剂 ,初步探讨其单独或联合全反式维甲酸应用时对小鼠胚胎干细胞(mESC)分化为心肌细胞的影响 ,旨在建立一种体外诱导mESC分化为心肌细胞的实验方法。方法 :采用MTT法确定 5 -氮胞苷的非细胞毒性参考剂量。设计不同条件培养基 (5 -氮胞苷单独或配伍全反式维甲酸应用 )对mESC进行诱导分化 ,并通过免疫组化技术及RT -PCR方法等对分化细胞进行鉴定。结果 :5 -氮胞苷的非细胞毒性参考剂量为 8μmol/L ,能够诱导mESC分化为心肌合胞体 (与阴性对照组比较 ,P <0 0 1) ,诱导分化率可达 5 0 %。配伍全反式维甲酸持续诱导的结果等同于单独应用全反式维甲酸的作用效果 (P >0 0 5 ) :即对ESC向心肌细胞的诱导分化没有促进作用。结论 :5 -氮胞苷能够诱导mESC分化为心肌合胞体 ,从而得以建立一种体外诱导mESC分化为心肌细胞的方法。

与胎儿心肌细胞共同培养诱导人胚胎干细胞发生心肌样分化

目的了解与胎儿心肌细胞共同培养对人胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）向心肌方向分化的影响。方法通过酶消化法从流产胎儿中分离培养出胎儿心肌细胞及成纤维细胞，将后者用丝裂霉素处理后制备成滋养层；收集辅助生育中心施行试管婴儿后所剩余的健康胚胎，取内细胞团接种在滋养层上分离培养出人ESCs。用荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridzation，FISH）方法来检测上述两种细胞的XY染色体，选用不同性别的胎儿心肌细胞与2—5代人ESCs以1：2的比例混合，然后以5×10^4／cm^2的密度接种于培养皿中进行共同培养，诱导其向心肌方向的分化。将未与胎儿心肌细胞混合的人ESCs以相同密度接种于培养皿中作为阴性对照。至第5天收集共同培养的细胞，进行双重染色，即FISH染色及心肌特异性蛋白Desmin或cTnⅠ免疫组化染色。结果在与胎儿心肌细胞共同培养5d后，40％～50％的人ESCs在心肌细胞的诱导下表达心肌特异性蛋白Desmin或cTnⅠ，而没有进行共同培养的人ESCs不表达上述蛋白。结论与胎儿心肌细胞的共同培养能诱导人ESCs发生向心肌方向的分化，人ESCs有望成为心肌干细胞移植的细胞材料。

成熟心肌细胞诱导胚胎干细胞定向分化为心肌样细胞

目的:拟证实成熟心肌细胞对胚胎干细胞(ESCs)定向分化的诱导作用。方法:分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,以DAPI(4’6-联眯-2-苯基吲哚)染核作为细胞标记。取昆明小鼠3.5-4d的囊胚培养后分离出ESCs,以1和(或)2代的小鼠ESCs细胞团与心肌细胞共培养。录像动态观察ESCs向心肌细胞分化的情况;分别于共培养后3、7、14d对ESCs行肌钙蛋白T(cTnT)免疫荧光染色检测。结果:1代或2代的ESCs和/或细胞团与心肌细胞共培养约7d左右出现成节律搏动的心肌样细胞;最好实验批次,可计数到1/4以上的ESCs和/或ESCs细胞团出现节律性搏动。心肌细胞共培养体系中添加0.6%DMSO时,节律搏动的心肌样细胞分化率未见提高。心肌细胞诱导组,记录已搏动和未搏动ESCs诱导分化后心肌样细胞cTnT蛋白荧光染色阳性;ESCs与心肌成纤维细胞共培养诱导组,分化的细胞cTnT蛋白荧光染阴性;0.6%DMSO诱导组约3%的细胞cTnT蛋白荧光染色阳性;DMSO联合心肌细胞诱导组,结果与单纯心肌细胞诱导组相似。结论:未经建系操作的ESCs可直接诱导分化为节律搏动的心肌细胞;成熟心肌细胞与ESCs共培养状态下,成熟心肌细胞是ESCs定向分化较强的诱导因素。

诱导体外培养小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞方法的研究

目的 :采用布法罗大鼠肝细胞条件培养基代替重组LIF ,建立在不加任何化学诱导剂的情况下诱导体外培养小鼠胚胎干细胞 (ES细胞 )分化为心肌细胞的方法。方法 :在诱导分化实验前 ,应用BRL条件培养基来维持ES细胞生长和抑制其分化 ,并采取将悬滴培养法和聚集培养法结合起来 ,分三步诱导ES细胞分化的方法。结果 :分化细胞中可见节律性收缩的细胞 ,经超微结构分析和免疫细胞学鉴定为心肌细胞。结论 :本法无需添加化学诱导剂 ,为一种简便、经济的诱导体外培养小鼠ES细胞分化为心肌细胞的方法。

抗坏血酸体外诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的:探讨抗坏血酸作为诱导剂对小鼠胚胎干细胞(mESC)分化为心肌细胞的影响,建立一种体外诱导mESC分化为心肌细胞的实验方法。方法:采用直接悬浮培养法使mESC形成拟胚体(EBs),用含不同浓度抗坏血酸的分化培养基对其进行诱导分化,摸索最佳的诱导分化条件。结果:抗坏血酸诱导mESC分化为心肌细胞的最佳浓度为0.1mg/ml,约为70%的EBs出现跳动的心肌合胞体,显著高于不添加任何诱导剂的对照组。抗坏血酸诱导产生的心肌细胞表达多种心肌蛋白,具有心肌细胞的结构特征。结论:抗坏血酸能够促进mESC向心肌细胞分化,应用抗坏血酸体外诱导mESC向心肌细胞分化是一种较为理想的体外诱导方法。

诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的 :分别使用布法罗大鼠肝细胞 (buffaloratsliver,BRL)条件培养基或鼠胚成纤维细胞 (mouseembry onicfibroblast,MEF)饲养层体外培养 ,比较不同培养条件对胚胎干细胞 (embryonicstemcells,ESC)分化为心肌细胞的影响。方法 :用BRL条件培养基或MEF饲养层抑制ESC分化并保持其增殖 ,以维甲酸 (retinoicacid ,RA)、二甲基亚砜 (DMSO)、转化生长因子 β1(TGF β1)、激活素 A(activin A)为分化诱导剂 ,组合成 6种分化培养基 ,采用悬滴、悬浮、贴壁三步法诱导ESC分化为心肌细胞 ,比较各组分化比率。结果 :BRL及MEF饲养层两种条件均能促进ESC增殖 ,6种分化条件均能使ESC分化为心肌细胞 ;其中以BRL条件培养基培养 ,TGF β1(2ng·ml-1)、activin A(2 0ng·ml-1)及 2 0 %胎牛血清 (fetuscalfserium ,FCS)组成的分化培养基可以使 (92 .8± 2 .2 ) %的ESC分化为心肌细胞 ,分化比率显著高于其它各组 (P <0 .0 1)。结论 :以BRL条件培养基培养 ,TGF β1、activin A细胞因子组合是一种理想的ESC体外分化体系。

比较体外不同条件诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的比较体外不同分化条件下胚胎干细胞(ESC)分化为心肌细胞的分化比率。方法用布法罗大鼠肝细胞(BRL)条件培养基抑制ESC分化及保持其增殖,以维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)、转化生长因子β1(TGF-β1)及激活素-A(activin-A)为分化诱导剂,组合成6种分化培养基,采用悬滴悬浮、贴壁三步法诱导ESC分化为心肌细胞,比较各组分化比率。结果6种分化条件均能使ESC分化为心肌细胞,其中以TGF-β1(2μg/L)、activin-A(20μg/L)及20%胎牛血清(FCS)组成的分化培养基可以使高达9280%±222%的ESC分化为心肌细胞,分化比率显著高于其它各组(P<001)。结论以BRL条件培养基培养,TGF-β1、activin-A作分化诱导剂可作为一种理想的ESC体外分化体系。

与心肌细胞共培养的小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞分化

目的探讨心肌细胞促进胚胎干细胞（ESCs）分化为心肌样细胞的诱导作用。方法收集小鼠3.5 d胚龄的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,4-5 d后取内细胞团接种在饲养层上分离培养出ESCs。取3-5代ESCs,先将ESCs悬浮培养形成2-3 d的拟胚体（EBs）,再与新生大鼠心肌细胞共培养诱导向心肌细胞分化,相差显微镜下观察分化细胞的形态学变化,免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T（TnT）、α-肌动蛋白（α-actin）的表达。结果诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的拟胚体出现,12 d时第2组约有93%的拟胚体出现节律性收缩,显著高于其他各组,均表达心肌细胞特异性蛋白cTnT、β-actin,心肌细胞直接接触诱导组其分化比率达56.5%,高于其他各组,并且分化的细胞形态较单一。结论心肌细胞和心肌细胞裂解液均可诱导ESCs向心肌细胞定向分化,且心肌细胞的诱导作用强于心肌细胞裂解液。

悬浮培养诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞的研究

目的:利用不加任何诱导剂的悬浮培养法,体外诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞并检测其分化效率。方法:人胚胎干细胞克隆用200U/mL胶原酶Ⅳ,370C处理10min后,挑起克隆碎片转移到低黏附性培养皿中悬浮培养以形成EB(拟胚体),4d后将EB转移到基质胶处理过的6孔板中贴壁培养(1-3EBs/cm2),显微镜下观察记录出现跳动心肌细胞的时间和跳动频率,并计算跳动克隆百分比,24孔板一组,共记录4组96孔;免疫荧光染色检测心肌细胞特异标志物cTnT;膜片钳实验检测心肌细胞自发性动作电位;跳动心肌细胞经过24h缺氧刺激后,用凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡比例。结果:在悬浮培养14d左右开始出现大量的自发跳动心肌细胞,分化出现自发跳动心肌细胞的平均时间(13.9±0.9)d,百分比为20.8%,平均跳动频率为(63.8±5.6)次/min;跳动心肌细胞cTnT染色阳性;跳动心肌细胞检测到自发性动作电位;跳动心肌细胞缺氧24h的凋亡比例为(8.1±0.4)%。结论:不加诱导剂的悬浮培养可以诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,分化效率达到20.8%,分化时间14d左右。为进一步的干细胞移植治疗动物心肌梗死模型提供种子细胞。