胚胎神经干细胞移植及胶质细胞源性神经营养因子对大鼠脊髓损伤的修复作用

将胚胎神经干细胞 (neuralstemcells,NSCs)移植至成年大鼠损伤的脊髓 ,观察移植后NSCs的存活、迁移以及损伤后的功能恢复。实验结果显示 :动物NSCs移植 4周后 ,斜板实验平均角度和运动评分结果比对照组均有明显增高 (P <0 0 5 ) ,而脊髓损伤 (spinalcordinjury,SCI)处的空洞面积显著减小 (P <0 0 5 ) ;在NSCs中加入胶质细胞源性的神经营养因子 (glialcellline derivedneurotrophicfactor,GDNF)后 ,上述改变更加显著。移植后的NSCs不仅能存活 ,而且向损伤的头端和尾端迁移达 3mm之远。这些结果表明 ,移植的NSCs不仅可以存活、迁移 ,还可减小SCI空洞面积 ,促进动物神经功能的恢复 ;此外 。

小鼠胚胎神经干细胞海马移植对APP/PS1双转基因AD小鼠的治疗作用

目的在APP/PS1双转基因阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)小鼠观察神经干细胞(nerual stem cells,NSCs)移植后细胞的存活、迁移以及对小鼠记忆功能的影响。方法增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒转染培养胚胎NSCs,小鼠海马内移植,水迷宫实验检测小鼠认知功能。结果EGFP转染NSCs海马内移植2个月后可观察到GFP阳性细胞,大部分分布在针道附近,部分向同侧皮层迁移,亦有部分通过胼胝体向对侧大脑迁移,同时小量细胞发出类似于神经元的长突起。AD小鼠的记忆功能明显改善。结论胚胎NSCs海马内移植后能存活、迁移并分化为神经组织细胞,并能显著改善APP/PS1双转基因AD小鼠的认知功能障碍。

丙泊酚对大鼠胚胎神经干细胞增殖及分化的影响

目的探讨丙泊酚对体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)增殖及分化的影响。方法采用孕14～16 d Wistar大鼠,进行NSCs原代培养并用Nestin鉴定,按以下给药分成六组:空白对照组(control)、脂肪乳对照组(introlipid)、丙泊酚不同浓度组[5、25、50、100μmol/l],用5-溴脱氧尿(Brdu)掺入法观察丙泊酚对胚胎神经干细胞增殖的影响。胚胎神经干细胞诱导分化过程中加入50μmol/l丙泊酚,采用NeuN、GFAP免疫组化法观察丙泊酚对胚胎神经干细胞分化的影响。结果分离培养的神经干细胞95%以上呈Nestin阳性,不同浓度丙泊酚组Brdu阳性细胞百分数没有差异,丙泊酚NeuN阳性细胞百分数(23.1±0.9%)明显高于对照组(13.4±0.8%)(P<0.05),而GFAP细胞阳性细胞数与对照组相比没有明显差异。结论临床相关剂量丙泊酚对体外培养大鼠神经干细胞增殖没有影响,但能诱导神经干细胞向神经元细胞分化。

人胚胎神经干细胞移植治疗大鼠脊髓完全横断损伤

目的:探讨利用人胚胎神经干细胞(hNSC)移植治疗大鼠脊髓完全横断损伤的效果。方法:分离、培养和鉴定hNSC。将培养的hNSC植入脊髓完全横断的Wistar大鼠损伤局部,并设DMEM-F12培养液注射组(对照组)。移植术后第1、2、4、6、8、10周对两组大鼠进行BBB运动功能评分,观察脊髓功能恢复情况;并取损伤处脊髓组织行免疫组织化学染色,了解双苯亚甲胺(Hoechst)标记的移植细胞在体内存活和分化情况。结果:体外细胞培养可获得大量hNSC;细胞移植4周后,实验组的BBB运动功能评分较对照组明显提高(P<0.01);第4周、第10周免疫组化结果示移植的hNSC在损伤脊髓内存活、分化形成神经元和神经胶质细胞,并向损伤脊髓头尾两侧迁徙。结论:hNSC移植后仍保持其多向分化能力;hNSC移植可改善脊髓全横断损伤大鼠的运动功能。

bFGF和EGF对胚胎神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的影响

目的:观察碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）对体外培养胚胎神经管神经干细胞生长和分化的影响。方法:从孕12天大鼠胚胎神经管分离神经干细胞,进行原代培养,分为bFGF组、EGF组、bFGF+EGF组及对照组:培养过程中观察干细胞的生长,培养2小时做nestin染色鉴定神经干细胞,培养第5天用免疫组化方法检测培养细胞神经元特异烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达,以观察神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的状况。结果:取材细胞大部分为netin兔疫阳性细胞;各实验组均可促进培养细胞的生长和分化。免疫组化中,EGF使神经干细胞增殖成团,增加GFAP的表达（P<0.01）;bFGF能明显增加NSE及GFAP的表达（P<0.01）;两种因子联合应用,神经元和神经胶质细胞均比对照组增多（P<0.01）。结论:EGF和bFGF两类生长因子均能促进胚胎神经干细胞的生长,在分化方面,EGF倾向于诱导干细胞增殖并向着胶质细胞分化,bFGF则诱导干细胞分化成更多的神经元。

人参皂苷Rg_1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的影响

目的探讨人参皂苷Rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的影响。方法从孕16天SD大鼠胚胎脑组织中分离培养胚胎神经干细胞,免疫组化法进行神经干细胞的鉴定及增殖鉴定,采用稀释法筛选和检测人参皂苷Rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的影响。结果剂量筛选结果显示,人参皂苷Rg1组(100、4、0.8μmol/L)神经球数明显增加。选定人参皂苷Rg140、4、0.4μmol/L作为高、中、低剂量进行进一步实验研究,与对照组相比,人参皂苷Rg1高、中、低剂量组神经球生成数目明显增加。结论人参皂苷Rg1可以明显增加神经球生成数目,具有促进胚胎神经干细胞体外增殖的作用。

bFGF对胚胎神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的影响

本研究观察了碱性成纤维生长因子对胚胎神经干细胞生长和分化的影响。从孕 12 d大鼠胚胎神经管分离神经干细胞 ,进行体外培养 ,分为碱性成纤维生长因子组及对照组。培养过程中观察神经干细胞的生长 ,于培养第 3、5、10 d用免疫组化方法检测培养细胞神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达 ,以观察神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的状况。碱性成纤维生长因子可明显地促进培养细胞的生长和分化。免疫组化细胞计数显示 ,培养第 3 d,特异烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数均明显增加 ;培养第 5 d,特异烯醇化酶阳性细胞数是对照组的 1.9倍 ,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数为对照组的 1.6倍 ,前者表达增加明显 ;培养第 10 d,两者的阳性细胞数仍高于对照组 ,但增加不明显。不同培养时间的胞体最长突起长度也均高于对照组 ;胞体直径及表面积随培养时间延长而增大。说明 ,碱性成纤维生长因子既能促进胚胎神经干细胞的生长 ,也可促使其分化为神经元及神经胶质细胞 。

溶血磷脂酸促进离体大鼠胚胎神经干细胞的增殖及其向胆碱能神经元分化(英文)

溶血磷脂酸（1ysophosphatidic acid，LPA）是一种细胞外磷脂信号。本研究用[^3H]-胸腺嘧啶掺入法、免疫细胞化学和Western blot等技术，观察了LPA对体外培养的大鼠胚胎神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的增殖以及向MAF2标记的一般神经元和ChAT标记的胆碱能神经元的分化的影响。结果显示：（1）在特殊的无血清培养基中加入低浓度的LPA（0．01-1．0μmol/L）后，NSCs对【^3H】-胸腺嘧啶的摄入呈剂量依赖性增加，表明LPA对NSCs有显著的促增殖作用；（2）在培养基中加入胎牛血清以诱导NSCs的分化，发现低浓度的LPA增加MAF2阳性和ChAT阳性神经元的比例，0．1μmol／L LPA引起的增加达到峰值；（3）Western blot分析显示LPA促进了MAP2和ChAT的表达；（4）在诱导NSCs出现分化早期，用倒置显微镜观察到低浓度的LPA明显促进细胞突起的生长和细胞的迁移。以上结果表明，低浓度LPA在一定范围内可以促进NSCs的增殖、并分化为一般的MAP2阳性神经元和特殊的胆碱能神经元，而且LPA可以促进在分化早期出现的神经元或神经胶质细胞前体细胞的迁移和突起生长。

速灭威对N2a成神经元细胞、C6胶质细胞及小鼠胚胎神经干细胞增殖的影响

目的研究速灭威对N2a成神经元细胞、C6胶质细胞和小鼠胚胎神经干细胞增殖的影响。方法用四噻氮唑盐比色法观察速灭威在不同时点(12、24、36h)对C6、N2a及小鼠胚胎神经干细胞增殖的影响。结果速灭威对C6胶质细胞、N2a成神经细胞和小鼠胚胎神经干细胞增殖均有明显抑制作用,且呈现剂量和时间依赖性;5mg/L的速灭威作用24h就可明显抑制小鼠胚胎神经干细胞增殖。3种细胞对速灭威的增殖抑制作用敏感性依次为mNSCs>C6>N2a。结论速灭威可以抑制C6胶质细胞、N2a成神经细胞和小鼠胚胎神经干细胞增殖,且小鼠胚胎神经干细胞对速灭威敏感性最强。

异丙酚对大鼠胚胎神经干细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨异丙酚对体外培养大鼠胚胎神经干细胞增殖及凋亡的影响。方法:分离培养胚胎神经干细胞并用Nestin鉴定,采用Brdu、MTT法观察异丙酚对胚胎神经干细胞增殖的影响,流式细胞术检测异丙酚对胚胎神经干细胞凋亡的影响。结果:分离培养的神经干细胞95%以上呈Nestin阳性,不同浓度异丙酚组Brdu阳性细胞百分数差异无显著性(P=0.766),MTT显示异丙酚剂量增加生存率逐渐降低,异丙酚剂量增加细胞凋亡百分数增多。结论:临床相关剂量异丙酚对体外培养大鼠神经干细胞增殖没有影响,但能引起细胞凋亡。

胚胎神经干细胞在出血性脑卒中大鼠脑内移植的实验研究

目的研究胚胎神经干细胞出血性脑卒中大鼠脑内移植对神经功能缺损改善作用。方法30只SD大鼠随机分配到单纯脑出血组(A,10只)、培养液移植组(B,10只)及NSCs移植组(C,10只)。制作脑出血模型后3d,C组将神经干细胞经Hoechst标记后移植到病灶区,B组注射等量培养液。通过移植前后神经功能评分检测神经功能缺损修复情况,以及冰冻切片后组织免疫荧光检测移植神经干细胞的分化情况。结果实验中分离、培养的神经干细胞经标记移植入大鼠脑内后,经免疫荧光检测证实能够在血肿腔周边分化成神经元和星形胶质细胞。移植术后2周内3组间大鼠神经功能改善无明显差异。但从移植术后第21天到第28天,神经干细胞移植组大鼠的神经功能改善显著好于培养液移植组和单纯脑出血组P<0.001,有统计学意义。结论神经干细胞移植入脑出血大鼠脑内后能够存活并分化为神经元及星形胶质细胞,促进改善大鼠的神经功能,是一种很有发展前途的治疗方法,值得进一步深入研究。

氯化甲基汞激发程序性细胞死亡与胚胎神经系统发育的关系探讨

用ＴｄＴ介导脱氧核苷酸切口末端标记（ＴＵＮＥＬ）、尼罗兰活体染色、扫描和透射电镜及体内致畸试验等方法研究了氯化甲基汞（一次性腹腔注射剂量范围是０～３．２ｍｇ／ｋｇ）能否使神经胚形成期大鼠胚胎发生细胞凋亡亦称程序性细胞死亡（ＰＣＤ）及其ＰＣＤ对胚胎神经系统发育的影响。实验结果表明：随着甲基汞剂量的不断增高，胚胎脑组织ＰＣＤ检测阳性率亦显著增加，呈明显的剂量－反应关系；电镜下发现胚胎脑上皮细胞表面微绒毛数量减少和变短，细胞膜上出现大小不一的空洞样变，细胞器正常形态亦发生病理性改变，例如出现凋亡小体；甲基汞诱发脑发育异常的主要表现是神经管未闭。研究结果提示ＰＣＤ是甲基汞导致胚胎脑部畸形发生的重要机理之一。

胚胎神经细胞的培养方法及应用

体外胚胎神经细胞培养与在体神经细胞在神经发育生物学的研究中相辅相承,不断推动神经科学的发展。神经细胞原代培养涉及神经细胞的分离纯化、培养基的成分及观测方法等。本文对国内外近年来胚胎神经细胞的培养方法及应用进行了简单的综述。

同种异体胚胎神经干细胞移植修复脊髓损伤的时效性观察

目的:观察同种异体胚胎神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠双后肢运动功能的修复作用,并分析其移植时效性。方法:实验于2003-07/08在大连医科大学分子生物学实验室和大连理工大学环境与生命学院生物医学实验室完成。①取孕14￣16d的大白鼠1只,引颈处死,剖腹,取出胎鼠,钳取大脑皮质及皮质下脑室旁的脑组织,体外培养大鼠胚胎神经干细胞。②将30只成年SD大鼠按随机数字表法分为3组,即损伤对照组、早期移植组和延期移植组,每组10只。3组大鼠均制作脊髓横断损伤模型,造成大鼠下肢瘫痪,早期移植组、延期移植组大鼠分别在伤后3d及3周移植胎鼠脑组织神经干细胞。观察移植后大鼠双后肢的运动功能恢复情况,通过胶质原纤维酸性蛋白及神经元特异性烯醇化酶免疫组化染色法观察各组大鼠的脊髓组织形态学变化,胶质原纤维酸性蛋白是星形胶质细胞特异性标志蛋白,神经元特异性烯醇化酶是神经元特异性蛋白。结果:脊髓损伤建模实验纳入大鼠30只,全部进入结果分析,无脱失。①各组大鼠神经干细胞移植后双后肢的功能恢复情况:早期移植组和延期移植组大鼠双后肢的运动功能均有明显改善,但早期移植组表现尤为显著。早期移植组和延期移植组细胞移植后五六天即可见瘫痪大鼠的后肢肌力开始恢复,二三周后可出现爬行,4周后后肢活动活跃;损伤对照组大鼠的瘫痪肢体无任何恢复。②移植4周后早期移植组大鼠移植区脊髓组织的形态学变化:脊髓移植区肉眼可见有增生的组织充填,镜下有大量新生的细胞,表现为神经元和神经胶质细胞阳性染色(胶质原纤维酸性蛋白(+),神经元特异性烯醇化酶(+))。结论:神经干细胞移植对脊髓横断大鼠运动功能恢复有促进作用,早期移植疗效更好。

人胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的探索人胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点。方法采用机械方法从流产的10～18周胎龄的人胚胎前脑分离神经干细胞,用无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激细胞增殖,进行体外扩增、传代培养。传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEMF12培养液贴壁诱导分化培养。采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结果从人胚胎前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养。神经细胞球用特异性的鼠抗人巢蛋白(nestin)抗体鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞。结论从人胚胎前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增。

氮化硅/氧化钇/氧化镁复合陶瓷对大鼠胚胎神经细胞增殖分化的影响

目的研究氮化硅/氧化钇/氧化镁复合陶瓷粉末浸提液对体外培养大鼠胚胎神经细胞毒性的影响。方法利用大鼠胚胎神经细胞进行原代培养,将不同浓度氮化硅/氧化钇/氧化镁复合陶瓷材料粉末浸提液(50、100、200、400μg/mL)分别设置为复合陶瓷实验组1、2、3、4,另设正常对照组、阳性对照组(醋酸铅浓度50μg/mL)。采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学法对神经细胞进行鉴定,并利用图像分析细胞形态的变化。通过四唑盐比色试验(MTT)测定大鼠胚胎神经细胞相对增殖率(RGR)、考马斯亮蓝G-250测定蛋白质相对含量。结果50~400μg/mL氮化硅/氧化钇/氧化镁复合陶瓷浸提液能促进体外培养中脑神经细胞突起生长,集落数增多。阳性染色分布于神经元的胞质及突起中颗粒状。与正常对照组比较,各实验组神经细胞集落数生长分化明显升高、第7天神经细胞相对蛋白质含量明显升高(P<0.01);而阳性对照组(醋酸铅)较各实验组神经细胞集落数生长分化明显抑制、蛋白质含量明显降低(P<0.01)。4个实验组RGR分别为82.3%、90.8%、92.8%、83.6%。细胞毒性为1级,阳性对照组(醋酸铅)细胞RGR为46.9%,细胞毒性为4级。结论氮化硅/氧化钇/氧化镁复合陶瓷粉末浸提液浓度50~400μg/mL为适宜。氮化硅/氧化钇/氧化镁复合陶瓷对体外培养胚胎中脑神经细胞分化、增殖具有一定的促进作用,具有双重性影响0x0E0xFF0xF00xFF倎0x030x0F其生物学作用性质与剂量有关,该材料具有较好的生物相溶性,生物效应是无毒。

胚胎神经组织移植的伦理学探讨

神经组织移植中的供体胎儿组织能分化为多种细胞类型,能生长和增殖,能产生生长因子,且具有抗原性低等特性,移植前景乐观,但也有伦理学问题,必须制订相应的道德水准和法律。

丙泊酚对鼠胚胎神经干细胞凋亡的影响及作用机制

目的：探讨丙泊酚对鼠胚胎神经干细胞凋亡的影响及作用机制。方法：选择孕14～16 d Wistar大鼠，分离培养胚胎神经干细胞，分别用5、25、50、100μmol／L丙泊酚进行处理，同时设立脂肪乳剂组和空白对照组。采用MTT法检测细胞存活率；流式细胞术观察丙泊酚对胚胎神经干细胞凋亡的影响；提取对照组、脂肪乳剂组、50μmol／L丙泊酚、50μmol／L丙泊酚＋caspase抑制剂培育12 h后的全细胞蛋白， Western-blot检测激活的细胞色素c、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白的表达。结果：丙泊酚可引起胚胎神经干细胞凋亡，其效应呈剂量依赖型（P＜0．05）；丙泊酚处理后的胚胎神经干细胞激活的 caspase-3、CytochromeC、caspase-9、caspase-8蛋白表达水平显著增加（P＜0．05）。结论：丙泊酚主要通过激活caspase依赖的内源性和外源性凋亡通路引起鼠胚胎神经干细胞凋亡。

大鼠胚胎神经干细胞的低温保存

目的建立大鼠胚胎神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的低温保存方法,探讨经冻存后NSCs的存活及生物学特性变化。方法使用二甲基亚砜(DMSO)做NSCs的冷冻保护剂于液氮中冻存。复苏后用间接免疫荧光染色方法对细胞的存活、形态及分化能力做鉴定。结果不同冻存时间及代数的NSCs复苏后存活率无明显差异(P>0.05),且仍能在体外多次传代,并可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论大鼠NSCs低温冻存、复苏并不影响其原有的形态、增殖及多向分化等生物学特性。

JNK通路促进乳化异氟烷引起的大鼠胚胎神经干细胞的增殖抑制

目的探讨乳化异氟烷(EI)对原代培养的SD大鼠胚胎神经干细胞增殖的影响以及JNK通路在此影响中的作用。方法建立体外培养胚胎神经干细胞接受EI处理的模型,分为6组(n=8):正常组(N组)、脂肪乳组(F组)、EI处理组(8.12、9.80、12.04 mmol/L EI)、9.80 mmol/L EI组+20μmol/L SP600125组(EISP组)。细胞处理12 h后,采用噻唑蓝(MTT)法分别检测6组胚胎神经干细胞的细胞活力;流式细胞术检测细胞的凋亡率;Western blot法定量检测Caspase-3蛋白表达。实验重复3次。结果与N组比较,F组各项指标无显著差异,EI组细胞增殖的抑制率明显升高(P<0.01),EI组细胞的凋亡率明显升高(P<0.01),EI组明显上调Caspase-3的表达量(P<0.05);EI组内3个浓度之间比较,细胞增殖的抑制率(P<0.01)、细胞的凋亡率以及Caspase-3的表达量差异均有统计学意义(P<0.05);与EI组比较,EISP组细胞增殖的抑制率明显下降(P<0.05),EISP组细胞的凋亡率明显降低(P<0.01),EISP组明显下调Caspase-3的表达量(P<0.05)。结论 EI引起的SD大鼠胚胎神经干细胞的增殖抑制具有一定的浓度依耐性,并且与JNK通路相关。