胚胎组织提取液影响表皮干细胞表型变化的初步研究

目的:模拟表皮干细胞周围生态微环境,研究表皮干细胞在此环境中的表型变化,表皮干细胞微环境在表皮干细胞"命运"决定过程中的作用。方法:分离、培养表皮干细胞,观察其形态,并进行免疫组织化学鉴定及免疫荧光检测。制备小鼠胚胎组织匀浆液,荧光活细胞示踪法和逆转录聚合酶链式反应检测胚胎组织提取液对表皮干细胞表型变化的影响。结果:原代分离培养的表皮基底层干细胞表达α6、β1整合素、K19、K14、p63、Nes-tin、PCNA为阳性,而K10不表达。激光共聚焦检测显示α6整合素和CD71在表皮干细胞中的分布存在着区域性差异。此外,流式细胞检测显示胚胎组织提取液作用后α6+CD71-表达细胞由细胞总数的22.49%减少至10.92%,而α6+CD71+、α6-CD71+表达细胞则分别由诱导前的62.29%及0.19%增加至诱导后的68.34%及4.51%。RT-PCR结果表明胚胎组织提取液作用后,表皮干细胞中β1整合素、K19、K10表达增强,而K14表达减弱。结论:Ⅳ型胶原黏附法分离的表皮干细胞具有干细胞的特点。α6整合素、CD71在表皮干细胞中分布的区域差异及CD71表达位点的空间变化可以作为区分表皮干细胞及其子代细胞标志之一。胚胎组织提取液对表皮干细胞的增殖分化具有促进作用。胚胎组织提取液中的某些因子可能抑制了K14表达的TA细胞的终末分化,甚至诱导其发生逆向分化,导致诱导后K14的总体表达水平下调。

胚脑组织提取液神经营养活性成分的分析

目的通过对胚脑组织的分离纯化,分析不同组份中的神经营养物质对神经细胞的营养作用。方法:采用超滤器超滤,透析袋透析以及Sephadex S-200凝胶层析方法将胚胎脑组织提取液分离纯化。得到9种不同分子量组分的脑活性因子(BCF),分别加入原代培养的新生SD大鼠大脑皮层神经细胞悬液中,培养24 h和15 d后以MTT微量快速自动比色法检测细胞活性。结果发现培养24 h后,有5种组分具有促进培养的大脑皮层神经元的存活的作用,与对照组相比有显著性差异(P<0.05);培养15 d后,有4种组分具有促进培养的大脑皮层神经元的存活的作用,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。结论胚脑组织提取液可促进培养的大脑皮层神经元的成活、成熟和分化。不同的组分蛋白对神经元的作用不一样。

共培养环境中大鼠胚胎中脑细胞诱导人脐带间充质干细胞分化

目的:检测人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)在与大鼠胚胎中脑细胞共培养环境中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和多巴胺转运蛋白(dopamine transporter,DAT)表达的变化。方法:(1)植块法分离培养hUCMSCs,以细胞免疫化学法鉴定其表面特异性标记物的表达;(2)无菌条件下分离E15大鼠胚胎中脑组织,制成单细胞悬液及中脑组织提取液;(3)用大鼠胚胎中脑组织提取液做培养液,将5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)标记的hUCMSCs与大鼠胚胎中脑细胞共培养14 d,细胞免疫化学法检测hUCMSCs中TH和DAT的表达。结果:HUCMSCs高表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,极低表达CD31和CD45。在与大鼠胚胎中脑细胞共培养14 d后,hUCMSCs中TH阳性表达率为(18.06±2.29)%,DAT阳性表达率为(11.14±2.10)%。结论:用植块法可成功分离并体外培养hUCMSCs,其免疫表型符合间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的特征。在以大鼠胚胎中脑组织提取液作为培养液,并与大鼠胚胎中脑细胞共培养的诱导条件下,hUCMSCs可部分向多巴胺能神经元分化。