大鼠胚胎中脑神经细胞微团试验检测化学物的致畸作用

大鼠胚胎中脑神经细胞微团试验检测化学物的致畸作用席小平，李建国，郭琳，贾继峰（山西省卫生防疫站毒理科太原０３００１２）大鼠胚胎中脑神经细胞微团试验（简称微团法），国内开展单位尚不多。我们在本实验室建立了该法，并用已知的致畸物维生素Ａ、乙酰水杨酸进行了...

大鼠心肌条件培养基对ICR小鼠胚胎干细胞分离克隆的影响

采用大鼠心肌条件培养基(RH CM)培养ICR小鼠的桑椹胚和囊胚,发现由囊胚分离的ES细胞传代后ES集落的出现率显著高于桑椹胚(P<0.05),囊胚更适合作为ES细胞分离克隆的材料。以RH CM为培养基的试验组ES细胞传代的平均时间间隔为38 h,对照组传代的时间间隔平均为78 h,两者差异显著(P<0.05)。表明RH CM能够促进ES细胞贴壁增殖和ES集落的形成,有效地维持ES细胞未分化状态。试验中设计的3 种培养条件对原代ES集落的形成影响不显著,但对传代后的ES集落的形成和传代的代次有显著差异。其中以MEF作饲养层,添加RH CM培养基的效果最好。

人精子活力试验敏感性及组织培养管细胞毒性的研究

目的:观察不同浓度福尔马林培养环境中人精子活力的变化,评价人精子活力测试的敏感性;并且利用人精子活力测试检测3种组织培养管的细胞毒性,了解牛血清白蛋白和矿物油对精子的作用,从而探讨人精子活力测试在IVFET实验室质量控制中的应用价值。方法:选择符合纳入标准的精液进行常规精液分析,精液处理后分别按实验组和对照组进行培养。实验第一部分:实验组HTF培养液中分别加入0.25%、0.75%的福尔马林溶液,对照组为单纯的HTF培养液,实验组和对照组的培养管、培养皿均部分加入0.3%牛血清白蛋白或矿物油,分别培养24、48h,在光学显微镜或倒置显微镜下计数有活力的精子数,与初始精子比较,计算平均精子活力指数;实验第二部分:将IVF实验室常用的15mlCorning、14mlFalcon和7mlNunclon组织培养管均分为实验组和对照组,实验组的HTF培养液中加入0.3%牛血清白蛋白或矿物油,对照组为单纯的HTF培养液,分别培养24、48h,计数平均精子活力指数。结果:实验第一部分:培养至24h,含0.25%、0.75%福尔马林培养液中平均精子活力指数分别为0.594±0.331、0.450±0.284,差异有统计学意义(P<0.001);培养至48h,0.25%、0.75%福尔马林培养液中平均精子活力指数分别为0.376±0.251、0.237±0.175,差异有统计学意义(P<0.001);含0.3%牛血清白蛋白、无0.3%牛血清白蛋白的培养液中平均精子活力指数分别为0.608±0.334、0.394±0.331,差异有统计学意义(P<0.001);含矿物油、无矿物油培养液平均精子活力指数分别为0.527±0.345、0.424±0.311,差异有统计学意义(P<0.001);培养皿、培养管中的平均精子活力指数分别为0.545±0.340、0.457±0.334,差异有统计学意义(P<0.001);实验第二部分:经24h和48h的培养,7mlNunclon、15mlCorning、14mlFalcon组织培养管中平均精子活力指数分别为0.677±0.335、0.551±0.317、0.596±0.327,经两两比较,7mlNunclon组织培养管与15mlCorning组织培养管和14mlFalcon组织培养管之间差异有统计学意义(P<0.001),15mlCorning组织培养管和14mlFalcon组织培养管之间差异无统计学意义(P>0.05);含0.3%牛血清白蛋白、无0.3%牛血清白蛋白的培养液中平均精子活力指数分别为0.821±0.259、0.395±0.245,差异有统计学意义(P<0.001);含矿物油、无矿物油的培养液中平均精子活力指数分别为0.645±0.335、0.571±0.321,差异有统计学意义(P<0.001);培养24、48h平均精子活力指数分别为0.676±0.340、0.540±0.305,差异有统计学意义(P<0.001)。结论:人精子活力试验对低毒性环境十分敏感,人精子在含0.25%福尔马林的培养液中培养24h其活力明显降低,随培养时间的延长,人精子活力降低越明显;同一型号的培养皿与培养管相比,培养皿对人精子活力的影响小于培养管;有毒性物质存在的环境中加入0.3%牛血清白蛋白和矿物油可减少对人精子的损害,同时也说明在无保护成分的条件下人精子活力测试敏感性增加;3种组织培养管中,7mlNunclon组织培养管对人精子活力影响最小,适用于胚胎培养;同一类型的组织培养管中加入0.3%牛血清白蛋白和矿物油的平均精子活力指数高于未加保护成分的对照组,显示出0.3%牛血清白蛋白和矿物油有利于人精子的培养,提示我们在胚胎培养的过程中,应选择对人精子影响小的培养器皿,同时加入合适的牛血清白蛋白和矿物油更有利于胚胎的培养。本研究结果表明,人精子活力试验是一种经济、快捷、敏感、有效的实验室质量控制方法,可作为IVFET实验室质量控制的常用模式,通过人精子活力的变化可间接反映出培养过程中胚胎受损害的程度,从而能减少在培养过程中影响胚胎质量的因素,选择最适合胚胎培养环境,为提高IVFET的受孕率奠定基础。

胚胎毒性体外试验的研究进展

胚胎毒性体外试验已广泛应用于胚胎生殖发育毒物筛选和致畸机制研究等方面,现已有三十余种不同类型的毒性测试方法。欧洲替代方法研究中心推荐的有效性较高的3个胚胎毒性体外筛选试验,即体外全胚胎培养试验、胚胎细胞微团培养试验和胚胎干细胞试验具有良好的应用价值,就以上试验的研究方法、应用价值及研究进展综述。

五氧化二钒对大鼠胚胎中脑细胞增殖和分化的影响

本研究采用微团培养观察了Ｖ２Ｏ５对大鼠胚胎中脑细胞增殖和分化的影响，旨在为进一步揭示其发育毒作用机理提供依据。结果显示，Ｖ２Ｏ５对体外中脑细胞的增殖和分化均有抑制作用，并有明显的剂量－反应关系。Ｖ２Ｏ５抑制中脑增殖和分化的ＩＣ５０分别为９１和６８μｍｏｌ／ｌ。体内／体外结合试验显示，Ｖ２Ｏ５在２０ｍｇ／ｋｇ时对细胞分化有明显的抑制作用，而在５０ｍｇ／ｋｇ时才对细胞增殖出现抑制作用，按照Ｒｅｎａｕｌｔ的分类标准。

苯对小鼠胚胎肢芽和中脑细胞分化与增殖的影响

目的探讨苯对胚胎肢芽、中脑细胞分化和增殖的影响及对肢芽器官发育的影响。方法分离12d龄小鼠胚胎肢芽和中脑细胞进行微团培养,观察肢芽和中脑细胞的分化与增殖;结果随着苯染毒浓度的增加,胚胎肢芽细胞分化为软骨细胞的集落数逐渐减少,中脑细胞形成神经集落数减少、体积小,集落细胞间突起数量减少,肢芽细胞和中脑细胞增殖率下降,均具有较明显的剂量-效应关系;苯对肢芽细胞的半数分化抑制浓度(dID50)和半数增殖抑制浓度(pID50)分别为89.93μmol/L和396.77μmol/L,对中脑细胞的dID50和pID50分别为116.29μmol/L和831.46μmol/L,对细胞分化的抑制作用大于对增殖的抑制作用。结论苯对胚胎中脑及肢芽细胞的分化和增殖有特异性抑制作用,可能对胚胎骨和脑具有发育毒性。

正交设计在诱导植物体细胞胚胎发生中的应用

利用正交试验方法研究了培养基中主要成分，ＮＨ，ＮＯ，Ｃａ￣（２＋），Ｍｇ￣（２＋）对党参体细胞胚胎发生的影响。发现３０ｍｍｏｌ／ＬＮＨ＋３０ｍｍｏｌ／ＬＮＯ组合最有利于体细胞胚胎发生，其它依次为３０ｍｍｏｌ／ＬＮＨ、３０ｍｍｏｌ／ＬＮＯ、３０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ与０．５ｍｍｏｌ／ＬＣａ￣（２＋）、３０ｍｍｏｌ／ＬＮＯ与７．０ｍｍｏｌ／ＬＣａ￣（２＋）、３．０ｍｍｏｌ／ＬＣａ￣（２＋）、１．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇ￣（２＋）。通过分析得出优选培养基成分为３０ｍｍｏｌ／ＬＮＨ、３０ｍｍｏｌ／ＬＮＯ、１．０ｍｍｏｌ／ＬＣａ￣（２＋）和１．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇ￣（２＋），其它成分均同ＭＳ培养基成分。用此培养基，党参体细胞胚胎发生比ＭＳ培养基提高２．５倍。

奶山羊转基因供核细胞的再饥饿对核移植胚胎发育的影响

为提高转基因奶山羊体细胞核移植胚胎早期发育率,将经转染外源基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿培养(含0.5%FCS的DMEM)5天后分成两部分:第一部分细胞-80℃或液氮冻存,试验前复苏后直接用作供核细胞(试验组Ⅰ),或复苏后恢复培养(含10% FCS的DMEM)2-5天后再饥饿5天用作供核细胞(试验组Ⅱ);第二部分细胞作传代培养(含10% FCS的DMEM)2天后再饥饿5 天用作供核细胞(试验组Ⅲ)。将上述不同处理的供核细胞进行细胞周期与存活率的检测,并将该供核细胞移入去除遗传物质的山羊MⅡ期卵母细胞的卵周隙内,经电融合、化学激活后,将核移植(NT)胚胎经0.8%琼脂糖包理后移入临时寄母输卵管内,培养6天后回收并观察NT胚胎的早期发育。结果,试验组Ⅱ所用供核细胞中G_0/G_1期细胞所占比例及其存活率分别为95.68%、99.9%,均显著地高于试验组Ⅰ(88.66%、80%);试验组Ⅱ的桑椹及囊胚期NT胚胎的发育率(66.09%)显著地高于试验组Ⅰ(22.00%)与试验组Ⅲ(50.51%)。将以上发育的NT胚胎分别移入同步发情的受体后,35 天作B超妊娠诊断,试验组Ⅱ的受体妊娠率为45.83%,显著地高于试验组Ⅰ(20.00%)与试验组Ⅲ(9.58%)。流式细胞仪分析结果表明,饥饿后的供核细胞经冷冻,复苏后恢复培养2-5天,再经饥饿处理,能显著地提高G_0/G_1期细胞的比例及细胞存活率;应用该细胞所组建的NT胚不仅具有较高的桑椹与囊胚期发育率,而且具有较高的受体妊娠率。

酒精代谢产物乙醛对大鼠胚胎中脑细胞增殖分化的影响研究

目的 :为探讨酒精代谢产物乙醛对胚胎发育的作用 ,采用胚胎中脑细胞微团培养研究乙醛对其增殖和分化的影响。方法 :从 13天龄体节数 35 36的鼠胚胎中分离中脑细胞 ,施与不同剂量的乙醛于体外连续培养 5天后 ,测定乙醛对增殖和分化的影响 ,细胞的分化抑制表示有潜在致畸性。结果 :乙醛对中脑细胞增殖和分化的结果 ,显示 0 .1mM及以上剂量即能明显的抑制细胞的增殖分化过程 ,显示出乙醛能阻止神经形成和集落形成 ,其分化抑制剂量 (ID5 0 )和增殖抑制剂量 (IP5 0 )分别为 9.97mM和 6.69mM。结论 :根据的标准乙醛是一种非特异性的细胞增殖分化抑制剂 ,具有潜在的致畸性。

神经生长因子对胚胎神经细胞分化的影响

利用大鼠胚胎中脑细胞作原代微团培养，研究了不同浓度的神经生长因子（ＮＧＦ２．５ｓ）对中脑细胞分化的影响。结果表明：微团中的集落形成率明显增加，并且显示了剂量一效应关系。我们认为神经生长因子（ＮＧＦ２．５ｓ）能促进中脑细胞的生长。

应用微团培养和胚胎干细胞试验模型评价二硝酰胺铵的发育毒性

目的利用微团培养和胚胎干细胞试验评价二硝酰胺铵(ADN)潜在的胚胎发育毒性,并评估其是否为致畸物。方法于2018年9月,分离大鼠胚胎并收集肢芽细胞,使用不同浓度(0、312.50、625.00、1250.00、2500.00、5000.00、10000.00μg/ml)ADN进行染毒,计算细胞半数增殖抑制浓度和半数分化抑制浓度并评价ADN致畸作用。在胚胎干细胞试验中,检测不同浓度(0、39.06、78.13、156.25、312.50、625.00、1250.00、2500.00μg/ml)ADN对小鼠胚胎干细胞(mESCs)向心肌细胞分化的抑制作用,以及对mESCs和3T3细胞的细胞毒性,并评价其胚胎毒性。以已知的强胚胎毒性药物5-氟尿嘧啶和非胚胎毒性药物青霉素-G为试验材料,对模型的有效性进行验证,并采用验证性试验模型评价ADN的胚胎毒性。结果微团培养试验中,各个浓度ADN组大鼠胚胎肢芽细胞增殖抑制率和分化抑制率均高于对照组(P<0.05);ADN对肢芽细胞的半数增殖抑制浓度和半数分化抑制浓度分别为7480.32和4526.09μg/ml,判定ADN为非致畸物。胚胎干细胞试验中,各个浓度ADN组mESCs增殖抑制率高于对照组,156.25、312.50、625.00、1250.00、2500.00μg/ml ADN组3T3细胞增殖抑制率高于对照组(P<0.05)。ADN对mESCs的半数增殖抑制浓度和半数分化抑制浓度分别为1851.73、1796.39μg/ml,对3T3细胞的半数增殖抑制浓度为3334.35μg/ml,判定ADN为无胚胎毒性。结论经微团培养和胚胎干细胞试验模型评价,ADN无胚胎毒性,属于非致畸物。

胎盘来源间充质干细胞的体外诱导成软骨分化

背景:胎盘间充质干细胞已被证实有较强的增殖能力,且能向成骨细胞、成神经细胞、类肝样细胞等诱导分化,但对其成软骨细胞诱导分化的研究不多。目的:在体外诱导人胎盘间充质干细胞成软骨细胞分化。方法:体外培养人胎盘间充质干细胞并鉴定。取第3代胎盘间充质干细胞,调整细胞悬液浓度为1.6×1010 L-1,在24孔板中央分别滴5,10,15μL细胞悬液,培养2 h(目的是形成微团);然后加入间充质干细胞培养基或软骨诱导培养基培养14 d,阿利新蓝染色,进行大体观察及倒置显微镜观察。结果与结论:应用间充质干细胞培养基培养的对照组,细胞增殖形成大量贴壁细胞,贴壁细胞具有典型的间充质细胞形态;应用软骨诱导培养基培养后,细胞只保持微团,不继续增殖形成贴壁细胞,微团基部无贴壁细胞,随着接种细胞数量的增加,微团直径增大。说明人胎盘来源间充质干细胞具有向软骨细胞分化的能力,可作为组织工程、细胞治疗等应用的种子细胞来源。

EGF和GSH对牛卵母细胞体外受精的影响

研究了牛卵泡卵母细胞体外受精时向成熟液中加入EGF(表皮生长因子),受精液中加入GSH(谷胱甘肽)对受精率和囊胚率的影响。成熟液以M-199为基础液并加入一定浓度的促性腺激素和OCS,作为成熟液的对照组,试验组加入不同浓度的EGF。受精液以改良TALP为基础液并加入一定浓度的BSA、肝素和咖啡因,作为受精液的对照组,试验组加入不同浓度的GSH。早期胚胎培养液为SOFaa。在成熟液中加入10ng/mlEGF和50ng/mlEGF组时,试验组与对照组的受精率分别为76.00%(114/150)、76.71%(112/146)和60.70%(85/140);囊胚率分别为23.68%(27/114)、24.11%(27/112)和17.64%(15/85);在受精液中加入1mMGSH和10mMGSH组时,试验组与对照组的受精率分别为71.66%(86/120)、63.28%(81/128)和76.00%(114/150);囊胚率分别为34.88%(30/86)、24.69%(20/81)和23.68%(27/114)。结果表明,成熟液中加入EGF对牛卵母细胞的体外成熟和受精后的早期胚胎的发育都有促进作用,在一定范围内增加EGF浓度,不会提高受精率和囊胚率;受精液中加入一定浓度GSH能够提高受精率和囊胚率,但是在高浓度的GSH时则影响受精率。

铅对胎鼠中脑细胞增殖和分化的影响

目的：研究铅对胎脑神经细胞增殖和分化的影响，为进一步揭示其脑发育毒性作用机理提供依据。方法：应用大鼠胚胎中脑细胞微团培养法，观察不同浓度的醋酸铅对胚胎脑细胞增殖和分化的影响。结果：醋酸铅对体外培养的中脑细胞的增殖和分化均有抑制作用，并均有明显的浓度－ 效应关系。醋酸铅的神经细胞半数增殖抑制浓度（ Ｉ Ｃｐ５０） 为３ ．６９μｍｏｌ／ Ｌ，半数分化抑制浓度（ Ｉ Ｃｄ５０） 为１ ．０３μｍｏｌ／ Ｌ。结论：按 Ｆｌｉｎｔ 评价标准，醋酸铅是脑细胞分化的特异抑制剂，它的脑细胞发育毒性与抑制细胞的增殖和分化有关。

动物胚胎生物技术的研究进展与应用前景

胚胎生物技术是在胚胎移植技术的基础上，以胚胎为研究对象，经过20多年的试验研究而迅速发展和成熟起来的技术，主要包括：超数排卵、卵母细胞体外培养成熟、体外受精、胚胎移植、胚胎冷冻保存、胚胎性别鉴定和性别控制、胚胎克隆、体细胞克隆和基因转移等一系列有关胚胎的生产、操作和改造的技术。

干细胞研究和临床转化的全球性标准——国际干细胞研究会《干细胞研究和临床转化准则》

2016年国际干细胞研究会发布了新的《干细胞研究和临床转化准则》,对我国修订和更新相关法规具有重要意义。来自各国的23位科学家、医学家、生命伦理学家联合发表文章对这一准则进行了评论。译者将其重要内容和论点加以整理以飨读者。

细胞治疗产品非临床致瘤性和成瘤性评价概况

细胞治疗产品(cell therapy products,CTPs)是指用于治疗人类疾病,来源、操作和临床试验过程符合伦理要求,按照药品管理相关法规进行研发和注册申报的人体来源的活细胞产品[1];是从实验室培养的干细胞、组织和器官中提取的,被注射到患者体内的生物技术产品[2]。CTPs主要包括干细胞和体细胞两类,其中干细胞分为胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)等,是目前正在研究的用于制备细胞治疗产品的主要细胞类型[3]。

我国促使反刍家畜“早生多生”生物技术试验成功

记者从河北省科技部门获悉．从一头只有1至2个月大小的奶牛母犊的腹腔里．取出几十枚卵母细胞．一再通过体外培养、体外受精和胚胎移植等后续工作，很快就能培育出下一代。这种反刍家畜“早生多生”生物技术．目前由中国农业大学和河北省沧州华风国营良种繁育有限公司等合作试验成功。