lncRNA1926和lncRNA3223在肉鸡胚胎肝细胞脂肪代谢中的功能研究

RNA-Seq分析发现LOC107051926(命名为lncRNA1926)和LOC112533223(命名为lncRNA3223)在肉鸡胚胎肝脏组织脂肪代谢过程发挥重要作用,但其具体功能尚不清楚。采用油红O染色、GPO-PAP和RT-qPCR方法对lncRNA1926和lncRNA3223作功能研究。结果表明,敲低lncRNA1926或lncRNA3223后,显著降低胚胎原代肝细胞中脂滴沉积和甘油三酯含量;lncRNA1926是脂肪酸合成(ACC、FAS)、甘油三酯合成(GPAT)、脂肪酸降解(CPT1)相关基因正调控因子;lncRNA3223是脂肪酸合成(ACC、FAS)、甘油三酯合成(GPAT、DGAT和MOGAT2)相关基因正调控因子。敲低lncRNA1926或lncRNA3233,通过抑制脂肪酸合成和甘油三酯合成相关基因表达降低甘油三酯含量,从而降低胚胎原代肝细胞中脂滴沉积。研究结果有助于增进对鸡肝脏脂肪代谢分子调控的理解,为肉鸡体脂性状遗传改良提供理论依据。

壳寡糖减弱乙醇对人胚胎肝细胞损伤的研究

目的研究壳寡糖减弱乙醇对人胚胎肝细胞(L02细胞)损伤的原因。方法采用MTT法检测壳寡糖减弱乙醇对L02细胞的损伤;结合RT-PCR和Western blot方法分析壳寡糖的保护作用。结果壳寡糖能明显降低乙醇对L02细胞的损伤(P<0.01),尤其是0.2 mg/mL的壳寡糖,而这种作用是通过降低p53基因和蛋白的表达来实现的。结论壳寡糖有保护L02细胞抵制乙醇损伤的作用。

人胚胎肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭的效果分析

目的探讨人胚胎肝细胞移植治疗急性肝衰竭(ALF)的疗效及能否成为移植细胞源。方法采用四甲基偶氮唑盐法检测人胚胎肝细胞增殖情况;免疫细胞化学检测其ALB、细胞角蛋白-18(CK-18)的表达;D-氨基半乳糖(D-gal)药物诱导ALF的实验动物模型;人胚胎肝细胞移植治疗ALF的动物模型,包括移植组与对照组在肝功能指标[ALT、AST、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)]的差异性比较。免疫组织化学法检测植入脾脏中的人胚胎肝细胞ALB及CK-18的表达。结果培养第5天左右细胞数量达到最高峰,每天完成4～5次分裂,胚胎肝细胞的生长曲线呈抛物线型。免疫细胞化学检测提示其具有表达ALB、CK-18的功能;D-gal 1.6 g/kg腹腔注射72 h后大鼠ALF模型制备成功;移植第3～5天后,移植组与对照组比较,肝功能(ALT、AST、ALP、TBIL)指标差异有统计学意义(P<0.01)。植入脾内的肝细胞具有分泌并表达CK-18、ALB的功能。结论人胚胎肝细胞脾内移植能有效治疗ALF,并可能成为肝细胞移植的靶细胞源。

人胚胎肝细胞体外培养相关技术研究进展

肝脏是人体代谢、生物转化的重要器官。肝脏疾病临床、药物代谢以及药效药性评价等医药研究都需要一个肝脏的体外模型作为研究平台。目前国内外研究认为,人胚胎肝细胞是构建肝脏体外研究模型的较理想材料。随着肝脏临床及基础研究的日益深入,对胚胎肝细胞体外模型的数量和质量的要求将越来越高。主要对人胚胎肝细胞的分离、培养、鉴定及冻存技术的研究进展进行综述。

永生化胚胎肝细胞生物学特性及功能研究

研究永生化胚胎肝细胞的生物学特性及功能,研究并观察永生化胚胎肝细胞的形态及结构特征,测定其生长曲线,观察克隆形成能力并作软琼脂试验,对细胞染色体进行核型分析,同时对细胞合成白蛋白、尿素及细胞色素P450能力进行检测。结果显示永生化胚胎肝细胞克隆形成率为31.2%,染色体核型分析表明细胞核型无明显异常,软琼脂集落形成试验表明细胞在软琼脂中不能生长。细胞已在体外传56代仍保持正常肝细胞的形态特征,而且具有合成白蛋白、尿素及细胞色素P450的功能。说明该永生化胚胎肝细胞可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料。

镉对小鼠胚胎肝细胞BNL CL.2氧化损伤作用的研究

目的:观察镉对小鼠肝细胞氧化损伤作用,为研究镉的肝毒性作用机制提供基础。方法:首先,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测镉对小鼠肝细胞活力的影响,然后通过苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)和Hoechst 33342染色观察细胞病理变化情况,最后通过测定细胞超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量,评价镉诱导小鼠肝细胞氧化损伤情况。结果:与对照组相比,40μmol/LCdCl_(2)处理小鼠胚胎肝细胞(BNL CL.2)12 h后,可极显著的抑制其活力(P<0.01)。显微镜下观察发现,40μmol/L CdCl_(2)处理BNL CL.2细胞12 h后,大量细胞开始出现空泡变性、核皱缩等病理改变;与对照组相比,40μmol/LCdCl_(2)处理BNL CL.2细胞6 h后,SOD活力极显著降低(P<0.01),同时染镉细胞内MDA的含量极显著升高,表明染镉处理可造成BNL CL.2细胞氧化应激损伤。结论:CdCl_(2)可诱导BNL CL.2细胞发生氧化应激损伤进而导致细胞死亡。

原花青素B2及黄曲霉毒素B_1对人胚胎肝细胞细胞色素P450亚酶1A2、3A4活力及基因表达的影响

目的探讨原花青素B2(PC-B2)与黄曲霉毒素B_1(AFB_1)对人胚胎肝细胞L-02细胞色素P450(CYP)亚酶1A2、3A4活力及其基因表达的影响。方法 L-02细胞体外培养后分空白对照、溶剂对照、AFB_1染毒、PC-B2处理和PC-B2干预共5组,其中PC-B2处理分为3个亚组,分别采用3、10、30μg/ml PC-B2干预,PC-B2干预分为3各亚组,分别采用3、10、30μg/ml PC-B2预处理12 h后,再加不同浓度PC-B2与AFB_1干预24 h。测定各组细胞的CYP1A2、CYP3A4酶活力以及CYP1A2、CYP3A4基因的mRNA表达水平;测定细胞存活率,倒置荧光显微镜观察细胞形态。结果与空白对照组相比,AFB_1染毒组细胞存活率降低(P<0.05),胞膜结构不清,漂浮细胞增多,CYP1A2、CYP3A4酶活力及其mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。与空白对照组相比,3、10μg/ml PC-B2处理组细胞相关指标无明显变化,但30μg/ml PC-B2处理组的细胞存活率升高,CYP1A2、CYP3A4酶活力下降(P<0.05)。与AFB_1染毒比较,30μg/ml PC-B2干预组的细胞存活率升高(P<0.05),各浓度PC-B2干预组的细胞CYP1A2、CYP3A4酶活力及基因表达均降低(P<0.05),且干预浓度越高,CYP1A2、CYP3A4酶活力及基因表达越低(P<0.05)。结论 AFB_1能明显诱导肝细胞CYP1A2、CYP3A4酶活力及其mRNA表达,促使肝细胞凋亡,PC-B2干预可促进肝细胞生长并抑制上述CYP二个亚酶的活力及其基因表达,提示PC-B2可能通过抑制I相代谢酶CYP对AFB_1的活化而对肝细胞有良好保护作用。

胚胎肝细胞用于肝组织工程的体外培养研究

目的:观察三维受控组装系统下,胚胎肝细胞在三维立体结构的体外生长状态,探讨胚胎肝细胞在肝组织工程中应用的可行性。方法:用清华大学机械工程系研制的"三维受控组装系统",将第15 d小鼠胚胎肝细胞作为肝组织工程的种子细胞,与以明胶为主的复合材料混合,构建成复杂三维立体结构,观察其体外生长发育状态。对体外培养1周及4周的三维类肝组织标本进行苏木精-伊红(HE)染色,免疫组织化学方法检测甲胎蛋白(AFP)及白蛋白(ALB)的表达,并对体外培养4周的三维类肝组织用PAS显色法检测肝糖原表达。结果:HE染色结果显示体外培养的胚胎肝细胞在三维支架材料中,可形成含有类血管和肝组织样结构;体外培养1周的类肝组织AFP表达呈阳性,体外培养4周的三维类肝组织ALB表达呈阳性,PAS显色亦呈阳性。结论:在三维受控组装系统的构建下,呈立体状生长的胚胎肝细胞,可逐渐形成肝组织样结构,并显示一定的肝脏功能。

静电纺丝聚乳酸聚乙醇酸／聚乙二醇纳米材料与小鼠胚胎肝细胞生物相容性的研究

目的探讨小鼠胚胎肝细胞与静电纺丝聚乳酸聚乙醇酸（PLGA）-聚乙二醇（PEG）共聚物纳米材料的体外生物相容性。方法采用胰酶分步消化法分离培养孕16d昆明小鼠胚胎肝细胞并进行免疫荧光鉴定；使用静电纺丝法制备PLGA和PLGA—PEG纳米材料；取第5代胚胎肝细胞分别接种于PLGA和PLGA—PEG纳米纤维材料上，进行体外培养，细胞计数试剂盒（CCK-8）法测定两种材料的细胞毒性及细胞在材料表面的黏附、增殖；扫描电镜（SEM）观察材料结构、细胞复合材料的形态。结果体外分离培养的小鼠胚胎肝细胞呈单层多边形样生长，免疫荧光检测胚胎肝细胞角蛋白18（CK18）和甲胎蛋白（AFP）表达阳性；CCK-8检测显示PLGA（0．255±0．062、0．259±0．039、0．239±0．029、0．257±0．026）和PLGA—PEG（0．293±0．033、0．283±0．200、0．249±0．021、0．244±0．025）两种纳米材料与空白对照组（0．258±0．017）比较均无明显的细胞毒性（P〉0．05）。小鼠胚胎肝细胞在材料表面生长良好，PLGA—PEG组（0．113-4-0．005、0．234±0．008、0．678±0．006、1．108±0．004、1．182±0．004、1．114±0．011）及PLGA组（0．108±0．005、0．206±0．010、0．502±0．009、0．817±0．005、0．807±0．007、0．819±0．005）吸光度（A）值均随时间延长而增大。两组A值在各时间点差异均有统计学意义（P〈0．05）。各时间点两组材料的细胞黏附率差异有统计学意义，PLGA．PEG组（21．250±2．165、51．250±7．806、75．000±3．750）明显高于PLGA组（15．000±3．750、38．750±7．806、65．000±4．330，P〈0．05）。SEM结果显示，与PLGA组比较，PLGA—PEG组中小鼠胚胎肝细胞更易于黏附生长。结论静电纺丝法制备的PLGA—PEG纳米材料具有良好的细胞生物相容性，安全无毒，适宜胚胎肝细胞生长。

大黄素对人胚胎肝细胞L02细胞株法尼醇X受体的调节作用

目的研究大黄素对人胚胎肝细胞L02细胞株法尼醇X受体（FXR）通路的调节作用。方法模型组采用孕二烯二酮（Guggulsterones）对L02细胞株的FXR基因干预，根据大黄素剂量分为高剂量、中剂量、低剂量组（50.0 μmol/L、25.0 μmol/L、12.5 μmol/L），另设对照组。采用实时荧光定量PCR与Western blot检测FXR及下游小异源二聚体伴侣受体（SHP）、尿苷二磷酸葡萄糖苷酸转移酶2B4（UGT2B4）、胆盐输出泵（BSEP） mRNA及蛋白表达。结果1．模型组FXR mRNA及蛋白相对表达量（0.240±0.021、0.385±0.119）较对照组（1.000±0.088、1.000±0.223）显著降低，差异均有统计学意义（t＝14.62、4.21，均P〈0.01）；与模型组比较，大黄素高、中、低剂量组FXR mRNA相对表达量（0.755±0.083、0.817±0.097、0.547±0.080）显著升高，差异均有统计学意义（t＝10.42、10.03、6.39，均P〈0.01）；中剂量组FXR蛋白相对表达量（0.865±0.203）显著升高，差异有统计学意义（t＝3.53，P〈0.01）；高、中剂量组FXR mRNA相对表达量（0.755±0.083、0.817±0.097）均高于低剂量组（0.547±0.080），差异均有统计学意义（t＝3.11、3.70，均P〈0.01）。2.模型组SHP、UGT2B4、BSEP mRNA及蛋白相对表达量（0.148±0.025、0.205±0.039、0.184±0.020，0.458±0.130、0.255±0.170、0.303±0.100）较对照组（1.000±0.099、1.000±0.104、1.000±0.125，1.000±0.129、1.000±0.157、1.000±0.162）显著降低，差异均有统计学意义（t＝14.50、12.44、11.19、5.13、5.57、6.33，均P〈0.01）。高、中、低剂量组SHP、UGT2B4、BSEP mRNA相对表达量（0.610±0.058、0.514±0.041、0.707±0.062，0.755±0.108、0.800±0.086、0.727±0.076，0.470±0.070、0.582±0.050、0.500±0.108）较模型组（0.148±0.025、0.205±0.039、0.184±0.020）显著升高，差异均有统计学意义（t＝12.75、9.38、13.94、9.46、10.90、11.96、7.53、10.31、5.00，均P〈0.01）；高、中剂量组SHP、UGT2B4、BSEP蛋白相对表达量（0.658±0.091、0.624±0.113、0.607±0.097，0.868±0.194、0.883±0.099、0.913±0.131）较模型组（0.458±0.130、0.255±0.170、0.303±0.100）显著升高，差异均有统计学意义（t＝2.18、3.13、3.78、3.05、5.53、6.41，均P〈0.01），低剂量组SHP、BSEP蛋白相对表达量（0.645±0.135、0.572±0.076）不同程度升高，差异均有统计学意义（t＝1.73，P〈0.05，t＝3.72，P〈0.01）。大黄素高、中剂量组BSEP蛋白相对表达量（0.607±0.097、0.913±0.131）均高于低剂量组（0.572±0.076），差异均有统计学意义（t＝1.99、3.90，均P〈0.01）；高、低剂量组SHP、UGT2B4 mRNA相对表达量（0.610±0.058、0.470±0.070，0.514±0.041、0.582±0.050）均低于中剂量组（0.800±0.086），差异均有统计学意义（t＝3.75、6.47、3.83、3.42，均P〈0.01）；高、低剂量组UGT2B4、BSEP蛋白表达量（0.624±0.113、0.644±0.097，0.607±0.097、0.572±0.076）均低于中剂量组（0.883±0.099、0.913±0.131），差异均有统计学意义（t＝4.27、2.98、6.30、3.90，均P〈0.01）。结论Guggulsterones能抑制L02细胞株FXR及下游SHP、UGT2B4、BSEP基因表达，大黄素可通过对FXR基因表达上调，促进SHP、UGT2B4、BSEP基因表达上调，抑制胆汁淤积通路来保护肝细胞，但有剂量差异。

体外培养人胚胎肝上皮细胞方法探讨

采用组织块培养法培养的人胚胎肝上皮细胞于培养后第３－９天即在贴壁组织块周围长出，并可在体外较长期进行培养；传至第８代时仍能分泌甲胎蛋白（ＡＦＰ），含量为１５－４０μｇ／Ｌ。组织块培养法不失为一种较为简单、实用、经济和有效的方法，为探索人胚细胞体外培养方法提供了参考、借鉴的途径。实验还发现人胚胎肝新生细胞长出与组织块贴壁率密切相关。

胚胎肝细胞移植治疗肝硬化血浆氨基酸的动态变化

本文观察了24例肝硬化血浆氨基酸和胰岛素浓度的动态变化,其中胎肝输注组16人,一般内科治疗组8人。结果胎肝输注组,支链氨基酸在输注后较前明显增高,缬氨酸增加13.8％,亮氨酸增加15.21％,异亮氨酸增加18.86％。支链氨基酸与芳香族氨基酸的比值虽见增高,但统计学处理差异无显著性,芳香族氨基酸和胰岛素浓度保持不变。一般内科治疗组,支链氨基酸、芳香族氨基酶、胰岛素浓度均无改变。因此,我们认为胎肝输注后,能提高血浆支链氨基酸浓度,后者增加能提供能源,减少肌肉分解,并能促进肝脏蛋白质的合成,胎肝输注无明显副作用,且有一定疗效,可作为肝硬化的一种治疗方法。

骨形成蛋白家族成员2、7对小鼠胚胎肝干细胞分化的体外研究

目的探讨骨形成蛋白2、7(BMP2、BMP7)对小鼠胚胎肝干细胞(HP14.5)定向诱导分化为肝细胞样细胞的影响。方法将表达BMP2、BMP7、肝细胞生长因子(HGF)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒作为4个组分别感染HP14.5,诱导其分化,在病毒感染后的第1、4、7天通过检测荧光素酶报告基因读数,在第7天通过细胞免疫荧光染色,观察肝细胞标志物白蛋白(ALB)的表达情况;并在第4、7、10天通过PAS染色、尿素氮合成功能检测,观察诱导后HP14.5向肝细胞方向的分化成熟度。结果 BMP2组、HGF组荧光素酶读数较GFP对照组明显上升;免疫荧光染色显示,诱导7d后BMP2组、HGF组细胞质内表达肝细胞特有的ALB,而GFP对照组几乎无表达;糖原染色可见BMP2组、HGF组胞质存在紫红色颗粒,呈阳性反应;尿素合成功能检测显示BMP2组、HGF组培养液中尿素氮随时间而升高。BMP7组诱导后,细胞免疫荧光染色、荧光素酶活性、PAS染色和尿素合成检测均呈阴性或弱阳性反应。结论 BMP2具有一定的诱导HP14.5向成熟肝细胞分化的作用,并初步具备肝细胞的合成分泌功能,而BMP7对其无诱导作用。

Wnt3a过表达对小鼠胚胎肝干细胞凋亡的抑制作用

目的研究Wnt3a对ELSC14.5小鼠胚胎肝干细胞凋亡及相关蛋白表达的影响。方法采用表达绿色荧光蛋白的腺病毒载体系统(Ad-GFP-Wnt3a)转入小鼠ELSC14.5细胞,以Ad-GFP组为空白对照组,Ad-wnt3a组为实验组。实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测Wnt3a及凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Mcl-1的mRNA和蛋白的表达;Hoechst33258染色法结合annexin-PE/7-ADD法检测细胞的凋亡情况。结果 qRT-PCR和Western blot结果显示,Wnt3a在ELSC14.5细胞中特异性表达,表明腺病毒系统Ad-Wnt3a能高效感染ELSC14.5细胞。与对照组相比,抗凋亡因子Bcl-2、mcl-1的mRNA和蛋白的表达显著升高(P<0.05),而促凋亡因子Bax的mRNA和蛋白的表达显著降低(P<0.05)。Hoechst33258染色结合annexin-PE/7-ADD法结果显示,Wnt3a高表达的ELSC14.5细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染的细胞数量很少,细胞凋亡率降低。结论 Wnt3a通过上调Bcl-2家族中抗凋亡因子和下调促凋亡因子来抑制小鼠胚胎肝干细胞的凋亡,延长其生存。

分泌性卷曲相关蛋白3影响小鼠胚胎肝干细胞体外成熟分化的实验研究

目的检测不同发育阶段的肝组织中Wnt信号拮抗因子分泌性卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related pro-tein,SFRP)的表达,并探讨SFRP3对胚胎肝干细胞体外成熟分化的影响。方法分离胚胎12.5 d至出生后4周共9个阶段的小鼠肝组织,RT-PCR检测5种SFRPs在肝组织及胚胎肝干细胞14.5(embryonic liver stem cells,ELSC)中的表达水平。腺病毒SFRP3感染小鼠胚胎肝干细胞,地塞米松(dexamethasone,Dex)联合肝细胞生长因子(hepatic growthfactor,HGF)诱导肝细胞分化,诱导后第3、6、9、12天检测白蛋白启动子荧光素酶报告基因(ablumin promoter-GaussiaLuciferase,ALB-GLuc)活性,诱导后第12天,RT-PCR和Western blot检测肝脏相关基因表达,PAS染色检测糖原合成功能。结果 SFRP1、4、5在不同阶段肝组织中的表达无明显差异,SFRP2和SFRP3只在胚胎期肝组织中表达,随后很快消失。ELSC14.5细胞中,SFRP2高表达而SFRP3表达很低。Dex联合HGF可有效诱导ELSC14.5细胞的体外成熟分化,与对照组相比,SFRP3过表达可降低成熟肝细胞标志白蛋白(albumin,ALB)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)、酪氨酸转氨酶(tyrosine aminotransferase,TAT)、载脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A(UDP-glucuronosyl transferase,UGT1A)的水平,增强肝干细胞标志Delta蛋白(Delta-like protein,DLK)和甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)的表达,并抑制糖原合成功能。结论 SPRF3在肝脏发育过程中表达水平迅速降低,并显著抑制胚胎来源的肝干细胞体外成熟分化,其下调可能是肝脏发育和肝细胞成熟分化的一个重要因素。

胚胎肝干细胞治疗失代偿期肝硬化临床疗效观察

目的:观察胚胎肝干细胞治疗失代偿期肝硬化的临床疗效和安全性。方法:将48例失代偿期肝硬化患者随机分为治疗组22例和对照组26例,均使用保守基础治疗,治疗组同时使用胚胎肝干细胞移植术(采用介入方法分别1/3注入脾脏,2/3注入肝脏),1次/4周,每次细胞数1.0×108,共3次。治疗24周后评价两组临床疗效及Child-Pugh评分情况。结果:治疗组胚胎肝干细胞对失代偿期肝硬化肝功能复常显示良好治疗效应,临床症状有不同程度改善。治疗组总有效率为86.4%,对照组为73%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组显效率13.6%,明显高于对照组的0%(P<0.01)。两组治疗后Child-Pugh积分均较治疗前明显下降(P<0.01),治疗组下降幅度明显优于对照组(P<0.05)。结论:胚胎肝干细胞治疗失代偿期肝硬化对临床症状的改善和肝功能恢复有较好治疗作用,短期安全性可控,远期尚需临床进一步观察。

重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9对小鼠胚胎肝脏干细胞诱导分化的影响

目的探讨重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9(Adv-BMP-9)诱导小鼠胚胎肝干细胞向成熟肝细胞定向分化的影响。方法将已构建的表达BMP-9、肝细胞生长因子(HGF)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒,分别感染小鼠胚胎肝干细胞,诱导其分化,然后采用半定量PCR、Real-time PCR、细胞免疫荧光、荧光素酶报告基因检测等方法检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和细胞角蛋白18(CK18)等肝细胞标志物的表达。结果半定量及Real-time PCR检测,诱导7 d后的BMP-9组、HGF组AFP的mRNA表达△△Ct值分别为(0.027±0.003)、(0.023±0.002),较GFP对照组(0.103±0.018)显著下降,ALB的mRNA表达△△Ct值分别(0.041±0.005)、(0.031±0.001),较GFP对照组(0.013±0.002)明显升高,CK18的mRNA表达△△Ct值分别(0.094±0.003)、(0.083±0.007),较GFP对照组(0.040±0.008)明显升高(P<0.05);细胞免疫荧光染色,诱导7 d后的细胞胞浆内表达肝细胞特有的ALB、CK18等蛋白,而对照组几乎无表达;荧光素酶报告基因检测,诱导1、4、7 d的BMP-9组、HGF组的ALB表达荧光素酶A值分别[(5 509.35±213.08),(33 198.14±666.39),(50 815.03±1 730.75)]、[(5 539.25±132.62),(31 400.71±2 622.39),(49 088.28±1 868.03)],较GFP对照组(4 732.49±68.22),(9 407.71±487.84),(20 894.83±1 100.54)明显升高(P<0.05)。结论 BMP-9有诱导小鼠胚胎肝脏干细胞向成熟肝细胞样细胞分化的作用,并且BMP-9对小鼠胚胎肝干细胞的诱导分化作用甚至和传统的肝干细胞诱导分化因子HGF相当。

TGF-β1信号介导的肝星状细胞促进胚胎肝前体细胞向胆管细胞方向分化

目的探讨转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)激活的小鼠肝星状细胞(mouse hepatic stellate cells,mHSCs)对小鼠胚胎肝前体细胞(mouse hepatic progenitor cells,mHPCs)分化的影响。方法 mHSCs细胞株加入10 ng/mL TGF-β1刺激48 h,并分为激活组(mHSCsTGF-β1)和对照组(mHSCs)。qRT-PCR和Western blot法检测mHSCs激活情况。采用荧光激活细胞筛选法(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分选DLK1(delta-like1 homologue)表面抗原阳性的原代mHPCs,分选的细胞利用免疫荧光染色法观察甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、白蛋白(albumin,ALB)及细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)抗原表达情况。mHPCs与mHSCs Transwell共培养6 d后,分为mHPCs+mHSCs-TGF-β1组、mHPCs+mHSCs组和mHPCs组。细胞免疫荧光技术法和qRTPCR法检测分化标志物表达情况。结果激活组mHSCs中TGF-β1、α-SMA、TGF-β-R1、Jagged1、VEGF、HGF等m RNA和TGF-β1、a-SMA、TGF-β-R1、Jagged1等蛋白的表达量均较对照组明显增加(P<0.01);FACS新分选的mHPCs胞质中表达AFP和少量ALB,但不表达CK19;mHPCs+mHSCs-TGF-β1组mHPCs胞质中大量表达胆管细胞标志物,并且CK19、SOX9、Hes1等m RNA表达量均较其他两组明显增加,而其他两组mHPCs中ALB、AFP等的表达量明显增加(P<0.01)。结论 TGF-β1激活的肝星状细胞诱导胚胎肝前体细胞向胆管细胞分化。

胚胎肝干细胞的研究进展

近年来的研究表明在胚胎肝脏中存在大量的肝干细胞,它们在肝脏的发育中起着重要作用,并且受到各种时序性表达基因的调控。几个研究组采用不同的方法,分别从小鼠、大鼠和灵长类动物的胚胎肝脏分离并鉴定了具有双潜能的肝干细胞。就胚胎肝脏的发育、调控机制以及胚胎肝干细胞的分离、鉴定等方面的研究进展作一综述,并对胚胎肝干细胞的应用前景和今后的研究方向作了展望。

不同Wnt信号分子对胚胎肝干细胞分化的影响研究

目的探讨不同Wnt蛋白对小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19分化的作用,筛选有效的肝干细胞定向分化体系,为治疗肝衰竭提供理论基础。方法携带不同Wnt蛋白基因的19种重组腺病毒,分别感染HP14-19,检测清蛋白启动子启动的荧光素酶报告基因活性;实时荧光定量PCR检测detla蛋白DLK、甲胎蛋白(AFP)、清蛋白(ALB)、上皮特异性标志物细胞角蛋白(CK18)等肝细胞分化成熟相关标志物的表达情况;糖原(PAS)染色实验和吲哚菁绿(ICG)摄取实验用于检测肝细胞合成代谢功能。结果19种Wnt腺病毒均能有效感染HP14-19细胞并表达相应的Wnt信号蛋白,随着处理时间的延长,荧光素酶值逐渐升高,其中Wnt3a的作用最明显;Ad-Wnt3a组肝干细胞标志DLK、AFP表达明显下降;肝细胞特异性成熟标志ALB、CK18明显上调;Ad-Wnt3a处理后PAS染色可见70%~80%的细胞染色阳性,细胞由多角形变为长梭形;ICG摄取实验可见大量绿色圆形或者多边形阳性细胞。结论Wnt3a蛋白是诱导HP14-19细胞成熟分化的重要蛋白,诱导分化后的细胞类似于成熟肝细胞,有较强的合成代谢功能;对进一步研究肝干细胞分化调控及肝移植应用有重要意义。