人Kv1.3通道基因转染人胚胎肾细胞的研究

目的:建立表达人Kv1.3通道的细胞模型,为临床研究提供帮助。方法:Lipofactamine2000脂质体将人Kv1.3通道基因转染人胚胎肾细胞(HEK293),通过荧光显微镜和全细胞膜片钳技术观测人Kv1.3通道基因的表达。结果:pcDNAHKv1.3真核表达载体转染HEK293细胞2 d后,荧光显微镜可观察到人Kv1.3通道表达;3 d后全细胞膜片钳技术记录到人Kv1.3通道基因编码的通道电流。结论:pcDNAHKv1.3真核表达载体转染HEK293细胞为人Kv1.3通道的研究提供良好的真核细胞表达系统和细胞模型,有利于指导治疗自身免疫性疾病新药的开发。

TDP-43在人胚胎肾细胞中的代谢及其产物对细胞活力的影响

目的研究TAR DNA结合蛋白43 kD(TDP-43)在人胚胎肾细胞HEK293中的代谢过程及其产物对细胞活力的影响。方法应用不同浓度十字孢碱(STS)作用于HEK293细胞,检测TDP-43含量的变化,并联合使用不同的蛋白降解通路阻滞剂研究其代谢机制,再通过转染外源性TDP-43研究其对细胞活力的影响。结果 STS对HEK293细胞中TDP-43蛋白含量影响不大,在较高浓度时(5、10μM)会诱导HEK293细胞产生35 kD片段。进一步研究发现这一35 kD片段是通过泛素-蛋白酶体通路降解的,且其过表达时会明显降低HEK293细胞的活力。结论过表达外源性TDP-43及其35 kD片段可对HEK293细胞活力产生抑制作用,可能是导致TDP-43相关疾病的原因。

人Kv1．5通道基因转染人胚胎肾细胞的研究

目的建立表达人Kv1.5通道的细胞模型。方法采用Lipofactamine 2000脂质体将人Kv1.5通道基因转染人胚胎肾细胞(HEK293),通过荧光显微镜和全细胞膜片钳技术观测人Kv1.5通道基因的表达。结果pcDNAHKv1.5真核表达载体转染HEK293细胞2d后,荧光显微镜可观察到人Kv1.5通道表达;3d后全细胞膜片钳技术记录到人Kv1.5通道基因编码的通道电流。结论pcDNAHKv1.5真核表达载体转染HEK293细胞为人Kv1.5通道的研究提供了良好的真核细胞表达系统和细胞模型。

人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控

目的探讨人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控。方法通过Polysome profiling结合Western blot实验检测并验证HEK293细胞中mRNA的翻译活性;通过针对RPL10A和RPS17两种核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀、建库测序(RIP-seq)及生物信息学分析,获得参与HEK293细胞蛋白质合成调控的相关分子。结果在两种核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀实验富集的分子中共有129种基因,其中93.8%为蛋白质编码基因;且功能与RNA剪接、分解代谢、MAPK信号通路、染色体定位、RNA转运等相关。结论通过针对核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀可以获得HEK293细胞中活跃翻译的mRNA。

胚胎后肾间充质细胞移植对急性肾小管坏死肾功能的修复作用

目的:将体外培养的胚胎后肾间充质细胞,通过尾静脉注射移植给急性肾小管坏死的模型大鼠,观察是否改善对肾功能起修复作用。方法:(1)体外培养、扩增及生物学鉴定大鼠胚胎后肾间充质细胞株(RIMM-18);(2)通过皮下注射总量为900mg/kg庆大霉素,建立急性肾小管坏死的大鼠模型;(3)除空白组外,将造模大鼠随机分为3组:①移植组:造模后通过尾静脉注射移植培养的RIMM-18细胞1～6×107/ml;②培基组:造模后通过尾静脉注射等量的无血清培养基;③急性肾小管坏死组(ATN组):皮下注射总量为900mg/kg的庆大霉素×3d。(4)留取标本:分别于成模后1d、4d、1周、2周及4周杀鼠,留取尿和血标本;(5)生化指标检测:BUN、Scr、尿蛋白、尿肌酐、β2-MG、NAG和RBP等。结果:(1)RIMM-18细胞体外生长良好,保持间充质细胞特性。(2)皮下注射总量900mg/kg的庆大霉素3d成模。(3)移植组大鼠毛发有光泽、脱毛少,体重及尿量的恢复较快,死亡率下降。(4)各组大鼠生化指标比较:移植组尿蛋白于4d时达峰值,2周时下降接近正常;而培基组和ATN组于1周达峰值,持续至4周降至正常。移植组、培基组和ATN组于1周、2周时其值分别为(1.37±0.10)mg/L、(1.97±0.21)mg/L、(2.05±0.19)mg/L,(0.56±0.07)mg/L、(1.59±0.07)mg/L、(1.66±0.11)mg/L,移植组与培基组及ATN组之间差异有统计学意义(P<0.01)。BUN、Scr、NAG、RBP及β2-MG变化规律类似。(5)肾脏病理:移植组4d时肾小管病变最显著,培基组和ATN组则于1周时肾小管病变最明显,恢复较移植组慢。肾小管Paller氏评分显示于1周、2周、4周时移植组与培基组及ATN组之间差异有统计学意义(P<0.01)。结论:胚胎后肾间充质细胞通过尾静脉移植能改善ATN的肾功能。

马尾松树皮提取物对顺铂所致体外人胚肾细胞毒性的保护作用

目的体外研究马尾松皮提取物(PMBE)对于顺铂(CDDP)所致人胚肾细胞毒性保护作用及其作用机制。方法体外进行人胚肾细胞293(HEK293)的培养,分别应用PMBE和CDDP进行处理,并以四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)检测细胞生长情况;同时检测细胞中丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)的含量。结果低浓度(≤80mg/L)PMBE可促进HEK 293细胞的生长,提高细胞GSH的含量,降低MDA和ROS的含量;在较高浓度下可产生轻微的细胞毒性。结论低浓度PMBE对于CDDP所致肾毒性具有一定的保护作用,作用机制与其抗氧化性有关。

构建hTNF-α/293基因细胞对人结肠癌细胞增殖影响的实验研究

目的通过体外实验研究观察稳定转染hTNF-α/293基因细胞对人结肠癌(LOVO)细胞生长增殖影响。方法采用RT-PCR和ELISA检测稳定转染hTNF-α/293基因细胞和Hek-293细胞mRNA和蛋白表达水平。观察体外培养中,hTNF-α/293基因细胞与LOVO细胞共同培养,于不同的时间点,采用噻唑蓝MTT法检测LOVO肿瘤细胞增殖的活性。结果重组质粒转染Hek-293细胞后,Western blot检测到了hTNFα蛋白体外表达,检测表明hTNFα/293细胞组和hTNFα阳性组对共培养的LOVO细胞的增殖具有明显的抑制作用,且具有良好的量效关系。结论提示稳定转染hTNF-α/293对LOVO细胞增殖有明显抑制效应,且呈现出良好的数量依赖关系。由于TNF-α/293基因细胞可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外。

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的:建立稳定的基因工程细胞系。方法:将含有人肿瘤坏死因子α(hTNFα)全长cDNA插入表达载体pSNAV2.0,产生重组质粒pSNAV2.0-TNFα,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中,G418筛选阳性克隆hTNF/293,采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达。结果:通过SalⅠ和EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证明:在质粒pSNAV2.0中插入片段正确。采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFα蛋白表达,分子量为17KDa。结论:成功构建重组质粒pSNAV2.0-TNFα,真核表达载体构建正确,转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外。

体外培养APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞对结肠癌细胞增殖的影响

背景:积极探索结肠癌相关基因及抑癌基因已成为新的研究热点,人肿瘤坏死因子α是一个重要的促炎因子和免疫调节因子,对肿瘤的免疫治疗具有一定的疗效。目的:观察体外培养海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine-alginate,APA)微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞对结肠癌细胞增殖的影响。方法:采用前期建立的制备方法,用APA微囊分别包裹人肿瘤坏死因子α/293细胞,APA微囊化0/293细胞。取对数生长期结肠癌(Lovo)细胞,配制成所需浓度的细胞悬液,接种24孔板培养,分别加入低、中、高剂量稳定转染的APA微囊化肿瘤坏死因子α/293,即分为5个实验组,APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞低剂量组、中剂量组、高剂量组、阴性组为APA微囊化0/293细胞组,阳性组加入肿瘤坏死因子α,MTT法检测490nm吸光度;通过对人肿瘤细胞增殖抑制实验,观察对结肠癌细胞(Lovo)增殖的抑制作用。结果与结论:体外培养中,加入APA微囊化0/293细胞组对结肠癌细胞增殖无抑制作用;而APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞中、高剂量组和阳性组,在24,48,72h的A值低于APA微囊化0/293细胞组(P<0.05),提示APA微囊化人肿瘤坏死因子α/293细胞所分泌肿瘤坏死因子α对结肠癌细胞有增殖抑制效应,均呈现出良好的数量依赖关系。

分泌肿瘤坏死因子的基因工程细胞对HepG2细胞的抑制作用

目的自行建立分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞,将其与肝癌细胞共培养,观察体外培养中分泌肿瘤坏死因子hTNF/293基因细胞表达的情况及对人肝癌细胞的抑制作用。方法 (1)建立可稳定分泌人肿瘤坏死因子α/293细胞;采用RT-PCR、Western blot、ELISA和流式细胞仪等技术检测人肿瘤坏死因子表达和分泌;(2)观察体外培养中分泌肿瘤坏死因子hTNF/293基因细胞对人肝癌细胞的抑制作用,于不同的时间点,用MTT法检测490 nm下的吸光度值。结果 RT-PCR、Western blot和ELISA等技术检测表明hTNFα/293细胞组和TNFα阳性组对共培养的HepG2细胞的增殖具有明显的抑制作用,且具有良好的量效关系。结论提示TNF-α/293基因细胞可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外;体外培养的人肿瘤坏死因子基因的工程细胞,所分泌肿瘤坏死因子α对人肝癌细胞增殖有明显抑制效应,且呈现出良好的数量依赖关系。

持续释放人血管抑素的基因修饰化工程细胞h E/293细胞株的建立

目的:在人胚肾HEK293细胞中转染真核表达载体pSNA2/hEndostatin(hEndostatin,人血管抑素),建立能稳定分泌hES的基因工程细胞株.方法:将含有IL-2分泌肽的人endostatin(ES)全长cDNA插入真核表达载体pSNA2,产生重组质粒pSNA2/hEndostatin;利用阳离子脂质体介导将其转染入HEK293细胞中;用G418筛选出阳性克隆细胞,将其命名为hE/293细胞.用Western blot法检测hE/293细胞培养上清中分泌的hES蛋白.血管内皮细胞(ECV304)增殖抑制试验及鸡胚尿囊膜试验观察其分泌的hES蛋白的抗增殖活性.结果:经过双酶切和DNA测序证实构建出了含hES基因的真核表达载体.通过G418抗性筛选筛选出稳定表达hES的细胞株3株,将其命名为hE/293细胞;Western blot检测该细胞株培养上清中存在分子量为20 kDa的ES蛋白;ECV304增殖抑制试验显示,与HEK293细胞组相比,hE/293细胞组分泌的ES蛋白对bFGF刺激的血管内皮细胞增殖有明显的抑制作用(48h:0.125±0.007 vs 0.159±0.020,P<0.01;72 h:0.088±0.016 vs 0.249±0.070,P<0.01);鸡胚尿囊膜试验证实hE/293细胞分泌的ES蛋白可以抑制鸡胚尿囊膜血管生长.结论:所构建的hE/293细胞株可以稳定的分泌hES蛋白,并能抑制ECV304细胞生长及鸡胚尿囊膜血管生长.

分泌人内皮抑素基因工程细胞系的建立

目的建立稳定的基因工程细胞系。方法将含有白细胞介素-2(IL-2)分泌肽的人endostatin全长cDNA插入真核表达载体pSNA2.0,产生重组质粒pSNA2.0/hEndostatin,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK293细胞中,G418筛选后得到阳性克隆hED/293,采用Western-blot检测转染细胞上清中endostatin蛋白的表达。结果hED/293细胞株培养上清中有endosta-tin蛋白的表达,分子量为20000。结论重组pSNA2.0/hEndostatin真核表达载体构建正确,转染HEK293细胞后可有效的表达人endostatin蛋白,并能分泌到细胞外。

脂质体介导hHCN2基因转染HEK293细胞

目的建立一种研究离子通道的有效模型。方法采用Lipofacta mine2000脂质体将人的超极化激活的环核苷酸门控(HCN)基因转染人胚胎肾(HEK)293细胞,利用全细胞膜片钳技术检测克隆人HCN2基因的表达。结果pcDNA3-hHCN2真核表达载体转染HEK293细胞3d后,全细胞膜片钳技术记录到克隆人HCN2基因编码的通道电流。结论全细胞膜片钳技术稳定、可靠,可为开展克隆离子通道结构和功能关系研究提供基础。

早老素通过下调CDK4使HEK293T细胞周期阻滞

早老素(progerin)的累积导致儿童早老症(Hutchinson-Gilford progeria syndrome,HGPS)的发生,并与正常衰老相关。早老素能使细胞内稳态失衡但分子机制仍有待深入研究。本研究旨在探讨早老素导入人胚胎肾293T细胞(human embryo kidney 293T cell,HEK293T)后细胞增殖、周期变化的分子机制。形态学观察发现过表达早老素的HEK293T细胞密度下降,(57±2.47)%细胞核形态皱缩。细胞增殖和周期实验证明早老素使细胞增殖减慢,发生G1/S期阻滞,G1细胞从(42.3±1.31)%升至(47.2±1.26)%,而S期细胞从(43.1±1.36)%降至(38.5±1.42)%。Western印迹结果显示早老素的高表达引起p21蛋白表达上调(103.2±1.49)%,CDK4下调(63±1.52)%,而p53、ATM、Cyclin E1以及p16等蛋白质水平均不变;HEK293T细胞中早老素的过表达导致γ-H2AX水平下调(53±1.36)%,H2O2处理后变化趋势不变。我们的研究结果提示,早老素通过上调p21和下调CDK4使细胞发生周期阻滞,不能增加HEK293T细胞的损伤及衰老。

胚胎后肾间充质干细胞对多柔比星肾病大鼠足细胞Nephrin、Podocin表达的影响

目的探讨胚胎后肾间充质干细胞对多柔比星肾病(ADN)模型(微小病变型)大鼠足细胞Nephrin、Podocin表达的影响。方法将大鼠随机分为模型组、胚胎后肾间充质干细胞注射组(RIMM-18细胞组)和对照组,各18只。模型组、RIMM-18细胞组大鼠一次性尾静脉注射多柔比星5 mg.kg-1,对照组予尾静脉注射9 g.L-1盐水3 mL。造模3 d后RIMM-18细胞组及对照组分别予尾静脉注射1×107L-1RIMM-18细胞和1 mL无血清培养液。造模第6、17、31天检测各组大鼠24 h尿蛋白、血清清蛋白、血清胆固醇及肾脏病理改变,采用免疫荧光及Western blot检测各组大鼠Nephrin、Podocin表达情况。结果在造模第31天RIMM-18细胞组大鼠24 h尿蛋白及血清胆固醇较模型组明显减少,血清清蛋白明显升高,足突融合情况明显减轻,足细胞Nephrin、Podocin表达明显增多(Pa<0.05)。结论尾静脉注射胚胎后肾间充质干细胞可减少ADN大鼠的蛋白尿,减轻ADN大鼠肾组织足细胞足突融合。其可能的机制是通过上调Podocin、Nephrin蛋白的表达从而维持蛋白复合体的结构和功能的完整。

水稻中的磷转运蛋白基因在异源表达系统中的功能分析

为了更好地研究植物在磷素吸收过程中的分子机制以及生物化学过程的变化,将水稻中分离得到的一个磷转运蛋白基因(OsPT6)用于互补实验。互补实验结果表明,OsPT6能够与缺失磷转运功能的酵母突变体实现互补,并在低磷条件下促进酵母突变体对磷的吸收。进一步分析表明OsPT6属于水稻Pht1家族运输蛋白基因,所编码的蛋白对磷酸盐(Pi)的吸收Km值为96μmol/L,属于高亲和的磷转运蛋白。不同的酵母转化子对不同pH环境的响应实验显示,OsPT6是一个与质子相偶联的磷运输蛋白,其吸收磷素的最佳pH为6.0。对OsPT6在人的胚胎肾细胞(HEK293)中的表达分析表明,该基因能够编码蛋白并定位于细胞膜,证明OsPT6的功能与酵母磷转运子PHO84相似,是一个定位于细胞膜上的具有吸收转运磷素作用的运输蛋白。

相思豆毒素的内化作用

目的 研究相思豆毒素 (ABR)的内化入胞作用并探讨内化入胞的可能作用机制。方法 葡聚糖凝胶层析制备ABR的异硫氰酸荧光素 (FITC)标记探针 (FITC ABR) ;MTT比色法测定FITC ABR对体外培养人胚胎肾细胞 (HEK)增殖的抑制作用 ;激光共聚焦显微镜示踪FITC ABR的内化过程。结果FITC ABR在凝胶层析图谱中先于FITC洗脱 ,两者能较好的分离 ,所制备的FITC ABR浓度为 10 .0g·L- 1,FITC ABR与ABR在 10 0 0～ 0 .0 1μg·L- 1浓度范围内 ,以相同浓度作用于HEK细胞 ,对细胞增殖的抑制作用相似 ,两者的pIC50 均约为 16pmol·L- 1;分子荧光探针FM4 6 41.5 μmol·L- 1对体外培养HEK细胞连续标记 12h ,能特异性标记细胞膜及膜性细胞器如胞内体、溶酶体、高尔基体等 ,细胞膜及胞内分别可见连续以及散在的红色荧光 ;FITC ABR 10mg·L- 1单独标记细胞 15 ,30min ,即可见到胞内有绿色荧光 ,FITC ABR与FM4 6 4联合标记细胞 ,在胞内的某些红色荧光部位同时具有FITC ABR的绿色荧光 ,两种颜色的荧光叠加后产生棕褐色荧光 ;以0 .1mol·L- 1乳糖封闭细胞膜的ABR结合位点后 ,再以FITC ABR标记细胞 30min ,可见细胞膜的绿色荧光明显减弱 ,胞内几乎无绿色荧光。升高胞内体pH的药物NH4 Cl 1mmol·L- 1能明显增强FITC ABR对胞内各膜?

PSNAV2.0-TNFα重组质粒的构建及其在体外的表达

目的:在前期微囊化基因工程细胞制备平台的基础上,构建分泌型人肿瘤坏死因子α的真核表达载体PSNAV2.0-TNFα重组质粒,并鉴定其蛋白的体外瞬时表达,为进一步利用该基因进行微囊化细胞移植治疗和改善疾病奠定基础。方法:实验于2006-06/2007-05在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学实验室完成。①以含有人肿瘤坏死因子αcDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得人肿瘤坏死因子α基因片段;将其定向插入真核表达载体PSNAV2.0中,获得重组质粒PSNAV2.0-TNFα。采用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切法、PCR法及插入片段序列测定法鉴定该质粒。②利用阳离子脂质体介导法,将其转染到人胚胎肾细胞HEK-293细胞中,构建可持续分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞,采用RT-PCR法和Western blot法检测转染细胞培养上清液中人肿瘤坏死因子蛋白的体外瞬时表达。结果:①通过SalⅠ和EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证明:在HEK-293中插入片段正确。②采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有人肿瘤坏死因子α蛋白,Mr17000。结论:成功构建了重组质粒PSNAV2.0-TNFα真核表达载体,转染HEK-293细胞后可有效分泌人肿瘤坏死因子α蛋白,并能分泌到细胞外。

重组腺病毒Ad-p16的扩增及病毒滴度检测

目的 :探讨高效扩增腺病毒载体的方法。 方法 :用人胚胎肾 2 93细胞株扩增重组腺病毒 ,并测定病毒滴度。 结果 :扩增得到腺病毒的滴度约为 5× 10 8PFU/ ml。 结论 :用人胚胎肾 2 93细胞株扩增重组腺病毒 ,在不进行任何浓缩时可达较高病毒滴度 ,为腺病毒介导的基因转移方法提供了理论基础。

鹿茸提取物对顺铂诱导人胚肾细胞损伤的影响

建立顺铂(CDDP)诱导人胚肾成纤维细胞(HEK293)细胞损伤模型,通过MTT和LDH测定,比较不同浓度的鹿茸提取物(水提物,醇提物,乙醚提取物,氯仿提取物,乙酸乙酯提取物)诱导HEK293细胞损伤的保护作用。体外培养HEK293细胞,观察鹿茸提取物对CDDP诱导HEK293细胞生长的影响,并用MTT法和LDH法检测鹿茸对CDDP诱导HEK293细胞死亡率的变化。结果表明:鹿茸提取物能够拮抗CDDP诱发的细胞损伤,具有浓度依赖性,其半数致死浓度为(0.083±0.030)mmol/L。当HEK293细胞与不同浓度鹿茸提取物共同孵育24 h,分别加入CDDP后,检测表明鹿茸水提物较其他溶剂提取物对顺铂诱导损伤的HEK293有较好的保护作用,其质量浓度为1 mg/m L时对顺铂诱导损伤的HEK293细胞的保护作用最强,细胞存活率达到62.0%(P<0.01)。鹿茸水提物对CDDP诱导人胚肾细胞损伤的抑制作用最显著,可有效保护细胞活性。