荧光定量PCR分析水牛胚胎致密化相关基因表达方法的建立

胚胎致密化是哺乳动物早期胚胎发育过程中一个非常重要的环节,有研究发现致密化相关基因的表达水平与体外发育胚胎的质量之间存在着相互关联作用。为了分析水牛胚胎早期发育中致密化相关基因在mRNA水平上的表达并确定其定量分析方法,本研究根据黄牛有关基因序列设计了Cx43、Cx31、E-cad以及组蛋白基因(Histone H2A)引物序列,分析了黄牛和水牛致密化基因的同源性,并确定各目的基因在水牛胚胎的SYBR Green I实时定量PCR反应条件。

致密化相关基因在动物胚胎发育过程中的作用研究进展

桑椹胚致密化是早期胚胎发育过程中的关键步骤,与胚胎质量密切相关。已有研究发现体内外发育的胚胎表现明显不同的致密化过程,缝隙连接蛋白、上皮钙调素蛋白基因的表达也有差异。本文针对致密化相关基因在胚胎早期发育过程中的作用及一些影响因素的研究进展进行综述。

水牛体外培养早期胚胎中致密化相关基因mRNA的表达分析

为了研究致密化相关基因在水牛体外培养早期胚胎中的mRNA表达情况,采用Taqman探针法和SYBR GreenⅠ染料法分别分析了缝隙连结蛋白43和31(Cx43、Cx31)、上皮钙调素蛋白(E-cad)3个基因在水牛体外成熟卵母细胞及培养的早期胚胎中的mRNA表达。结果发现,Cx43基因在水牛成熟卵母细胞中表达量最高,显著高于后3个发育阶段(P<0.05);Cx31基因mRNA表达趋势与Cx43相反,成熟卵母细胞中表达量最低,囊胚期最高,随体外胚胎发育Cx31mRNA表达量逐渐增高;E-cad基因在体外培养的各阶段胚胎中mRNA表达无显著差异(P>0.05)。以上结果表明,3个致密化相关基因在水牛体外培养早期胚胎中均有表达,但是具有明显不同的mRNA表达方式。

D3致密化胚胎的临床结局分析

目的探讨取卵后第3日(D3)致密化胚胎的临床结局。方法回顾性分析2014年1月至2021年5月在解放军联勤保障部队第901医院生殖医学中心行IVF/ICSI助孕且D3有致密化胚胎形成的547个取卵周期及其331个移植周期的临床资料。根据D3移植胚胎形态,分为致密化胚胎组(n=26)和优质卵裂胚组(n=105),比较两组胚胎的囊胚形成率及优质囊胚形成率;根据囊胚移植周期D3胚胎来源,分为致密化胚胎来源囊胚组(n=67)和优质卵裂胚来源囊胚组(n=133),分别比较各组的临床结局,并采用二元Logistic回归分析早期流产率的影响因素。结果D3致密化胚胎与优质卵裂胚的囊胚形成率(69.57%vs.67.14%)及优质囊胚形成率(36.16%vs.33.83%)均无显著差异(P>0.05)。D3致密化胚胎组与优质卵裂胚组的临床妊娠率、种植率、持续妊娠率均无显著差异(P>0.05),但D3致密化胚胎组的早期流产率显著高于优质卵裂胚组(35.71%vs.5.26%,P<0.05);Logistic回归分析显示,早期流产率与移植胚胎质量(优质卵裂胚或致密化胚胎)有关(P=0.028)。不同D3胚胎来源的囊胚其临床妊娠率、早期流产率、种植率、持续妊娠率均无显著差异(P>0.05)。结论D3胚胎移植时建议选择优质卵裂胚,D3致密化胚胎建议行囊胚培养后移植。

E-钙粘蛋白抗体对小鼠早期胚胎发育的影响

旨在研究E-钙粘蛋白抗体(ECCD-1)对小鼠早期胚胎体内外发育的影响。在体外培养小鼠8-细胞胚胎的培养液中,分别添加不同浓度的ECCD-1,通过胚胎形态观察、碱性磷酸酶染色、多能性因子免疫染色、体外贴壁培养、嵌合体制备以及体内移植试验检测ECCD-1对小鼠胚胎发育能力的影响。结果表明,ECCD-1抗体延迟胚胎致密化和囊胚腔形成,但内细胞团并未受到影响,胚胎碱性磷酸酶和SSEA-1、Oct-4、Sox2、Nanog 4种多能性因子的免疫染色都呈阳性,此外,ECCD-1抗体也不影响胚胎的体外贴壁生长、体内移植着床以及嵌合体的制备。这些数据表明,ECCD-1抗体延迟胚胎致密化但并不影响胚胎的体内外发育能力。

IVF周期中第三天发生致密化胚胎的植入潜能分析

目的探讨IVF周期中第三天发生胚胎致密化患者的基本情况以及致密化胚胎的植入潜能。方法回顾性分析自2013年1月至2016年12月来本院生殖医学中心行首次IVF治疗的不孕症患者,比较第三天发生胚胎致密化的周期与未发生致密化的周期相比基本情况有何差异,同时比较第三天发生致密化的胚胎发育潜能与未致密化的优质胚胎相比有何差异。结果第三天发生胚胎致密化的周期患者年龄较年轻,基础情况较好,卵巢的反应性也较好,获卵数与可用胚胎数均显著高于对照组患者。第三天移植一枚致密化胚胎的患者与移植一枚未致密化优质胚胎的患者取得了相似的临床结局。结论第三天发生胚胎致密化的患者基础情况及卵巢反应性均较好,致密化胚胎与未致密化的优质胚胎相比具有相似的植入潜能。

早期致密化对IVF-ET临床妊娠结局的影响

目的研究培养第3天胚胎致密化对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)后临床妊娠结局的影响,优化移植前胚胎优选条件,改善IVF-ET的临床妊娠结局。方法 1.将接受IVF的患者分成非致密化组(A组,150例)和致密化组(B组,150例),比较相对应的两组病人的基本情况和受精后胚胎的发育情况以及移植后的临床妊娠情况;2.将接受IVF的患者分组成非致密化组(A组,100例)和致密化组(B组,100例),比较相对应的两组胚胎在受精后第5天囊胚的发育情况和移植后的临床妊娠情况;3.将培养第3天冷冻复苏后的胚胎分成非致密化组(A组,100例)和致密化组(B组,100例),比较相对应的两组胚胎在培养后囊胚的发育情况和移植后的临床妊娠情况。结果 (1)两组患者的年龄、不孕年限、Gn用量、基础FSH、移植日内膜厚度、获卵数、移植胚胎数、受精率、卵裂率、D3优质胚胎率、D3可用胚胎率、D3可用胚胎率和冷冻胚胎率均无统计学差异(P>0.05),但B组的临床妊娠率、着床率和活产率均显著地高于A组(P=0.05,P=0.006和P=0.046);(2)两组患者的年龄、不孕年限、Gn用量、基础FSH、移植日内膜厚度、获卵数、移植胚胎数、受精率、卵裂率、D3优质胚胎率、D3可用胚胎率和可用囊胚率没有统计学差异(P>0.05),与A组相比,B组患者移植后的临床妊娠率、着床率和活产率有明显的增加(P=0.047,P=0.003和P=0.033);(3)两组患者在D3可用胚胎率、可用囊胚率、移植日内膜厚度和移植胚胎数上没有统计学差异(P>0.05),但B组患者的临床妊娠率、着床率和活产率明显高于A组,两者有统计学差异(P=0.045,P=0.006和P=0.047)。结论第3天发生致密化的胚胎有更好的胚胎发育潜能,移植致密化的胚胎能提高临床妊娠率,改善临床妊娠结局,致密化的胚胎可以作为IVF-ET中的优选胚胎。