DEHP对雄性仔鼠胚胎Leydig细胞雄激素合成的影响

目的:研究邻苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)对雄性仔鼠胚胎Leydig细胞(FLC)雄激素合成的影响。方法:DEHP分别以低、中、高3组剂量(10、100、750 mg.kg-1.d-1)灌胃作用于怀孕12 d到产后1 d(GD12-PND1)的SD母鼠,观察DEHP对雄仔鼠血清睾酮(T)水平、睾丸FLC形态结构、睾丸FLC的类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)及胰岛素样生长因子1(IGF-I)mRNA的相对表达量(ΔΔCT法)。结果:低剂量组血清T水平显著高于对照组(P<0.01);而中、高剂量组血清T水平显著低于对照组(P<0.05)。光镜下低剂量组可见间质细胞聚集呈簇分布,中剂量组与高剂量组均可见间质细胞呈瘤样增生。电镜示低剂量组间质细胞椭圆形、长梭形,脂质颗粒减少,线粒体、滑面内质网丰富。中、高剂量组间质细胞呈梭形或椭圆形,大小不一,核大、圆,胞浆丰富,细胞聚集一起,胞质内可见丰富的脂质颗粒,脂质颗粒染色深,滑面内质网及线粒体扩张。高剂量组睾丸FLC的StAR mRNA的相对含量显著低于对照组(P<0.01)。低剂量组睾丸FLC的IGF-Ⅰ mRNA相对含量显著高于对照组(P<0.01)。结论:DEHP对新生雄性仔鼠睾丸FLC有毒性作用,可影响雄性仔鼠睾丸FLC的形态学及其生成类固醇的能力。其可能机制是低剂量DEHP宫内暴露后,促进睾丸FLC的IGF-ⅠmRNA表达从而引起血清睾酮升高,而高剂量DEHP可能通过抑制睾丸FLC StAR mRNA表达从而降低血清睾酮水平。

巨噬细胞迁移抑制因子对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的影响

背景:巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一种具有多效性作用的细胞因子,可以在不同类型干细胞中自分泌并且能调控细胞的增殖、分化和迁移。课题组前期研究证实人胚胎干细胞自分泌MIF,且在培养液中浓度基本固定。然而,MIF是否参与了人胚胎干细胞的存活、增殖和分化尚不清楚。目的:探究MIF对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的作用。方法:(1)培养人胚胎干细胞H9,CCK-8法检测并绘制细胞生长曲线,采用酶联免疫吸附法定量检测培养基中MIF水平。(2)为了明确外源性MIF对人胚胎干细胞存活、增殖的影响,分为:对照组,细胞在干细胞培养基中正常培养;外源性MIF组,在干细胞培养基中分别添加30,100,300 ng/m L的MIF;MIF抑制剂ISO-1组,在干细胞培养基中分别添加2,7,21μmol/L的ISO-1;MIF+ISO-1组,在不同浓度ISO-1组中分别添加100 ng/m L MIF,采用CCK-8法检测上述各组细胞活力。(3)为进一步阐明MIF基因对人胚胎干细胞存活、增殖的影响,采用CRISPRCas9技术构建MIF敲除的H9细胞系,观察建系情况。(4)为了明确高浓度MIF对人胚胎干细胞初步分化是否有影响,在培养基中分别添加100 ng/m L MIF和100 ng/m L CXCR4中和抗体,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)、免疫细胞荧光、蛋白质印迹法(Western blot)检测干细胞自我更新因子(KLF4、c-MYC、NANOG、OCT4、SOX2)及分化转录因子(FOXA2、OTX2)的表达水平。结果与结论:(1)人胚胎干细胞H9的对数生长期为3-6 d,正常生长的情况下自分泌MIF水平约为20 ng/m L,与细胞量无关;(2)与对照组相比,添加不同质量浓度MIF对人胚胎干细胞的增殖无影响(P>0.05);ISO-1明显抑制人胚胎干细胞的增殖,ISO-1浓度越大,抑制越明显(P<0.05);ISO-1中添加MIF可以减少ISO-1的抑制作用(P<0.05);(3)RT-q PCR检测MIF基因敲除约50%后,人胚胎干细胞生长活力显著降低并且无法建系成功;(4)在培养基中添加100 ng/m L外源性MIF,自我更新转录因子KLF4的m RNA、蛋白及荧光表达水平均下降;分化因子FOXA2的m RNA、蛋白及荧光表达水平均上升;(5)在培养基中添加100 ng/m L CXCR4中和抗体,KLF4的m RNA及蛋白表达水平均上升;FOXA2的m RNA及蛋白表达水平均下降,与MIF组表达趋势相反。综上所述,人胚胎干细胞自分泌的MIF是其存活所必需的;培养基中额外添加MIF并不能促进人胚胎干细胞增殖,但可以使自我更新因子KLF4表达下降,转录因子FOXA2表达上升,为下一步探明MIF对人胚胎干细胞分化的影响及机制提供了线索,MIF-CXCR4轴在其中起到一定的调控作用。

自体造血干细胞移植联合胚胎冷冻技术的淋巴瘤患者临床叙事分析

本研究运用叙事护理的原理,对一例行自体造血干细胞移植联合胚胎冷冻技术的淋巴瘤患者进行深入访谈,运用拉波夫叙事分析模式从个案研究切入,通过点题、指向、进展、评议、结局和回应六个部分详细地进行叙事护理,探索该类患者的心理、信念与生活状态,提示了临床护理人员应重视患者的故事叙述和情感体验,以提高患者的治疗依从性和生活质量。

小鼠胚胎脊髓神经干细胞提取与传代培养:3种常用消化酶优劣的比较与分析

背景:在神经干细胞的研究及应用过程中,细胞的培养与传代是关键环节,直接影响到细胞的质量和实验结果。寻找一种最适宜的消化酶类,对维持胚胎小鼠脊髓神经干细胞的生物学特性并增强其传代效率,具有重要意义。目的:探讨胚胎小鼠脊髓神经干细胞传代最适合的消化酶。方法:显微解剖分离提取孕14 d C57BL/6胎鼠脊髓组织,用含有表皮生长因子、碱性成纤维生长因子及B27的DMEM/F12无血清培养基培养,待成球后进行Nestin与Sox2免疫荧光鉴定。神经干细胞传代培养过程中分别采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶以及TrypLE^(TM)Express酶消化结合吹打法制成单细胞悬液,观察细胞分散效果及成球情况,取第3代细胞进行碘化丙啶染色观察细胞死亡情况,通过计数细胞总数观察细胞增殖情况,通过免疫荧光染色、Western blot和RT-PCR检测Olig2、Tuj1、GFAP、NeuN蛋白和mRNA表达鉴定细胞分化情况。结果与结论:脊髓组织细胞培养72 h后可形成悬浮生长的神经球,5-7 d后即可传代。与胰蛋白酶、木瓜蛋白酶相比,TrypLE^(TM)Express酶结合吹打法进行传代的细胞分散率高,活性较好,分化为NeuN与Tuj1的阳性神经元细胞较多。此研究优化了神经干细胞的培养和传代过程,为进一步开展脊髓疾病的干细胞移植治疗研究奠定了基础。

小鼠胚胎睾丸Leydig细胞培养、纯化及其功能研究

目的:探讨小鼠胚胎睾丸Leyd ig细胞体外培养、鉴定、纯化的方法,并进行形态学观察、分泌睾酮能力等生物学特性检测。方法:选择胎龄16 d的胎鼠睾丸,0.03%胶原酶Ⅰ消化,3β-羟基类固醇脱氢酶(HSD)染色鉴定及纯度测定,锥虫蓝染色检测细胞活率。放免法测定Leyd ig细胞不同培养时间及密度下分泌睾酮的水平。结果:Leyd ig细胞培养前和培养72 h后纯度分别为(45.10±1.66)%和(81.17±2.32)%;培养液中可检测到睾酮,睾酮水平与Leyd ig细胞数、培养时间相关,单个Leyd ig细胞睾酮分泌能力逐日下降。结论:该法分离的胚胎Leyd ig细胞纯度较高,生长性好,保持增殖和分泌睾酮的生物学特性,可应用于相关的研究。

邻苯二甲酸二乙基己酯对小鼠胚胎Leydig细胞毒性作用研究

目的探讨邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)对小鼠胚胎睾丸问质细胞(Leydig细胞)的毒性作用。方法小鼠胚胎Leydig细胞体外原代培养。观察DEHP导致的Leydig细胞形态及超微结构改变,用MTT法和Annexin-V／PI流式细胞术分别检测DEHP在培养基内终浓度为25、510、100和200mg／L时对Leydig细胞活力影响及毒性作用。结果Leydig细胞活力随着DEHP浓度增加和作用时间延长而明显下降。Annexin-V／PI流式细胞术检测提示:死亡细胞比例随DEHP浓度升高和作用时间延长而显著增加,同时细胞增殖速度变慢,甚至增殖停止,伴随一系列细胞形态学及超微结构改变,呈剂量、时间依赖关系。结论DEHP能降低Leydig细胞的活性并促进其死亡,有明显细胞毒性。

邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯对原代培养小鼠胚胎睾丸Leydig细胞功能影响研究

目的探讨邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[D i(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]对体外培养的小鼠胚胎睾丸间质细胞(Leyd ig细胞)3β-羟基类固醇脱氢酶(3-βHSD)活性及睾酮合成的影响。方法小鼠胚胎Leyd ig细胞原代培养。DE-HP染毒剂量分别为25、50、100、200 mg/L,通过检测睾酮合成关键酶3β-HSD活性、放免法测定培养液中睾酮浓度,研究DEHP对Leyd ig细胞功能影响。结果小鼠胚胎Leyd ig细胞分离培养后,纯度和存活率分别达(81.17±2.32)%、(80.88±2.80)%。DEHP(25 mg/L)处理12 h,或DEHP(50 mg/L)处理6 h后,实验组与对照组比较3β-HSD酶活性明显降低(P<0.05),随着时间延长和药物浓度增加差异更显著(P<0.01)。DEHP50、100 mg/L实验组,在12、24 h的睾酮水平明显低于对照组(P<0.05)或(P<0.01),存在时间-效应关系;DEHP 200 mg/L实验组在6、12、24 h与对照组比较均有非常显著差异(P<0.01),并可观察到Leyd ig细胞明显的形态学改变。结论DEHP能影响原代培养小鼠胚胎Leyd ig细胞3β-羟基类固醇脱氢酶活性,并抑制睾酮合成,存在时间-效应和剂量-效应关系。

邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯对胚胎及新生小鼠睾丸Leydig细胞INSL3 mRNA表达的影响

目的：通过体内体外实验探讨邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）对胚胎及新生小鼠睾丸Leydig细胞INSL3 mRNA表达的影响．方法：DEHP50，100，200mg／L分别作用于原代培养的小鼠胚胎Leydig细胞，应用RT—PCR和原位分子杂交技术检测DEHP对Leydig细胞INSL3 mRNA表达的影响；DEHP分别以低、中、高三组剂量（100，200和500mg／kg·d）灌胃作用于GD（Gestationday）12～PND（Postnatal day）3孕鼠，RT—PCR检测新生小鼠睾丸INSL3 mRNA表达的相对强度．结果：DEHP改变原代培养的小鼠胚胎Leydig细胞和新生小鼠睾丸的形态结构；各实验组包括原代Leydig细胞及不同时间点的新生鼠睾丸INSL3 mRNA表达水平、表达相对强度均明显低于对照组（P〈0．05，或P〈0．01）．结论：DEHP下调小鼠睾丸Leydig细胞INSL3 mRNA的表达，可能是影响引带发育导致隐睾的机制之一．

邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯诱导小鼠胚胎Leydig细胞凋亡的体外实验研究

目的研究邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯EDi（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP]对小鼠胚胎睾丸Leydig细胞凋亡诱导作用。方法DEHP50、100、200ug／ml分别作用于体外培养、纯化的胎龄16d（GD16）小鼠胚胎睾丸Leydig细胞。光镜、电镜观察Leydig细胞形态和超微结构变化，DNA末端原位标记染色法（TUNEL法）和Annexin-V／PI双染法流式细胞仪分别检测kydig细胞凋亡指数、凋亡细胞比例。结果DEHP处理组透射电镜可见凋亡典型的形态学变化，凋亡指数及凋亡细胞比例与对照组比较有显著或非常显著性差异（P〈0．05或P〈0．01）。结论DEHP能诱导小鼠胚胎睾丸Leydig细胞凋亡。

基质硬度通过黏附蛋白调节胚胎干细胞的力学感知和分化命运

目的力学响应是理解基质硬度调节胚胎干细胞(ESCs)肝向分化的关键因素,研究分化初始阶段干细胞通过细胞黏附感知和力学信号传递尤为重要。本研究聚焦于不同硬度的基质条件细胞-细胞和细胞基质黏附对ESCs向定型内胚层(DE)分化的协同调控,并探究了细胞黏附蛋白和关键力信号转导通路。方法使用聚丙烯酰胺水凝胶制备3种不同硬度的基质,建立基于不同硬度的基质条件ESCs(H1细胞系)原位定向分化实验体系。利用牵引力显微镜、组学分析、Ch IPseq、q PCR、免疫荧光及Simple WES等方法,阐明不同硬度基质条件下ESCs向DE细胞分化的力学-生物耦合规律和机理。结果基质硬度是决定ESCs分化命运的关键。较硬基质上,ESCs的分化启动较快,DE细胞标志物表达随分化进度增加,其表达水平与基质硬度呈正相关;较高硬度促进了ESCs在克隆边缘的分化,位于克隆边缘的细胞比位于克隆内部的细胞高表达DE细胞标志物。不同硬度的基质上ESCs向DE细胞分化时,负责细胞-基质黏附的β1 integrin表达增加而细胞间E-cadherin表达减少,且呈现硬度依赖性。激活E-cadherin或阻断β1 integrin均可减少YAP入核使细胞的分化能力降低。结论基质硬度能够影响干细胞分化命运,硬基底更利于ESCs的DE向分化,该过程涉及细胞-细胞间及细胞-基质间黏附蛋白的相互作用进而调节胞内YAP的核移位。

脂滴功能及其与卵母细胞成熟和胚胎发育的关系研究进展

脂滴不仅是真核细胞内贮存甘油三酯和胆固醇酯等中性脂质的重要细胞器,也是细胞代谢和细胞器质量控制的中心调控者,参与细胞能量代谢、类固醇激素合成、内质网应激、线粒体功能以及生物膜结构形成等过程的调控。目前认为脂滴合成于内质网,并以出芽的方式进入细胞质。脂滴是呈动态分布的细胞器,其数量、大小以及分布受细胞获得营养物质和代谢状态影响。众所周知,哺乳动物卵母细胞含有脂滴,且卵母细胞中含有足够数量的脂滴与卵母细胞成熟和早期胚胎发育密切相关。更重要的是,最近的研究表明,脂滴在胚胎附植着床过程中发挥了至关重要的作用,即使卵母细胞中脂滴含量较低的哺乳动物,维持适量的脂滴对早期胚胎发育也很重要。因此,本文综述了脂滴的合成与分布,分析了脂滴的主要功能,重点阐述脂滴在动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育期间的关键作用,并讨论脂滴卵母细胞和胚胎内脂滴含量与胚胎滞育持续时间的关系,以期为通过调控脂滴代谢而增强卵母细胞质量和胚胎发育能力,进而提高动物繁殖性能提供理论基础。

二甲磺酸乙烷对大鼠睾丸胚胎型Leydig细胞的作用

目的:评价细胞毒性药物二甲磺酸乙烷对新生大鼠睾丸胚胎型Leydig细胞的作用效应及安全使用剂量。方法:选取出生后3 d的雄性SD幼鼠共40只,分为对照组(二甲基亚砜溶剂组)、二甲磺酸乙烷75 mg/kg组、二甲磺酸乙烷100 mg/kg组和二甲磺酸乙烷125 mg/kg组,每组10只。予腹腔内注射不同实验剂量的二甲磺酸乙烷,注射后4 d分别处死幼鼠;测量动物体重及睾丸重量,放射免疫法检测血清中睾酮水平,睾丸组织冰冻切片行3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)染色,实时荧光定量PCR技术及Western blot技术检测睾丸组织中Leydig细胞相关特异基因及蛋白的表达水平。结果:药物注射后4 d,与对照组相比较,在血清睾酮水平方面[(0.542±0.117)μg/L,(0.124±0.021)μg/L,(0.113±0.015)μg/L,vs.(0.834±0.172)μg/L,P<0.05],75 mg/kg剂量组轻度下降,而100 mg/kg剂量组和125 mg/kg剂量组则明显降低;睾丸组织3β-HSD染色显示:75 mg/kg剂量组仍可见少量的3β-HSD染色呈阳性的胚胎型Leydig细胞(fetal leydig cell,FLC),100 mg/kg剂量组和125 mg/kg剂量组无3β-HSD染色呈阳性的FLC存在,但125 mg/kg剂量组睾丸曲细精管细胞排列严重紊乱;RT-PCR及Western blot检测显示:100 mg/kg剂量组睾丸组织Hsd3b1和Cyp17a1的mRNA表达水平及其相应蛋白表达水平明显降低(P<0.001)。结论:二甲磺酸乙烷能够特异性地破坏新生雄性SD大鼠睾丸组织中的胚胎型Leydig细胞,腹腔注射100 mg/kg二甲磺酸乙烷可建立起稳定、可靠的大鼠睾丸去胚胎型Leydig细胞模型。

卵母细胞玻璃化冷冻与胚胎玻璃化冷冻移植周期的临床妊娠及围产期结局比较

目的:比较卵母细胞玻璃化冷冻与胚胎玻璃化冷冻移植周期临床妊娠及围产期结局的差异。方法:回顾性分析2011年1月至2021年6月在郑州大学第三附属医院生殖医学科接受卵裂期胚胎移植患者的临床资料。选取玻璃化冷冻卵母细胞解冻行卵胞浆内单精子注射(ICSI)后新鲜卵裂期胚胎移植周期77个(卵母细胞冷冻组),和同期利用倾向性评分1∶4匹配后得到的新鲜卵母细胞行ICSI后卵裂期胚胎玻璃化冷冻复苏移植周期293个(胚胎冷冻组)。比较2组移植后临床妊娠及围产期结局。结果:卵母细胞冷冻组与胚胎冷冻组临床妊娠率(50.65%vs 46.76%)、早期流产率(12.82%vs 11.68%)及活产率(37.66%vs 39.72%)差异均无统计学意义(P均>0.05),剖宫产率(79.31%vs 83.33%)、胎膜早破发生率(10.34%vs 9.65%)及妊娠期高血压疾病发生率(10.34%vs 9.65%)等差异均无统计学意义(P均>0.05),单双胎分娩早产率(18.75%vs 6.41%,46.15%vs 41.67%)、出生体重[(3449.38±485.39)g vs(3424.74±511.94)g,(2515.20±539.46)g vs(2597.08±523.44)g]差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论:卵母细胞玻璃化冷冻与胚胎玻璃化冷冻移植周期临床妊娠和围产期结局相似,是一种相对安全的辅助生殖技术。

多囊卵巢综合征患者程序性细胞死亡因子4表达及睾酮与胚胎质量相关性研究

目的:探讨控制性超促排卵(COH)中多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢颗粒细胞中程序性细胞死亡因子4(PDCD4)表达及睾酮的临床意义。方法:选取于枣庄市妇幼保健院生殖遗传中心行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕的COH周期PCOS患者(28例)和非PCOS患者(40例),经阴道超声引导下取卵后,收集卵泡液及卵丘周围颗粒细胞,提取RNA,逆转录后应用实时定量PCR检测PDCD4表达情况,分析PDCD4表达及睾酮与胚胎质量的相关性。结果:PCOS组和非PCOS组患者的年龄、不孕年限、体质量指数(BMI)、基础FSH、E_(2)、PRL和睾酮比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。两组的正常受精率、卵裂率、优胚率、可用胚率和卵母细胞利用率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。PCOS组的PDCD4表达略高于非PCOS组,但差异无统计学意义(P>0.05)。低可用胚组的PDCD4表达高于正常可用胚组(P=0.04)。高睾酮水平组的正常受精率(P=0.00007)和卵母细胞利用率(P=0.038)低于低睾酮水平组。结论:COH中卵巢颗粒细胞PDCD4表达增高与低可用胚率相关,睾酮水平与受精率和卵母细胞利用率密切相关,睾酮水平升高,受精率和卵母细胞利用率降低。

β-谷甾醇对猪卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响

旨在探索一种自然植物提取的抗氧化分子——β-谷甾醇(β-sitosterol,SITO)对猪卵母细胞体外成熟效率和早期胚胎体外发育质量的影响。本研究以在猪卵母细胞体外成熟培养基中添加不同浓度SITO为试验组,不添加SITO(含0.16%DMSO)的培养基为对照组,对屠宰场所得猪卵巢中收集到的卵母细胞进行体外培养,试验组浓度分别为10、20、40μmol·L~(-1),不同浓度各重复3次,每组培养卵母细胞150~200枚。培养46 h后,对卵母细胞成熟率进行统计,并收集成熟卵母细胞进行活性氧、细胞凋亡、线粒体膜电位染色以及相关基因的实时荧光定量PCR;对成熟卵母细胞进行孤雌激活,2 d后统计卵裂率,7 d后统计囊胚率,并统计囊胚细胞总数。结果发现,20μmol·L~(-1)SITO处理显著提高了猪卵母细胞的体外成熟率,且促进了孤雌激活后囊胚的形成并增加了囊胚细胞数,降低了卵母细胞中ROS含量,提高了抗氧化应激基因SOD和CAT的表达;同时,SITO降低卵母细胞的凋亡水平,增加抗凋亡基因BCL-2的表达,降低促凋亡基因Caspase 3和BAX的表达。此外,SITO可增强线粒体膜电位(ΔΨm),增加TFAM基因的表达。综上所述,本研究结果表明,在猪卵母细胞体外成熟培养基中添加20μmol·L^(-1)SITO能够显著促进猪卵母细胞的体外成熟率、提高胚胎的体外发育能力和胚胎质量。

Wnt信号通路与自身免疫调节因子共同参与胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化

背景:自身免疫调节因子(autoimmune regulator gene,Aire)及Wnt信号通路在小鼠胚胎干细胞多能性的维持及分化中都发挥着重要作用,但Wnt信号与Aire是否参与了小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化尚未可知。目的:探讨Wnt信号通路和自身免疫调节因子与胚胎干细胞分化的关系。方法:采用两步分化方法定向诱导小鼠胚胎干细胞分化为内胚层再分化为胸腺上皮祖细胞,然后用Aire shRNA慢病毒感染小鼠胚胎干细胞,嘌呤霉素筛选单克隆稳定株,再采用两步分化方法进行诱导分化,分别于定向诱导分化第0,3,10天,采用细胞免疫荧光、流式细胞术、Western blot、Real-Time qPCR检测相关基因及蛋白的表达变化。结果与结论:①定向诱导分化第0天,免疫荧光染色显示SSEA1、OCT4表达呈阳性;②定向诱导分化第3天,免疫荧光染色显示SOX17、FOXA2表达呈双阳性;③定向诱导分化第10天,流式细胞术结果显示EPCAM1、K5、K8表达呈阳性;④与未分化的小鼠胚胎干细胞相比,诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达升高,Aire蛋白表达降低;⑤与未分化的小鼠胚胎干细胞相比,诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β及Aire mRNA表达升高;⑥与正常培养的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞相比,敲低Aire基因的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达水平降低。综上所述,Wnt信号通路和Aire共同参与了小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为小鼠胸腺上皮祖细胞的过程。

齐墩果酸对衰老睾丸间质细胞(Leydig细胞)的作用以及EGF/EGFR表达的影响

目的观察齐墩果酸对衰老睾丸间质细胞(Leydig细胞)的影响以及对表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的调控作用。方法原代培养大鼠Leydig细胞,将其分为正常组、模型组和齐墩果酸组。模型组和齐墩果酸组采用H2O2(300μmol/L)和FeSO4(100μmol/L)每日处理2 h,持续4 d,造细胞衰老模型。之后正常组和模型组在DMEM/F12培养液培养3 d,齐墩果酸组在齐墩果酸终浓度为20μmol/L的DMEM/F12培养液中培养3 d。ELISA法检测细胞睾酮分泌情况;BrdU免疫荧光染色检测细胞增殖率;DAPI荧光染色检测细胞凋亡率;qRT-PCR检测细胞EGF和EGFR mRNA表达。结果模型组睾酮分泌水平、细胞增殖率、EGF和EGFR mRNA表达水平均低于正常组(P<0.05),凋亡率均高于正常组(P<0.05)。齐墩果酸可抑制Leydig细胞凋亡(P<0.05),并提高细胞睾酮分泌水平、细胞增殖水平、EGF和EGFR mRNA表达水平(P<0.05)。结论齐墩果酸可促进衰老Leydig细胞睾酮分泌及细胞增殖、抑制细胞凋亡,其机制与调控EGF和EGFR mRNA表达有关。

双同源盒诱导小鼠胚胎干细胞向胚外内胚层分化的机制研究

目的·探索双同源盒(double homeobox,DUX)蛋白对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)向胚外内胚层(extraembryonic endoderm,XEN)分化潜能的影响及可能的作用机制。方法·使用慢病毒体系在mESC中构建过表达DUX细胞系,利用流式细胞术检测DUX过表达前后2细胞样细胞(2-cell-like cell,2CLC)的比例,并使用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测2细胞期特异性基因,如内源性Dux、锌指和SCAN结构域的蛋白质4c(zinc finger and SCAN domain containing 4c,Zscan4c)、锌指蛋白352(zinc finger protein 352,Zfp352)和鼠内源性反转录病毒-聚合酶(murine endogenous retrovirus-L polymerase,MERVL-pol)的表达。RT-qPCR检测过表达DUX的mESC多能性因子[nanog homeobox(Nanog)、kruppel-like transcription factor 4(Klf4)、性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2,Sox2)、八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)]和自然分化状态下各胚层标志性基因[内胚层(endodermal):GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4,Gata4)、Gata6、Sox17;外胚层(ectodermal):微Ⅲ型β微管蛋白3(tubulin beta 3 classⅢ,Tubb3)、巢蛋白(Nestin);中胚层(mesodermal):心脏和神经嵴衍生物表达转录本1(heart and neural crest derivatives expressed 1,Hand1)、肌源性分化蛋白1(myogenic differentiation 1,Myod1)、激酶插入结构域受体(kinase insert domain protein receptor,Flk1)]的表达。挖掘公共转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)数据,通过分析胚外内胚层标志基因的表达水平,明确DUX对mESC向胚外内胚层分化的影响;通过对差异基因的功能及通路进行基因本体论(Gene Ontology,GO)富集分析、京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析和基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA),找出DUX作用的信号通路;深入分析已有的染色质免疫共沉淀技术结合二代测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)数据,探究DUX的潜在靶基因。结果·2CLC比例升高和2细胞期标志基因表达上调,证明已成功构建过表达DUX细胞系。分子生物学实验显示过表达DUX后可有效维持mESC的多能性,与公共RNA-seq数据分析结果一致;差异基因分析发现,内胚层基因出现特异性上调;诱导mESC自然分化后,RT-qPCR检测实验表明XEN标志基因(Gata4、Gata6、Sox17)的mRNA表达出现显著上调(P<0.001),而中胚层、外胚层基因没有特异性变化。GSEA结果提示DUX可能激活了视黄醇代谢信号通路,ChIP-seq数据解析进一步揭示在DUX结合的peaks中存在已知的视黄酸受体motif,可激活下游与XEN发育相关的靶基因。结论·DUX与视黄酸信号通路密切关联,预示其激活了视黄酸信号通路,促进mESC倾向XEN分化。

千金藤素对牛体外卵母细胞和早期胚胎抗凋亡能力的影响

【目的】探究千金藤素(Ceph)对牛卵母细胞及早期胚胎抗凋亡能力的影响,为提高牛体外胚胎生产效率提供参考,同时为Ceph抗癌过程中的药理作用提供新的数据。【方法】将牛卵母细胞分别在含不同浓度(0、10、100、500、1000μmol/L)Ceph的体外成熟培养液中培养,观测卵母细胞成熟率及受精后的早期胚胎发育,确定Ceph的最适浓度,并对牛卵母细胞组织蛋白酶B(CB)活性、细胞自噬相关蛋白LC3水平、凋亡相关基因Survivin和Caspase-3 mRNA表达水平及囊胚细胞凋亡率进行检测。【结果】经500μmol/L Ceph处理的牛卵母细胞成熟率及早期胚胎分裂率、囊胚率均显著高于其他组(P<0.05)。添加Ceph显著降低了牛卵母细胞CB活性和LC3水平(P<0.05),显著提高了抗凋亡相关基因Survivin mRNA表达水平(P<0.05),显著降低了促凋亡相关基因Caspase-3 mRNA表达水平及囊胚细胞凋亡率(P<0.05)。【结论】在体外胚胎生产过程中添加Ceph能够通过调控凋亡相关基因Survivin和Caspase-3的表达影响CB和LC3水平,提升牛卵母细胞抗凋亡能力和体外胚胎生产效率。

利用CRISPR/Cas9技术构建Quaking敲除的小鼠胚胎成纤维细胞株

【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,并检测Quaking基因对NIH3T3细胞增殖能力的影响。【方法】首先,利用在线网站设计两条靶向作用于Quaking外显子的sgRNA,成功构建了两个分别靶向Quaking基因第1、第2外显子的CRISPR/Cas9重组慢病毒质粒。将构建的Quaking基因CRISPR/Cas9重组慢病毒载体和pcDNA3.1-Quaking过表达质粒共转染至HEK293T细胞中,通过Western blot实验检测Quaking蛋白的敲除效率。其次,将筛选得到的敲除效率高的重组慢病毒质粒(LentiCRISPRv2-sgRNA1)与辅助包装质粒共转染入HEK293T细胞进行慢病毒包装,慢病毒转导NIH3T3细胞后,利用嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞株。最后,通过Western blot及免疫荧光染色鉴定敲除效果。【结果】发现Quaking蛋白在该细胞株中不表达,并测序证实了发生片段敲除。CCK8检测发现,Quaking基因敲除显著抑制了NIH3T3细胞的增殖能力。【结论】本研究首次通过CRISPR/Cas9技术成功构建了小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,为后续研究Quaking基因在小鼠生理功能调节中的作用机制提供了体外模型基础。