DEHP对雄性仔鼠胚胎Leydig细胞雄激素合成的影响

目的:研究邻苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)对雄性仔鼠胚胎Leydig细胞(FLC)雄激素合成的影响。方法:DEHP分别以低、中、高3组剂量(10、100、750 mg.kg-1.d-1)灌胃作用于怀孕12 d到产后1 d(GD12-PND1)的SD母鼠,观察DEHP对雄仔鼠血清睾酮(T)水平、睾丸FLC形态结构、睾丸FLC的类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)及胰岛素样生长因子1(IGF-I)mRNA的相对表达量(ΔΔCT法)。结果:低剂量组血清T水平显著高于对照组(P<0.01);而中、高剂量组血清T水平显著低于对照组(P<0.05)。光镜下低剂量组可见间质细胞聚集呈簇分布,中剂量组与高剂量组均可见间质细胞呈瘤样增生。电镜示低剂量组间质细胞椭圆形、长梭形,脂质颗粒减少,线粒体、滑面内质网丰富。中、高剂量组间质细胞呈梭形或椭圆形,大小不一,核大、圆,胞浆丰富,细胞聚集一起,胞质内可见丰富的脂质颗粒,脂质颗粒染色深,滑面内质网及线粒体扩张。高剂量组睾丸FLC的StAR mRNA的相对含量显著低于对照组(P<0.01)。低剂量组睾丸FLC的IGF-Ⅰ mRNA相对含量显著高于对照组(P<0.01)。结论:DEHP对新生雄性仔鼠睾丸FLC有毒性作用,可影响雄性仔鼠睾丸FLC的形态学及其生成类固醇的能力。其可能机制是低剂量DEHP宫内暴露后,促进睾丸FLC的IGF-ⅠmRNA表达从而引起血清睾酮升高,而高剂量DEHP可能通过抑制睾丸FLC StAR mRNA表达从而降低血清睾酮水平。

脂滴功能及其与卵母细胞成熟和胚胎发育的关系研究进展

脂滴不仅是真核细胞内贮存甘油三酯和胆固醇酯等中性脂质的重要细胞器,也是细胞代谢和细胞器质量控制的中心调控者,参与细胞能量代谢、类固醇激素合成、内质网应激、线粒体功能以及生物膜结构形成等过程的调控。目前认为脂滴合成于内质网,并以出芽的方式进入细胞质。脂滴是呈动态分布的细胞器,其数量、大小以及分布受细胞获得营养物质和代谢状态影响。众所周知,哺乳动物卵母细胞含有脂滴,且卵母细胞中含有足够数量的脂滴与卵母细胞成熟和早期胚胎发育密切相关。更重要的是,最近的研究表明,脂滴在胚胎附植着床过程中发挥了至关重要的作用,即使卵母细胞中脂滴含量较低的哺乳动物,维持适量的脂滴对早期胚胎发育也很重要。因此,本文综述了脂滴的合成与分布,分析了脂滴的主要功能,重点阐述脂滴在动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育期间的关键作用,并讨论脂滴卵母细胞和胚胎内脂滴含量与胚胎滞育持续时间的关系,以期为通过调控脂滴代谢而增强卵母细胞质量和胚胎发育能力,进而提高动物繁殖性能提供理论基础。

卵母细胞玻璃化冷冻与胚胎玻璃化冷冻移植周期的临床妊娠及围产期结局比较

目的:比较卵母细胞玻璃化冷冻与胚胎玻璃化冷冻移植周期临床妊娠及围产期结局的差异。方法:回顾性分析2011年1月至2021年6月在郑州大学第三附属医院生殖医学科接受卵裂期胚胎移植患者的临床资料。选取玻璃化冷冻卵母细胞解冻行卵胞浆内单精子注射(ICSI)后新鲜卵裂期胚胎移植周期77个(卵母细胞冷冻组),和同期利用倾向性评分1∶4匹配后得到的新鲜卵母细胞行ICSI后卵裂期胚胎玻璃化冷冻复苏移植周期293个(胚胎冷冻组)。比较2组移植后临床妊娠及围产期结局。结果:卵母细胞冷冻组与胚胎冷冻组临床妊娠率(50.65%vs 46.76%)、早期流产率(12.82%vs 11.68%)及活产率(37.66%vs 39.72%)差异均无统计学意义(P均>0.05),剖宫产率(79.31%vs 83.33%)、胎膜早破发生率(10.34%vs 9.65%)及妊娠期高血压疾病发生率(10.34%vs 9.65%)等差异均无统计学意义(P均>0.05),单双胎分娩早产率(18.75%vs 6.41%,46.15%vs 41.67%)、出生体重[(3449.38±485.39)g vs(3424.74±511.94)g,(2515.20±539.46)g vs(2597.08±523.44)g]差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论:卵母细胞玻璃化冷冻与胚胎玻璃化冷冻移植周期临床妊娠和围产期结局相似,是一种相对安全的辅助生殖技术。

多囊卵巢综合征患者程序性细胞死亡因子4表达及睾酮与胚胎质量相关性研究

目的:探讨控制性超促排卵(COH)中多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢颗粒细胞中程序性细胞死亡因子4(PDCD4)表达及睾酮的临床意义。方法:选取于枣庄市妇幼保健院生殖遗传中心行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕的COH周期PCOS患者(28例)和非PCOS患者(40例),经阴道超声引导下取卵后,收集卵泡液及卵丘周围颗粒细胞,提取RNA,逆转录后应用实时定量PCR检测PDCD4表达情况,分析PDCD4表达及睾酮与胚胎质量的相关性。结果:PCOS组和非PCOS组患者的年龄、不孕年限、体质量指数(BMI)、基础FSH、E_(2)、PRL和睾酮比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。两组的正常受精率、卵裂率、优胚率、可用胚率和卵母细胞利用率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。PCOS组的PDCD4表达略高于非PCOS组,但差异无统计学意义(P>0.05)。低可用胚组的PDCD4表达高于正常可用胚组(P=0.04)。高睾酮水平组的正常受精率(P=0.00007)和卵母细胞利用率(P=0.038)低于低睾酮水平组。结论:COH中卵巢颗粒细胞PDCD4表达增高与低可用胚率相关,睾酮水平与受精率和卵母细胞利用率密切相关,睾酮水平升高,受精率和卵母细胞利用率降低。

Wnt信号通路与自身免疫调节因子共同参与胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化

背景:自身免疫调节因子(autoimmune regulator gene,Aire)及Wnt信号通路在小鼠胚胎干细胞多能性的维持及分化中都发挥着重要作用,但Wnt信号与Aire是否参与了小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化尚未可知。目的:探讨Wnt信号通路和自身免疫调节因子与胚胎干细胞分化的关系。方法:采用两步分化方法定向诱导小鼠胚胎干细胞分化为内胚层再分化为胸腺上皮祖细胞,然后用Aire shRNA慢病毒感染小鼠胚胎干细胞,嘌呤霉素筛选单克隆稳定株,再采用两步分化方法进行诱导分化,分别于定向诱导分化第0,3,10天,采用细胞免疫荧光、流式细胞术、Western blot、Real-Time qPCR检测相关基因及蛋白的表达变化。结果与结论:①定向诱导分化第0天,免疫荧光染色显示SSEA1、OCT4表达呈阳性;②定向诱导分化第3天,免疫荧光染色显示SOX17、FOXA2表达呈双阳性;③定向诱导分化第10天,流式细胞术结果显示EPCAM1、K5、K8表达呈阳性;④与未分化的小鼠胚胎干细胞相比,诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达升高,Aire蛋白表达降低;⑤与未分化的小鼠胚胎干细胞相比,诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β及Aire mRNA表达升高;⑥与正常培养的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞相比,敲低Aire基因的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达水平降低。综上所述,Wnt信号通路和Aire共同参与了小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为小鼠胸腺上皮祖细胞的过程。

利用CRISPR/Cas9技术构建Quaking敲除的小鼠胚胎成纤维细胞株

【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,并检测Quaking基因对NIH3T3细胞增殖能力的影响。【方法】首先,利用在线网站设计两条靶向作用于Quaking外显子的sgRNA,成功构建了两个分别靶向Quaking基因第1、第2外显子的CRISPR/Cas9重组慢病毒质粒。将构建的Quaking基因CRISPR/Cas9重组慢病毒载体和pcDNA3.1-Quaking过表达质粒共转染至HEK293T细胞中,通过Western blot实验检测Quaking蛋白的敲除效率。其次,将筛选得到的敲除效率高的重组慢病毒质粒(LentiCRISPRv2-sgRNA1)与辅助包装质粒共转染入HEK293T细胞进行慢病毒包装,慢病毒转导NIH3T3细胞后,利用嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞株。最后,通过Western blot及免疫荧光染色鉴定敲除效果。【结果】发现Quaking蛋白在该细胞株中不表达,并测序证实了发生片段敲除。CCK8检测发现,Quaking基因敲除显著抑制了NIH3T3细胞的增殖能力。【结论】本研究首次通过CRISPR/Cas9技术成功构建了小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,为后续研究Quaking基因在小鼠生理功能调节中的作用机制提供了体外模型基础。

转录因子CmHAT1调控板栗体细胞胚胎发育的功能研究

【目的】体细胞胚胎发生是板栗有效的离体再生方法。然而,目前板栗体细胞胚胎由于发育慢、再生效率低等问题,制约了板栗体细胞胚胎的再生进程,难以在后续基因功能验证和新种质创制过程中发挥作用。本文旨在通过研究HDZIPⅡ基因家族成员CmHAT1在板栗体细胞胚胎发育过程中的作用,进一步加速板栗体细胞胚胎的发育进程。【方法】利用生物信息学的方法鉴定了板栗HD-ZIPⅡ基因家族成员,并分析了该家族成员在板栗体细胞胚胎不同发育时期的表达情况,筛选调控体细胞胚胎发育的关键候选基因CmHAT。进一步通过烟草亚细胞定位实验、荧光定量和遗传转化方法,研究关键基因CmHAT的亚细胞定位和基因功能。【结果】(1)板栗HD-ZIPⅡ基因家族有7个成员,大部分CmHD-ZIPⅡ成员在板栗体细胞胚胎发育时期均有表达,其中CmHAT1在愈伤组织时期表达较低,在球形胚时期表达上调,心形胚时期表达最高,而在子叶形胚时期表达下调,因此筛选出CmHAT1作为调控体细胞胚胎发育的关键候选基因。(2)CmHAT1定位在细胞核;与转化空载体相比,过表达CmHAT1使体细胞胚胎数量显著减少,体细胞胚胎体积显著增大,而沉默CmHAT1后体细胞胚胎的表型没有显著性差异。【结论】在同等质量的愈伤诱导体细胞胚胎的情况下,过表达CmHAT1后可以调控板栗体细胞胚胎的数量和体积,影响体细胞胚胎的发育。本研究为进一步优化板栗再生体系和遗传转化体系奠定了基础,为利用体细胞胚胎系统创制板栗新种质提供了科学依据。

β-谷甾醇对猪卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响

旨在探索一种自然植物提取的抗氧化分子——β-谷甾醇(β-sitosterol,SITO)对猪卵母细胞体外成熟效率和早期胚胎体外发育质量的影响。本研究以在猪卵母细胞体外成熟培养基中添加不同浓度SITO为试验组,不添加SITO(含0.16%DMSO)的培养基为对照组,对屠宰场所得猪卵巢中收集到的卵母细胞进行体外培养,试验组浓度分别为10、20、40μmol·L~(-1),不同浓度各重复3次,每组培养卵母细胞150~200枚。培养46 h后,对卵母细胞成熟率进行统计,并收集成熟卵母细胞进行活性氧、细胞凋亡、线粒体膜电位染色以及相关基因的实时荧光定量PCR;对成熟卵母细胞进行孤雌激活,2 d后统计卵裂率,7 d后统计囊胚率,并统计囊胚细胞总数。结果发现,20μmol·L~(-1)SITO处理显著提高了猪卵母细胞的体外成熟率,且促进了孤雌激活后囊胚的形成并增加了囊胚细胞数,降低了卵母细胞中ROS含量,提高了抗氧化应激基因SOD和CAT的表达;同时,SITO降低卵母细胞的凋亡水平,增加抗凋亡基因BCL-2的表达,降低促凋亡基因Caspase 3和BAX的表达。此外,SITO可增强线粒体膜电位(ΔΨm),增加TFAM基因的表达。综上所述,本研究结果表明,在猪卵母细胞体外成熟培养基中添加20μmol·L^(-1)SITO能够显著促进猪卵母细胞的体外成熟率、提高胚胎的体外发育能力和胚胎质量。

巨噬细胞迁移抑制因子对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的影响

背景:巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一种具有多效性作用的细胞因子,可以在不同类型干细胞中自分泌并且能调控细胞的增殖、分化和迁移。课题组前期研究证实人胚胎干细胞自分泌MIF,且在培养液中浓度基本固定。然而,MIF是否参与了人胚胎干细胞的存活、增殖和分化尚不清楚。目的:探究MIF对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的作用。方法:(1)培养人胚胎干细胞H9,CCK-8法检测并绘制细胞生长曲线,采用酶联免疫吸附法定量检测培养基中MIF水平。(2)为了明确外源性MIF对人胚胎干细胞存活、增殖的影响,分为:对照组,细胞在干细胞培养基中正常培养;外源性MIF组,在干细胞培养基中分别添加30,100,300 ng/m L的MIF;MIF抑制剂ISO-1组,在干细胞培养基中分别添加2,7,21μmol/L的ISO-1;MIF+ISO-1组,在不同浓度ISO-1组中分别添加100 ng/m L MIF,采用CCK-8法检测上述各组细胞活力。(3)为进一步阐明MIF基因对人胚胎干细胞存活、增殖的影响,采用CRISPRCas9技术构建MIF敲除的H9细胞系,观察建系情况。(4)为了明确高浓度MIF对人胚胎干细胞初步分化是否有影响,在培养基中分别添加100 ng/m L MIF和100 ng/m L CXCR4中和抗体,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)、免疫细胞荧光、蛋白质印迹法(Western blot)检测干细胞自我更新因子(KLF4、c-MYC、NANOG、OCT4、SOX2)及分化转录因子(FOXA2、OTX2)的表达水平。结果与结论:(1)人胚胎干细胞H9的对数生长期为3-6 d,正常生长的情况下自分泌MIF水平约为20 ng/m L,与细胞量无关;(2)与对照组相比,添加不同质量浓度MIF对人胚胎干细胞的增殖无影响(P>0.05);ISO-1明显抑制人胚胎干细胞的增殖,ISO-1浓度越大,抑制越明显(P<0.05);ISO-1中添加MIF可以减少ISO-1的抑制作用(P<0.05);(3)RT-q PCR检测MIF基因敲除约50%后,人胚胎干细胞生长活力显著降低并且无法建系成功;(4)在培养基中添加100 ng/m L外源性MIF,自我更新转录因子KLF4的m RNA、蛋白及荧光表达水平均下降;分化因子FOXA2的m RNA、蛋白及荧光表达水平均上升;(5)在培养基中添加100 ng/m L CXCR4中和抗体,KLF4的m RNA及蛋白表达水平均上升;FOXA2的m RNA及蛋白表达水平均下降,与MIF组表达趋势相反。综上所述,人胚胎干细胞自分泌的MIF是其存活所必需的;培养基中额外添加MIF并不能促进人胚胎干细胞增殖,但可以使自我更新因子KLF4表达下降,转录因子FOXA2表达上升,为下一步探明MIF对人胚胎干细胞分化的影响及机制提供了线索,MIF-CXCR4轴在其中起到一定的调控作用。

基于胚胎干细胞模型的Cry1Ab蛋白发育毒性

目的:通过胚胎干细胞发育毒性评价模型研究Cry1Ab蛋白对于细胞增殖和分化能力的影响,以评估其发育毒性。方法:设置Cry1Ab蛋白7个剂量组(31.25、62.50、125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00μg/L),以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)为阳性对照,以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)为溶剂对照,分别处理小鼠胚胎干细胞D3(embryonic stem cell line D3,ES-D3)和小鼠成纤维细胞3T3。通过CCK-8法检测细胞活性,计算受试物对于不同细胞的增殖半抑制浓度(50%inhibition concentration of growth and viability, IC_(50))。设置Cry1Ab蛋白5个剂量组(125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00μg/L),设置溶剂对照(PBS),同时以5-FU为受试物进行模型验证,分别处理细胞后,通过拟胚胎体(embryonic bodies, EBs)培养法诱导ES-D3分化出心肌细胞;镜下观察EBs生长情况并测量其第3天和第5天的直径,观察并记录同批次EBs分化出搏动心肌细胞的比例,计算受试物的心肌分化半抑制浓度(50%inhibition concentration of differentiation, ID50),根据发育毒性判别函数对受试物的胚胎发育毒性进行分类;收集培养终点的EBs样本,进行实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative po-lymerase chain reaction, qPCR),检测心肌分化相关标志物(Oct3/4、GATA-4、Nkx2.5和β-MHC)的mRNA表达情况。结果:5-FU的IC_(50,3T3)为46.37μg/L,IC_(50,ES)为32.67μg/L,ID_(50,ES)为21.28μg/L,根据判别函数结果将5-FU分类为强胚胎毒性物质。不同浓度的Cry1Ab蛋白处理组的3T3细胞和ES-D3细胞活性与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,Cry1Ab蛋白处理组分化第3天和第5天的EBs直径差异无统计学意义(P>0.05),EBs形态也未见明显差异;不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的心肌分化率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。5-FU使β-MHC、Nkx2.5和GATA-4的mRNA表达水平降低(P<0.05),且具有剂量依赖趋势(P<0.05),而与细胞多能性相关的标志物Oct3/4 mRNA表达水平则呈升高趋势(P<0.05);Cry1Ab蛋白处理组的成熟心肌标志物β-MHC、心肌早期分化标志物Nkx2.5和GATA-4、多能性相关标志物Oct3/4的mRNA表达水平与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:本实验模型中未观察到31.25~2 000.00μg/L的Cry1Ab蛋白具有发育毒性。

热应激对奶牛卵母细胞及早期胚胎发育潜能的影响研究进展

热应激是影响奶牛繁殖效率的重要因素之一,同时会导致奶牛产奶量下降,给全球奶业造成巨大的经济损失。随着全球气候变暖加剧,热应激影响奶牛繁殖率的问题日益凸显。目前热应激导致奶牛繁殖性能下降的具体机制尚不清楚,且缺乏热应激条件下提高母牛繁殖率的有效措施。有研究发现热应激会造成奶牛生理环境紊乱,损害卵母细胞的发育潜能,影响着床前胚胎的发育。本文综述了热应激影响奶牛卵泡生理环境、卵母细胞和着床前胚胎发育潜能的相关研究进展,为进一步探索热应激影响奶牛繁殖效率的机制以及研发相关的策略手段以减少热应激带来的经济损失提供参考。

卵母细胞及早期胚胎脂代谢的研究进展

脂代谢为卵母细胞发育成熟及早期胚胎发育过程提供能量,且代谢中间产物具有多种细胞生物学功能,包括生物膜构建、细胞信号传导、类固醇前体产生和代谢。卵母细胞还可以通过卵丘细胞从卵泡液获得脂质及其代谢物,尤其是胆固醇、高密度脂蛋白、甘油三酯、游离脂肪酸、载脂蛋白A1、肉碱。多囊卵巢综合征(PCOS)、肥胖、高龄、代谢紊乱、卵巢低反应(POR)等人群中卵母细胞脂代谢的异常与卵母细胞及其胚胎质量差密切相关。本文将综述卵母细胞减数分裂及早期胚胎发育过程中的脂代谢,为不孕症女性和高龄女性的个体化辅助生殖治疗提供理论支持,也有益于创新与改进未成熟卵母细胞体外培养液。

‘西林3号’核桃体细胞胚胎诱导与增殖的影响因素

【目的】筛选最佳的‘西林3号’核桃体细胞胚胎诱导和增殖培养条件。【方法】通过进行不同消毒方法、不同外植体、不同采样时期、不同激素浓度配比、不同蔗糖与谷氨酰胺浓度处理,对核桃胚性愈伤组织的诱导情况进行研究,筛选最佳诱导条件;同时对比不同激素浓度对核桃体细胞胚胎增殖率的影响,筛选最佳增殖培养基。【结果】雄花(花药)、种子、幼胚的最佳消毒方法分别为70%乙醇15 s+10%NaClO浸泡4 min、70%乙醇30 s、70%乙醇5 min,培养4 d后的存活率高,污染率低。幼胚是诱导胚性愈伤组织的最佳材料,5月31日是最佳的采样时间,诱导率分别为(65.00±7.07)%和(85.83±1.17)%。以愈伤组织为材料时,诱导胚性愈伤组织的最佳激素浓度配比为改良DKW培养基添加1.0 mg/L 6-BA、2.0 mg/L KT、0.01 mg/L IBA,诱导率为(37.94±1.33)%。以愈伤组织为材料时,诱导胚性愈伤组织的最佳蔗糖质量浓度为30 g/L,诱导率为(82.67±0.94)%,谷氨酰胺不是诱导胚性愈伤组织的影响因素。体胚增殖的最佳激素浓度配比为改良DKW培养基添加0.5 mg/L 6-BA、1.0 mg/L KT、0.005 mg/L IBA,增殖率为98%。【结论】外植体和采样时间的选择直接影响体胚诱导的结果,对于幼胚这类果实内部材料来说,仅进行简便快捷消毒即可。激素和碳源是胚性愈伤组织诱导与发生的关键因素,谷氨酰胺不是胚性愈伤组织诱导的影响因素。在进行体胚继代增殖培养时,适当添加激素可以抑制体胚成熟,提高增殖率。

利用胚胎干细胞骨分化实验评价Cry1Ab蛋白的发育毒性

目的通过小鼠胚胎干细胞骨分化实验研究Cry1Ab蛋白对胚胎干细胞成骨分化过程的影响,以评估Cry1Ab蛋白的发育毒性。方法以Cry1Ab蛋白为受试物,设置5个剂量(125,250,320,1000,2000 ng/ml)染毒小鼠胚胎干细胞形成的拟胚胎体(embryonic body,EB),设置溶剂对照和阳性对照,同时向培养基中添加β-甘油磷酸盐(10 mmol/L)、抗坏血酸(50μg/ml)和维生素D3(500μmol/L)诱导EB向骨细胞分化,通过茜素红S染色和吸光度检测确定骨细胞钙化结节生成情况;收集EB制备细胞裂解液,通过BCA法测量细胞总蛋白浓度,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒检测细胞裂解液中ALP活性;收集EB样本提取总RNA,通过qPCR检测骨细胞分化相关标志物Runx2、SPARC和I型胶原的基因表达情况。结果与对照组相比,不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的EB细胞团大小、钙化结节数量无统计学差异(P>0.05);Cry1Ab蛋白各浓度组的细胞总蛋白浓度和ALP活性与对照组相比无统计学差异(P>0.05);Cry1Ab蛋白各浓度组的Runx2、SPARC和I型胶原基因表达水平与对照组相比均无统计学差异(P>0.05)。结论本次试验中,未观察到Cry1Ab蛋白对小鼠胚胎干细胞成骨分化过程产生影响,125~2000 ng/ml的Cry1Ab蛋白不具有发育毒性。

LMO4在小鼠胚胎干细胞分化为血管内皮细胞和血管生成中的作用

目的探讨转录因子LIM结构域蛋白4(LMO4)在小鼠胚胎干细胞(mESC)分化为血管内皮细胞及新生血管中的作用。方法使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从小鼠红系白血病细胞系MEL)中克隆小鼠Lmo4的cDNA,并亚克隆到含有小鼠胎肝激酶-1(Flk-1)启动子驱动表达Gfp的载体(pFG),构建成血管细胞特异性表达的LMO4的载体pFLG。将表达载体转染mESC,通过遗传霉素(G418)筛选,获得mESC/pFG和mESC/pFLG的细胞株;将这些mESC在体外进行自我分化,以形成4 d和10 d的胚胎体(EB),并进行成血管细胞的集落细胞形成实验(BL-CFC);以10 d-EB进行新生血管出芽实验,观察和分析出芽长短、数目;运用蛋白免疫印迹(Western blot)或定量RT-PCR方法对目的基因的表达进行检测。结果PCR结果证实成功构建了成血管细胞特异性表达的LMO4的表达载体pFLG。通过G418筛选获得mESC/pFG和mESC/pFLG的细胞株。这些mESC通过自我分化形成4 d-EB和10 d-EB,荧光显微镜下观察到EB内均可见绿色荧光标记的细胞。Western blot检测显示:与mESC相比,4 d-EB和10 d-EB的LMO4的表达显著增加。过量表达LMO4的mESC/pFLG产生BL-CFC效率为(7.70%±1.27%),而mESC/pFG细胞产生BL-CFC效率为(1.15%±0.48%),二者差异有统计学意义(P=0.021)。定量RT-PCR结果显示,Flk-1、C-kit、Tie-2、Ve-cad基因在10 d-EB/pFLG中的表达,均较10 d-EB/pFG中表达增加2倍以上。新生血管出芽实验结果显示,10 d-EB/pFLG的新生血管数量和长度均较10 d-EB/pFG增加(P<0.05)。结论过量表达LMO4促进mESC形成成血管细胞,并有利于血管内皮细胞的分化和血管的新生。

3D培养诱导胚胎成纤维细胞为神经前体样细胞

目的探讨3D培养微环境和小分子组合(ATPV)对胚胎成纤维细胞诱导为神经前体样细胞的影响。方法在0.5%琼脂糖低粘附3D培养微环境和ATPV处理下,将小鼠胚胎成纤维细胞形成3D球体,分别通过RT-PCR、免疫荧光染色和碱性磷酸酶染色的方法检测神经前体细胞标记基因的表达水平。结果在3D环境下培养,随着成球培养时间的增长,小鼠胚胎成纤维细胞NPC特异性标记基因的表达明显上升,表现出神经前体样细胞的特征,并且3D ATPV培养微环境明显提高了小鼠胚胎成纤维细胞向神经前体样细胞的转化效率。结论小鼠胚胎成纤维细胞在3D和3D ATPV微环境下,聚集成球培养后逐渐获得了干细胞特征并诱导为神经前体样细胞,暗示着成球培养和小分子微环境可以给小鼠胚胎成纤维细胞创造一种良性的细胞聚集微环境,诱导神经前体样细胞的产生,这将为神经退行性病变的细胞替代疗法带来新的细胞来源。

TNF-α和VEGF协同作用小鼠胚胎干细胞衍生的血管内皮祖细胞促伤口愈合

皮肤伤口愈合是世界范围内的重大临床难题之一,血管生成和炎症反应是影响伤口愈合和组织再生的关键环节。内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)在血管内皮修复和招募炎症细胞促伤口愈合过程中发挥重要作用。然而,体内直接输送EPC低效且会损害细胞存活力和功能进而影响治愈效率。因此,改善EPC的生物学功能以促进伤口愈合很有必要。本研究将小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESC)在10 ng/mL VEGF和5 ng/mL bFGF的作用下诱导获得CD133+CD34+EPC。以mESC衍生的EPC为研究对象,将外源性肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作用于mESC-EPC,结果表明,10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL VEGF协同处理组相比于单因子处理显著促进EPC的黏附、细胞迁移和管腔形成能力(P<0.01)。进一步通过建立小鼠局部皮肤全层创伤模型,在创周处注射10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL VEGF协同EPC治疗明显加速伤口愈合(P<0.05),再生皮肤真皮层增厚(P<0.001),促进血管生成素ANG1和ANG2介导CD31+内皮细胞构成的毛细血管网络成熟。随着伤口愈合程度的加深,促炎因子TNF-α在蛋白质水平的表达下调(术后13 d,PBS组、EPC组、VE组、TE组和VTE组的TNF-α相对表达量分别为0.73±0.01、0.60±0.02、0.42±0.02、0.36±0.01和0.34±0.03),创造有利于伤口愈合的炎症微环境。综上所述,10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL VEGF的协同作用强化EPC的生物学功能,并通过促进新血管生成和早期炎症反应加速小鼠皮肤伤口闭合和组织重塑,为细胞干预伤口愈合治疗提出新的思路。

应用自编码器插补提高猪早期胚胎单细胞转录组分析精度

【目的】自编码器作为一种深度学习算法,在单细胞转录组数据降维和插补分析上具有独特优势。评估自编码器Auto Class应用在猪早期胚胎单细胞转录组数据中的可行性,探究不同胚胎激活方式对关键基因和信号传导通路的影响。【方法】收集3种不同激活方式(体内受精、体外授精和孤雌激活)的猪早期胚胎单细胞转录组数据,采用Auto Class进行数据质控和插补分析,结合下游分析评估Auto Class性能。此外,通过差异表达基因(Differential expression genes, DEG)和功能富集分析,比较3种类型胚胎的关键基因和信号通路。【结果】经过数据质控和自编码器数据插补,聚类分析精度提高,不同激活方式的猪早期胚胎聚类清晰。单独质控只筛选出1 287个DEG,而自编码器插补后,DEG数目增加至11 523个。功能富集分析进一步挖掘出3种不同类型胚胎间显著差异的关键生物学过程和信号通路,如体内受精胚胎的基础生物学过程和细胞代谢,体外授精胚胎的性腺发育和性别决定,以及孤雌生殖胚胎的免疫防御和分泌途径调节。【结论】采用自编码器提高单细胞转录组数据的分析精度,揭示了3种胚胎激活方式影响猪早期胚胎发育的关键基因和信号通路,为深入研究猪早期胚胎发育的分子机制提供了新思路。

人卵丘颗粒细胞线粒体与胚胎质量的关系研究

目的:探讨人卵丘颗粒细胞(CGCs)线粒体与胚胎质量及发育潜能的关系。方法:选取2022年10月到2023年10月于联勤保障部队第九四〇医院生殖中心行IVF/ICSI助孕的60例患者,收集患者取卵当日CGCs并体外培养,根据取卵后第3d(D3)CGCs对应的优质胚胎率将其分为3组:A组(优质胚胎率<1/3)、B组(1/3<优质胚胎率>2/3)、C组(优质胚胎率>2/3)。通过观察并比较各组间CGCs线粒体分布、线粒体膜电位(MMP)、活性氧(ROS)水平、线粒体DNA(mtDNA)拷贝数与细胞内三磷酸腺苷(ATP)水平的差异,评估它们对胚胎质量的影响。结果:与C组相比,A、B组CGCs ATP、MMP明显降低、ROS水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。三组间线粒体分布率及mtDNA拷贝数差异无明显统计学意义(P>0.05)。结论:CGCs的ATP、MMP、ROS水平可用于预测胚胎质量。

人类胚胎干细胞法律规制的路径研究

人类胚胎干细胞具有很高的研究和临床应用价值,而目前我国关于人类胚胎干细胞研究的法规还在探索阶段,故尚存在临床研究备案制不足以防范伦理风险、对科研机构及其工作人员法律责任的认定不够细化、有关捐赠者与受赠者的知情同意规定不完善等问题;由剖析英、美、德等对人类胚胎干细胞研究的法律规范,对我国人体胚胎干细胞研究之科学立法原则、机构准入、科研机构及其工作人员法律责任和相关人员知情同意书等提出有针对性的完善性建议。