TfR-Ubi融合蛋白稳定表达株的构建及功能初测

目的:通过构建转铁蛋白受体-泛素(transferrin receptor-ubiquitin,Tf R-Ubi)融合蛋白,研究胞内体蛋白分选机制。方法:首先扩增小鼠泛素和人源转铁蛋白受体基因,构建HA-Tf R-Ubi表达质粒,转染A431细胞后,采用Western blot验证融合蛋白的表达。在稳定表达Tf R-Ubi的A431和Hrs-KO MEF细胞株中,转铁蛋白刺激,免疫荧光法观察Tf R-Ubi融合蛋白在细胞内的位置。结果:成功构建HA-Tf R-Ubi表达质粒,免疫荧光结果提示Tf R-Ubi融合蛋白被分选到晚期内体(late endosome)/溶酶体,Hrs-KO MEF细胞中Tf R-Ubi融合蛋白分选受到影响。结论:Tf R-Ubi融合蛋白在胞内体被分选,证明了泛素修饰改变了转铁蛋白受体的降解方式,为胞内体分选转运装置(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)分选机制研究提供了实验工具。