多囊蛋白-1胞内区cDNA的克隆与表达

目的 :获取多囊蛋白 - 1胞内区片段。 方法 :用 PCR法克隆多囊蛋白 - 1胞内区的 c DNA片段 ,然后插入融合蛋白表达载体 p Pro EX Hta中 ,经测序证实后 ,转入大肠杆菌中表达并用亲和层析法进行纯化。结果 :克隆到一个 6 6 0 bp的多囊蛋白- 1胞内区 c DNA片段 ,得到了一个相对分子质量为 2 .6万的融合蛋白。结论 :多囊蛋白 - 1胞内区片段的融合蛋白为制备抗多囊蛋白 - 1单克隆抗体提供了基础。

TLR4胞内区的同源模建

目的 为进一步研究新发现的ＴＬＲ４蛋白在ＬＰＳ对机体细胞产生作用的机制，分析其Ｑ结构上的功能区域。方法 同源模建，通过计算机模拟从理论上对ＴＬＲ４胞内区的功能区域进行探讨。结果Ｐｒｏ７１２Ｈｉｓ突变体溶液可及表面的亲疏水性质有明显变化，且相应位置所带的电荷从中性变为正电荷。结论ＴＬＲ４胞内区在发生作用时，起主要作用的是疏水性作用，下一个接头蛋白ＭｙＤ８８与ＴＬＲ４胞内区相互作用的部位应当是一个有较强疏水作用的区域。这样当Ｐｒｏ７１２Ｈｉｓ突变体出现时，由于电荷的排斥，疏水作用无法达到点突变以前的强度，２个蛋白的结合不能得以实现，信号无法继续传递。从而出现对ＬＰＳ的耐受现象。

整合素β3亚单位胞内区在骨桥蛋白诱导血管平滑肌细胞黏附和迁移中的作用

为阐明整合素β3亚单位胞内区及其不同保守序列在骨桥蛋白(OPN)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)黏附和迁移中所起的作用,构建了整合素β3亚单位胞内区肽段真核表达载体(pEGFP-C3-β3CD),并人工合成了含有β3亚单位胞内区不同保守序列(NXXY)的寡肽(肽-747和肽-759),通过导入VSMC,观察它们对OPN诱导VSMC黏附和迁移的影响.结果显示,整合素β3胞内区在VSMC中强制性表达可使细胞在OPN上的黏附和迁移明显下降(分别为对照组的34.3%和31.7%);导入肽-747、肽-759和肽-747+肽-759均可显著抑制VSMC的黏附和迁移,其中肽-747+肽-759的作用更强(分别为对照组的36.4%和31.1%).免疫荧光结果显示,在转染pEGFP-C3-β3CD或肽-747+肽-759的VSMC中,黏着斑蛋白的磷酸化水平降低,黏着斑形成明显减少.研究结果表明,整合素β3亚单位胞内区及其NXXY保守序列在黏着斑相关蛋白募集、黏着斑形成及VSMC黏附和迁移方面发挥重要作用.

白血病抑制因子受体细胞内区对HL-60细胞表达CD14和CD15的影响

观察白血病抑制因子 (LIF)受体gp190亚基完整的细胞内区和gp190胞内区C末端片段(190CT)对人白血病系HL 6 0表达CD14、CD15的影响 ,进一步了解LIF引发白血病细胞增殖抑制和分化的关系 .用基因重组技术将LIF另一亚基gp130的细胞内区换成gp190的细胞内区 ,用PCR技术扩增gp190细胞内区C末端的一个多肽的编码序列 ,构成嵌合体受体基因 130 /190及 190CT片段 ,并分别在HL 6 0细胞表达 .用免疫组化和流式细胞术检测分析在LIF的诱导下 ,HL 6 0细胞表达CD14、CD15的水平 .转染pcDNA130 /190的HL 6 0细胞 ,CD15表达量明显增高 ;转染pcDNA190CT的细胞 ,CD15的表达量降低 ;但 2组细胞的CD14表达量均较低且水平接近 .LIF可能诱导HL 6 0细胞向粒细胞而不向单核细胞分化 ,该效应是由gp190亚基细胞内区介导的 ,而gp190C末端片段可干扰LIFα受体介导的信号传导效应 .

G-CSF受体胞内区与AK017149的相互作用

为研究G CSF受体胞内区与AK017149基因之间的相互作用,进而揭示G CSF受体信号转导通路的可能机制,采用高敏感性的酵母双杂交体系,筛选小鼠胎肝文库,在筛选过程中获得了1个功能未知的基因片段 AK017149,并在酵母和哺乳动物细胞体内验证了该基因片段的表达蛋白与G CSF受体间的相互作用.实验研究提示,G CSF受体作为胞内信号转导的起始点,可以与众多蛋白因子相结合,对其中未知蛋白的研究,可以为揭示G CSF受体信号转导通路起重要的提示作用.

多囊蛋白1胞内区单克隆抗体的制备及初步应用

目的 :制备多囊蛋白 1胞内区单克隆抗体 ,并用以观察多囊蛋白 1在肾组织中的分布与表达。 方法 :以重组多囊蛋白 1胞内段融合蛋白为抗原 ,采用杂交瘤技术 ,制备产生针对多囊蛋白 1胞内区的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,并利用所产生的单克隆抗体 ,采用标准 En Vision免疫组织化学方法 ,对多囊肾组织、正常成人肾组织和胎肾组织进行染色。结果 :获得 4株稳定分泌抗体且效价为 1∶ 10 6 左右的杂交瘤细胞株 ,传代至第 5 0代仍能稳定分泌抗体 ,效价不变 ;多囊蛋白 1在正常成人肾组织的近端小管、远端小管和集合管的上皮细胞呈弱阳性表达 ,在胎儿肾脏的肾小管上皮细胞呈强阳性 ,在多囊肾组织的囊肿衬里上皮细胞表达明显增强。 结论 :成功制备了多囊蛋白 1胞内区单克隆抗体 ,为深入了解多囊蛋白

LIF受体a亚基胞内区远膜端对HL-60细胞增殖分化的影响

目的：探讨LIF受体a亚基胞内区远膜端对HL-150细胞增殖分化的影响。方法：构建LIF受体a亚基胞内区远膜端(gp190CT3)真核表达载体，利用脂质体转染HL-60细胞，G418筛选阳性细胞株，免疫组化检测其表达。倒置显微镜观察野生型HL-60细胞及转染有gp190CT3的HL-60细胞及转染有空载体的HL-60细胞的生长状态。

G-CSF受体胞内区结合蛋白COXⅡ的分子克隆及相互作用验证

为寻找与G-CSF受体胞内区相互作用的蛋白,探讨其可能的信号传导机制,应用酵母双杂交技术从小鼠胎肝文库中筛选到与G-CSF受体胞内区相互作用的蛋白—细胞色素C氧化酶Ⅱ亚基(COXⅡ);采用PCR技术从小鼠肌肉cDNA中克隆到全长COXⅡ,并应用哺乳动物细胞双杂交实验验证了COXⅡ与G-CSF受体胞内区相互作用;构建了一系列G-CSF受体胞内区短截体,应用细胞双杂交技术确定COXⅡ主要结合于G-CSF受体的Box3区;随后构建了COX Ⅱ-GFP融合表达载体,观察到COXⅡ在COS_7细胞中为全细胞分布。这些结果为揭示COXⅡ的新功能及发现G-CSFR新的信号传递通路提供了线索。

白血病细胞中共表达P2X7受体和Notch1胞内区

本研究旨在构建野生型及N187D突变型P2X7与ICN1基因的共表达载体,并在白血病细胞中表达,为进一步探讨P2X7在白血病发展中的作用奠定基础。采用Overlap PCR法,通过2A连接,构建野生型或N187DP2X7与ICN1的共表达载体;经DNA序列分析验证后,包装病毒、感染K562细胞并经细胞分选获得稳定感染细胞系。采用RT-PCR、Western blot、胞浆游离钙离子浓度测定等方法,验证外源基因的表达及P2X7受体的功能。结果表明,序列分析显示载体构建正确;包装病毒对K562细胞感染效率40%-70%,流式分选获得稳定表达细胞株;RT-PCR结果显示,P2X7受体和/或ICN1基因可在对应的稳定表达细胞株中高效表达;Western blot也证明,P2X7受体可在感染编码P2X7受体基因病毒的K562细胞中高效表达;胞浆游离钙离子浓度检测显示,在BzATP刺激下,表达野生及N187D突变型P2X7的K562细胞胞浆游离钙离子浓度持续升高。结论:本研究在白血病细胞中成功共同高表达P2X7受体与ICN1,为进一步探讨野生型和N187D突变型P2X7受体在白血病发展中的作用奠定基础。

抗KDR胞内区(KDR-CD)单克隆抗体的制备和鉴定

目的:研制特异性针对肿瘤新生血管内皮细胞生长因子受体(或含激酶插入区受体)胞内区(KDR-CD)的特异性单克隆抗体(mAb)。方法:以谷胱甘肽转硫酶耦联的KDR-CD(GST-KDR-CD)可溶性融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备分泌抗KDR-CD mAb的杂交瘤细胞;用间接ELISA法测定其亲和力、亚类,Western blot检测其特异性。结果:获得1株稳定分泌抗KDR-CD mAb的杂交瘤细胞株,命名为2B8H2A5;它分泌的抗体亚类为IgG1,к型轻链,而且亲和力强、特异性高。结论:成功获得能分泌抗KDR-CD mAb杂交瘤细胞,为以后将该mAb改造成小分子酪氨酸激酶抑制剂,使其能进入细胞内与受体KDR-CD特异性结合并阻断血管内皮细胞生长因子强大的生物学功能奠定了重要的基础。

人淋巴细胞CD2胞内区结合蛋白的分子克隆

ＣＤ２分子，又称Ｅ受体，分布于胸腺细胞及所有成熟Ｔ淋巴细胞和大部分ＮＫ细胞的表面，是Ｔ淋巴细胞的粘附和信号分子，在Ｔ淋巴细胞分化、成熟、识别、粘附、激活和凋亡等方面都具有重要作用。ＣＤ２分子的胞内区含有能调节细胞识别作用、粘附作用和细胞信号传递作用的...

白血病抑制因子受体α亚基胞内区远膜端对HL-60细胞增殖分化的影响

目的 探讨白血病抑制因子 (LIF)受体α亚基胞内区远膜端对HL 60细胞增殖分化的影响。方法 构建LIF受体α亚基胞内区远膜端 (gp190CT3 )真核表达载体 ,利用脂质体转染HL 60细胞 ,G418筛选阳性细胞株 ,免疫组化检测其表达。倒置显微镜观察野生型HL 60细胞及转染有gp190CT3的HL 60细胞的生长状态。以Westernblot及流式细胞仪分别检测野生型HL 60细胞及转染有gp190CT3的HL 60细胞中细胞增殖核抗原 (PCNA)及CD15水平。 结果 转染有gp190CT3的HL 60细胞体积增大 ,与野生型HL 60细胞相比 ,转染有gp190CT3的HL 60细胞增殖速度减慢 ,PC NA的表达水平明显降低 ,而CD15水平明显升高 (转染有gp190CT3的HL 60细胞中CD15阳性细胞百分率为 89.98% ,野生型HL 60对照组中CD15阳性细胞百分率为 40 .79% )。结论 LIF受体α亚基胞内区远膜端参与LIF受体的信号转导 ,其效应是抑制细胞的增殖 ,促进细胞分化。

胞内区功能缺失的EGFR基因对胚胎生殖细胞系EG4分化的影响

ＥＧ４细胞是由 １０．５ ｄ胎龄的 １２９／ｓｖＪ 小鼠原始生殖细胞经体外培养得到的多能干细胞系． ＥＧ４细胞的发育多能性使其可作为研究细胞分化的体外模型．通过基因转染的方法获得能表达胞内区缺失的外源ＥＧＦＲｄ基因的ＥＧ４细胞，定名为ＥＧ４－ＥＧＦＲｄ．分析其生长分化特性，发现：（ｌ）ＥＧ４－ＥＧＦＲｄ细胞可在未分化状态下维持长时间的增殖；（２）经维生素Ａ酸（ＲＡ）诱导后，作为对照组的大部分ＥＧ４细胞和转染空白质粒的细胞分化为脂肪细胞，而ＥＧ４－ＥＧＦＲｄ细胞的分化趋势不明显，表明ＥＧＦＲ在脂肪细胞的发育分化中具有一定的调节作用；（３）ＥＧ４细胞接种小鼠皮下，长出的肿块切片分析显示，突变型肿块组织含有大量的未分化细胞和结缔组织，分化细胞以骨骼肌为主，对照组主要含软骨细胞、角质和上皮细胞以及神经管等分化组织．结果表明，ＥＧ４细胞的ＥＧＦＲ信号传导系统受抑制后，阻碍了依赖ＥＧＦＲ的细胞分化．

人IL-23R胞内区基因的克隆与原核表达

目的克隆人IL-23R(hIL-23R)胞内区基因,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法通过PCR获得hIL-23R基因的胞内区片段,克隆至载体pGEX-4T-1中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-hIL-23R(I),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot进行鉴定。结果hIL-23R胞内区基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析可见约760bp的目的片段。重组原核表达质粒经双酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约为55000,在低温(20℃)、低IPTG浓度(0.5mmol/L)诱导条件下能以可溶形式表达,可溶性蛋白的表达量约占菌体可溶性蛋白总量的16.1%,且可被兔抗GST多克隆抗体识别。结论已成功克隆了hIL-23R胞内区基因,并在大肠杆菌中表达了可溶性的GST融合蛋白。

CD2胞内区结合蛋白的分子克隆与鉴定

为了探讨 ＣＤ２分子的信号传递功能，以编码ＣＤ２胞内区（Ｔｈｒ２１１－Ｇ１ｎ３３６）肽段的ｃＤＮＡ为“钓饵”，采用酵母双杂交系统从激活的人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中筛选与之相互作用蛋白的ｃＤＮＡ序列．并采用免疫共沉淀法鉴定该蛋白在体内与ＣＤ２胞内区结合的特异性．克隆并鉴定了一个与ＣＤ２胞内区特异性结合的胞内蛋白分子，与ｖ－ｆｏｓ转化效应蛋白（Ｆｔｅ－１）同源 Ｆｔｅ－１参与细胞转化、生长、蛋白合成及向线粒体转运蛋白质．蛋白数据库检索表明，Ｆｔｅ－１具有蛋白激酶ＰＫＣ的结合与作用位点。

猪流行性腹泻病毒S蛋白胞内区线性B细胞表位最小基序鉴定

【背景】S蛋白是猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)的主要结构蛋白和免疫原性蛋白,在前期的研究中,本课题组在S蛋白的胞内区鉴定到2个包含线性B细胞表位的短肽。【目的】鉴定PEDV S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。【方法】原核表达2个短肽的每次后移1个氨基酸的系列8肽,以兔抗S蛋白血清为一抗,通过Western Blot筛选阳性反应8肽,鉴定S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。【结果】S蛋白胞内区的2个包含线性B细胞表位的短肽共享一个表位,该表位的最小基序为^(1371)QPYE^(1374)。同源性分析显示该B细胞表位基序为保守性表位。【结论】确定了S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序为^(1371)QPYE^(1374);S蛋白抗原表位的鉴定有助于提高对其结构和功能的理解。

重组人HER2／neu ICD在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的用毕赤酵母表达体系制备具有与天然HER2/neu ICD相同结构和活性的重组HER2/neu ICD。方法PCR法自质粒pCMV中克隆HER2/neu ICD基因,构建真核表达载体pPICZα/HER2/neu ICD,电转化至毕赤酵母菌株X-33。对基因转染Zeocin抗性阳性的克隆,采用PCR法筛选出稳定表达HER2/neu ICD的菌株。最后用SDS-PAGE鉴定甲醇诱导的培养上清液中的HER2/neu ICD。结果构建pPICZα/HER2/neu ICD真核表达载体并经电转化获得Zeocin抗性阳性的克隆;PCR法筛选了稳定表达HER2/neu ICD的菌株;SDS-PAGE分析显示甲醇诱导后表达上清中含有HER2/neu ICD,分子量约为84kDa。结论成功构建pPICZα/HER2/neu ICD真核表达载体并筛选出稳定表达HER2/neu ICD的毕赤酵母工程菌。

神经营养因子受体Trk和p75NTR的信号传递途径

神经营养因子是一类对特定类型的中枢和外周神经系统神经元的生存和发展至关重要的生长因子家族。

HER3与肿瘤及肿瘤耐药的关系研究进展

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）家族属于受体酪氨酸激酶,包括4种I型跨膜受体：EGFR（HER1）、HER2（Neu,ERBB2）、HER3（ERBB3）和HER4（ERBB4）。这些受体均包含细胞外区、跨膜区和胞内区3个部分,其中细胞外区包含4个结构域,胞内区包含1个用来信号传导的细胞内酪氨酸激酶结构域和1个位于胞浆内的带有酪氨酸磷酸化残基的尾部。

FasL N-端编码序列对其表达的影响

目的探讨Fas配体(Fas ligand, FasL)胞内区氨基酸组成对膜型FasL蛋白表达的影响.方法 PCR技术扩增FasL胞内区产生不同缺失的cDNA,构建重组表达质粒;使用脂质体转染法将表达质粒导入靶细胞;RT-PCR分析FasL mRNA水平;荧光抗体染色、流式细胞仪和Western免疫印迹技术检测细胞中FasL蛋白的表达.结果 FasL N-端缺失第2～16氨基酸残基后,FasL蛋白在细胞中的表达水平显著增加,但mRNA水平不变.结论 FasL N-端第2～16氨基酸残基对FasL蛋白表达水平具有自我调节作用.