关键环境因子对嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)在嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)细胞内增殖的影响

嗜肺军团菌是一种生活在人工水环境中的条件性致病菌,环境条件对该菌的存活和胞内增殖具有重要的影响.本文用作者建立的军团菌-四膜虫模型,研究了空调水池水、Fe3+和感染温度3种关键性环境因子对嗜肺军团菌在嗜热四膜虫宿主细胞内增殖的影响.结果发现,尽管空调水中Fe3+浓度大大低于培养基中的Fe3+浓度,但适合嗜肺军团菌在嗜热四膜虫宿主胞内的存活和增殖;感染缓冲液中的Fe3+能够被嗜热四膜虫富集,并被胞内的军团菌加以利用,缓冲液中浓度0.05×10-6的Fe3+即可显著促进胞内军团菌的增殖,但0.1×10-6和0.5×10-6的Fe3+促进军团菌胞内增殖的效果差异不显著;较高的温度对军团菌的胞内增殖也有明显促进作用,35℃时,即使感染复数等于10,军团菌也可进行胞内复制扩增,并最终裂解宿主细胞.

不同分化形态的嗜肺军团 菌对嗜热四膜虫BF1的感染和胞内增殖特征

嗜肺军团菌是一种广泛分布于淡水生态环境中的条件性胞内致病菌,其不同的分化形态与菌体的存活、感染力和毒力有密切关系.本文对不同分化形态的表达绿色荧光蛋白的嗜肺军团菌在不同感染复数(multiplicityofinfec-tion,MOI)下感染嗜热四膜虫BF1株的条件以及胞内增殖的特征进行了研究.结果表明,胞内的军团菌比大肠杆菌有更强的抗消化能力,30℃时处于对数生长期的嗜肺军团菌即使在MOI等于100的情况下仍然在24h内被四膜虫消化殆尽,而平板培养至稳定期的菌体即使MOI只有50即可实现胞内增殖,并在18h内使宿主数量急剧下降.饲喂军团菌后,四膜虫都有一个数量先上升的过程,然后依MOI的不同呈现稳定或下降的趋势.本文还通过荧光显微镜观察描述了一定MOI下四膜虫对稳定期菌体的消化和形态变化的动态过程.

产单核细胞李氏杆菌Lm4b_02325/26双基因缺失株构建及部分生物学特性试验

旨在构建食源性产单核细胞李氏杆菌毒力岛4(LIPI-4)中的抗转录终止子(Lm4b_02325)和未知蛋白(Lm4b_02326)基因的双缺失株,研究Lm4b_02325/26基因对产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes,LM)的部分生物学特性的影响。利用同源重组技术构建LM928ΔLm4b_02325/26双缺失株,测定LM928和LM928ΔLm4b_02325/26双缺失株在脑心浸出液肉汤(brain heart infusion broth, BHI)、不同EtOH浓度、不同NaCl浓度、不同pH、不同温度下的D_(600 nm),绘制生长曲线;RT-qPCR检测双基因缺失前后体外BHI培养环境下部分毒力因子转录水平;平板计数测定其对鼠巨噬细胞RAW264.7的黏附、侵袭与胞内增殖情况;感染C57BL/6小鼠后检测肝、脾、脑组织中的细菌数量。结果表明,成功构建具有遗传稳定性的双缺失株LM928ΔLm4b_02325/26。在含0.5%~10%NaCl或3%~4.5%EtOH的培养基中,双缺失株与野毒株生长没有明显差异,在pH=5条件下,双缺失株的生长率显著高于野毒株,pH=9条件下双缺失株的生长率显著低于野毒株。在不同温度(4℃、37℃、42℃)BHI培养基中,双缺失株与野毒株生长没有明显差异。Lm4b_02325/26基因双缺失株在BHI培养基中毒力因子hly、inlC和PlcA极显著上调(P<0.01),mpl、inlB、actA、inlP、PlcB、prfA、SigB、iap和inlA极显著下调(P<0.01);双缺失株对RAW264.7细胞的黏附率(14.86%)和侵袭率(2.23%)明显低于野毒株的黏附率(22.93%)和侵袭率(4.28%)(P<0.01);3、6、12 h时胞内增殖数量极显著低于野毒株(P<0.01);双缺失株与野毒株感染小鼠后,载菌量在肝、脾中没有显著差异,在脑组织中双缺失株载菌量为10~4,高于野毒株的10~(3.07),差异极显著(P<0.01)。综上认为,LIPI-4的Lm4b_02325和Lm4b_02326基因参与LM毒力因子的表达和脑组织的定植能力,与弱酸强碱条件下适应力及对RAW264.7细胞的黏附、侵袭和胞内增殖有关。本研究为LIPI-4的功能研究奠定了基础。

ILO与LLO协助李斯特菌黏附、侵袭细胞及胞内增殖的比较研究

目的研究李斯特菌溶血素的主要功能,比较两种李斯特菌——绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii, LI)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)的溶血素对细菌黏附细胞等作用的强弱。方法构建含有LI i-hly基因上、下游同源序列和lacZ基因或hly基因的打靶质粒,利用基因重组技术构建LI溶血素(ILO)缺陷的LI重组菌株LIΔi-hly∷lacZ和回补表达LM溶血素(LLO)的重组菌株LIΔi-hly∷hly;比较2株重组菌与野生LI对人肝癌HepG2细胞的黏附、侵袭能力;比较3株菌在巨噬细胞RAW264.7内的增殖能力。结果重组菌株LIΔi-hly∷lacZ和LIΔi-hly∷hly的基因序列与预期相符;LIΔi-hly∷hly、LI和LIΔi-hly∷lacZ对HepG2细胞的黏附率分别为(3.43±0.82)%、(3.43±1.59)%和(3.41±1.12)%,侵袭率分别为(1.74±0.46)%、(1.22±0.75)%和(1.39±0.46)%,差异均无统计学意义;胞内增殖实验结果表明,与野生株相比,ILO缺陷株LIΔi-hly∷lacZ在巨噬细胞内的增殖量降低,LIΔi-hly∷hly的增殖量升高。结论 LI在细胞内的增殖水平与ILO有关,ILO缺失抑制了LI在细胞内的增殖能力,LM溶血素LLO协助细菌逃离吞噬泡进入宿主细胞质的能力强于LI溶血素ILO。

猪miR-124靶向IQGAP2调节巨噬细胞内沙门氏菌的增殖

【目的】明确猪miR-124与其靶基因IQGAP2间的表达调控关系,以及miR-124表达水平与猪巨噬细胞内沙门氏菌数量的关联,为揭示沙门氏菌在感染细胞内存活与增殖的机制提供理论依据。【方法】通过荧光素酶报告基因系统验证miR-124与IQGAP2基因的作用位点;再以GM-CSF诱导的猪巨噬细胞和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)为试验材料,通过实时荧光定量PCR和流式细胞术测定沙门氏菌感染猪巨噬细胞中miR-124和IQGAP2基因的表达及巨噬细胞内沙门氏菌的增殖情况。【结果】miR-124结合位点野生型载体转染的荧光报告信号显著低于miR-124结合位点突变载体(P<0.05,下同),但共转染anti-miR-124序列后能显著增强miR-124结合位点野生型载体的荧光报告信号。经沙门氏菌感染后,猪巨噬细胞中的miR-124表达被激活,感染12、24和48 h后的相对表达量均显著高于沙门氏菌感染前(0 h),而IQGAP2基因表达水平呈显著下调趋势;在沙门氏菌感染猪巨噬细胞内,miR-124表达水平与IQGAP2基因表达水平呈明显负相关(r=-0.92)。miR-124高表达组细胞内的沙门氏菌数量显著高于正常巨噬细胞,但miR-124敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量显著低于正常巨噬细胞;IQGAP2基因敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量显著高于正常巨噬细胞;此外,miR-124高表达+IQGAP2基因敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量与IQGAP2基因敲低表达处理组相比无显著差异(P>0.05),但显著高于miR-124高表达组细胞。【结论】沙门氏菌感染猪巨噬细胞中的miR-124表达水平与IQGAP2基因表达水平及胞内沙门氏菌数量呈负相关,即沙门氏菌可通过上调miR-124表达靶向抑制IQGAP2基因表达,从而调节其在猪巨噬细胞内的增殖。

肠炎沙门菌sifA基因缺失株的无痕构建及其在巨噬细胞内的增殖特性研究

目的本研究旨在探究sifA基因对肠炎沙门菌胞内寄生和增殖的影响,以探索肠炎沙门菌的致病机理。方法根据同源重组原理,无痕构建肠炎沙门菌C50041的sifA基因缺失株,通过蓝白斑、抗生素耐药性、PCR和基因测序方法对基因缺失株进行鉴定,并从生物学特性、胞内沙门菌增殖、sifA基因在胞内外菌中表达等方面,分析sifA基因对肠炎沙门菌的影响。结果成功构建肠炎沙门菌C50041ΔsifA,蓝白斑、抗生素耐药性、PCR和基因测序方法证明该菌株是正确的。其生长速度和生化特性没有发生改变。ΔsifA株感染巨噬细胞后,其胞内沙门菌量显著少于其野生株。sifA基因在spiC基因缺失株中表达量增加。结论肠炎沙门菌C50041ΔsifA被成功构建,其在巨噬细胞内的增殖量显著降低,sifA基因表达可能受spiC基因调控,本研究为深入探究肠炎沙门菌在细胞内增殖及sifA基因的功能奠定基础。

嗜肺军团菌致病性的研究进展

嗜肺军团菌（Legionella pneumophila，Lp）是引起军团菌病的病原菌，它是一种革兰阴性杆菌，嗜热怕冷，属兼性胞内寄生菌。嗜肺军团菌广泛存在于水、土壤中，特别是与日常生活密切相关的自来水、空调、冷却塔、淋浴器等供水系统中。国外有“有水即有军团菌”之说。无论是冷、暖气产生含有军团菌的气溶胶被人体吸入后可引起以肺部为主的全身性感染。

泛素结合酶UBE2T基因在布鲁氏菌感染过程中的作用

[目的]探讨泛素结合酶E2T(UBE2T)在布鲁氏菌感染过程中的功能。[方法]构建UBE2T基因过表达载体pLVX-puro-UBE2T,对其进行PCR和EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切验证,并将其转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测UBE2T基因过表达效果。设计并合成3条UBE2T基因沉默表达的siRNA(UBE2T-379-siRNA、UBE2T-599-siRNA和UBE2T-661-siRNA),将其转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用qRT-PCR检测UBE2T基因沉默表达效果。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)试验,检测UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞活性的影响。利用qRT-PCR,检测M5-90感染对RAW264.7细胞UBE2T基因相对表达量的影响,以及对过表达或沉默表达UBE2T基因的RAW264.7细胞中含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)基因相对表达量的影响。用布鲁氏菌M5-90菌株感染过表达和沉默UBE2T基因的RAW264.7细胞,用活菌计数法检测UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞内布鲁氏菌增殖的影响,利用相应的试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)水平、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)活性及白细胞介素6(IL-6)、IL-18、IL-1β和γ-干扰素(IFN-γ)等细胞因子的水平。[结果]成功构建了UBE2T基因过表达载体pLVX-puro-UBE2T,过表达效果良好。3条siRNA中,UBE2T-661-siRNA的干扰效果最佳,其对UBE2T基因的沉默效率为84%。UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞活性无影响。M5-90感染可提高RAW264.7细胞UBE2T的表达量;沉默UBE2T可提高M5-90介导的NLRP3和Caspase-1的表达,而过表达UBE2T会抑制M5-90介导的NLRP3表达,提高M5-90介导的Caspase-1表达。沉默表达UBE2T可抑制胞内M5-90的增殖,而过表达UBE2T可促进胞内M5-90的增殖。沉默表达UBE2T可抑制M5-90介导的LDH水平,提高Caspase-3活性及IFN-γ、IL-6和IL-1β水平;而过表达UBE2T可提高M5-90介导的LDH水平,抑制Caspase-3的活性及IFN-γ、IL-1β水平。[结论]泛素结合酶UBE2T对胞内布鲁氏菌增殖具有正调控作用。

中医治疗手足口病效果好

最近一段时间，手足口病在我国部分地区暴发。卫生部于5月3日成立手足口病防控工作领导小组，以进一步加强全国手足口病防控工作。卫生部部长陈竺亲自担任防控领导小组组长。手足口病是由肠道病毒引起的，常见有肠道柯萨奇病毒A-16型和肠道病毒71型。感染后可在人体肠壁细胞内增殖，在血液中以游离形式存在，并游离于体表的皮下组织，因而出现斑疹或疱疹。

hmpA基因对鸡白痢沙门菌在巨噬细胞内生存影响的研究

为了探究hmpA基因对鸡白痢沙门菌在胞内生存的影响,本研究利用同源重组方法构建了鸡白痢沙门菌449/87的hmpA基因缺失株(449/87ΔhmpA),同时利用原核表达载体pMMB207构建了基因回复株449/87ΔhmpA::hmpA,并对其生长曲线、生化特性以及其感染鸡源巨噬细胞HD11后一氧化氮合酶(NOS)活性、活性氧(ROS)和胞内生存情况进行测定。结果显示,hmpA基因的缺失对鸡白痢沙门菌生长速度和生化特性无影响。与野生株和回复株相比,449/87ΔhmpA感染巨噬细胞后,NO、NOS活性和ROS显著升高,胞内细菌载量明显减少,表明hmp A基因的缺失能够增强鸡白痢沙门菌诱导巨噬细胞的NOS活性和ROS的生成,降低细菌在胞内的存活能力。本研究为进一步探究hmpA基因在鸡白痢沙门菌感染过程中的功能奠定了基础。