2,2’,4,4’-四溴联苯醚对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞胞内游离钙离子浓度的影响

目的研究22,’,4,4’-四溴联苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ethers,PBDE-47)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞胞内游离钙离子([Ca2+]i)浓度的影响。方法取对数生长期的SH-SY5Y细胞,分别染毒终浓度为0(溶剂对照)、1、5、10μmol/L的PBDE-47溶液。采用MTT法检测PBDE-47体外染毒24 h后SH-SY5Y细胞存活率。利用钙离子荧光探针Fluo-3/AM标记体外培养的SH-SY5Y细胞,在激光扫描共聚焦显微镜下持续动态观测1 h内胞内钙离子荧光强度变化。采用流式细胞仪检测PBDE-47染毒3、6、12、24 h后[Ca2+]i变化。结果与溶剂对照组比较,5、10μmol/L PBDE-47染毒组细胞存活率明显下降(P<0.05);不同浓度PBDE-47染毒1 h后[Ca2+]i浓度均高于染毒0 h(P<0.05);10μmol/LPBDE-47染毒3、6、12、24 h后[Ca2+]i浓度均升高(P<0.05),5μmol/L PBDE-47染毒3、6、24 h后[Ca2+]i浓度也升高(P<0.05),而1μmol/L PBDE-47仅染毒6 h后[Ca2+]i浓度升高(P<0.05)。结论 PBDE-47染毒可使SH-SY5Y细胞[Ca2+]i浓度发生早期且持续升高,提示PBDE-47导致的SH-SY5Y细胞损伤可能与细胞内钙离子稳态改变有关。

糖皮质激素快速抑制气道平滑肌游离钙升高与磷脂酶C活性的关系

目的:本实验通过对平滑肌细胞行GCs快速预处理,拟证实糖皮质激素对平滑肌细胞内[Ca2+]i浓度升高有快速抑制作用,并初步探讨该现象的可能分子机制。方法:原代培养的大鼠平滑肌细胞,应用Fura-2/AM显微荧光检测技术,检测肌细胞内[Ca2+]i在受到激动剂刺激后的浓度变化;比较不同浓度地塞米松预处理后10min与对照组之间游离钙上升情况的区别。用Western blot方法,分析气道平滑肌细胞内抑制型磷脂酶C(phospho-PLCβ-ser1105)含量的变化。设立RU486及CHX对照组,排除基因组作用在该反应中的影响。结果:GCs温浴10min,能够明显降低乙酰胆碱引起的ASMCs细胞内[Ca2+]i峰值。并能够明显上调ASMCs内抑制型PLC含量。这些反应不受RU486和CHX影响。结论:GCs能够通过非基因组作用快速抑制刺激物引起的气道平滑肌的收缩反应,这一效应的实现可能是通过抑制PLC分子活性,使其下游的[Ca2+]i浓度降低实现的。

三苯氧胺对人结肠癌细胞增殖的影响及其机理的探讨

目的 :探讨三苯氧胺 (TAM)对人结肠癌细胞增殖的影响及其机理。方法 :采用钙离子荧光指示剂flour 3/Am ,流式细胞仪动态检测TAM作用后人结肠癌细胞内游离钙离子 ([Ca2 +]i)水平的变化 ,同时用MTT比色法测定细胞增殖情况。结果 :①TAM使细胞内 [Ca2 +]i水平在 1分钟内上升 ,以后维持在一个较高水平(349 97nM) ,与静息状态细胞内 [Ca2 +]i水平 (10 7 88nM)相比有显著性差异 (P <0 0 5 )。②TAM对癌细胞的增殖有抑制作用 ,其浓度与细胞增殖率呈显著性相关 (r=- 0 95 7,P <0 0 5 )。结论 :TAM有抑制人结肠癌细胞增殖的作用 ,其作用机理除通过竞争性结合雌激素受体来抑制雌激素的作用外 ,还可通过诱导细胞内 [Ca2 +]i水平升高 ,抑制Ca2 +依赖蛋白激酶C和钙调蛋白 ,从而抑制癌细胞的生长。

血管紧张素Ⅱ引起血管平滑肌细胞内Ca^(2+)浓度变化机制的研究

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)调节血管平滑肌细胞(VSMC)内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的作用机制。方法应用改进的组织块贴壁法分离培养大鼠主动脉VSMC。采用Fluo-3/AM负载,应用confocal显微镜观察VSMC内[Ca2+]i的变化。实验分为对照组和三磷酸肌醇受体系统(IP3Rs)阻断剂2-APB组。结果胞外无钙的情况下AngⅡ可引起一个快速、明显的[Ca2+]i升高,而2-APB组[Ca2+]i仅轻度升高,与对照组比较有显著差异(P<0.05)。结论AngⅡ与其受体AT1结合,激活IP3RS系统促进细胞内储备钙释放,调节VSMC内[Ca2+]i变化。

雌三醇对人结肠癌细胞增殖的影响及其机理探讨

目的 探讨雌三醇 (E3)对人结肠癌细胞增殖的影响及其机理。方法 采用钙离子荧光指示剂 flour- 3/Am ,流式细胞仪动态检测 E3作用后 ,人结肠癌细胞内游离钙离子 [Ca2 + ]i水平的变化 ,同时用 MTT比色法测定细胞增殖情况。结果 1E3使细胞内 [Ca2 + ]i水平在 1分钟内下降 ,以后维持在一个较低水平 (2 7.88nmol/ L ) ,与静息状态细胞内[Ca2 + ]i水平 (94.4nmol/ L)相比有显著性差异 (P<0 .0 5 )。2 E3对癌细胞有促增殖作用 ,其浓度对数值与细胞增殖率呈显著性正相关 (r=0 .975 ,P<0 .0 5 ) ,其中 1× 10 - 5 mmol/ L浓度的 E3促增殖作用最大。结论 E3有促人结肠癌细胞增殖作用 ,但不引起细胞内 [Ca2 + ]i水平升高。 E3的促癌细胞增殖作用未见与经钙离子通道引起的非基因的快速调节作用有关 ,推测是基因调节作用的结果。

他莫昔芬对人胰腺癌细胞增殖的影响及其分子机制

目的:探讨他莫昔芬(TAM)对人胰腺癌细胞增殖的影响及其机制。方法:采用钙离子荧光指示剂flour3/Am,流式细胞仪动态检测TAM作用后人胰腺癌细胞(CapanⅡ)内游离钙离子([Ca2+]i)水平的变化,同时用MTT比色法测定细胞增殖情况。结果:TAM使细胞内[Ca2+]i水平上升,与静息状态细胞内[Ca2+]i水平相比差异有统计学意义,P<005。高浓度的TAM对癌细胞的增殖有抑制作用。结论:TAM有抑制人胰腺癌细胞增殖的作用,其作用机制除通过竞争性结合雌激素受体来抑制雌激素的作用外,还可通过诱导细胞内[Ca2+]i水平升高,抑制Ca2+依赖蛋白激酶C和钙调蛋白,从而抑制癌细胞的生长。

次声对视网膜微血管内皮细胞胞浆[Ca^(2+)]i水平的影响

目的通过检测次声暴露前后视网膜微血管内皮细胞(BREC)胞浆[Ca2 +]i水平的改变 ,对次声致大鼠血 -视网膜屏障通透性改变的细胞内信号转导途径进行初步探讨。方法采用荧光探针Flu-3研究次声及BKCa 开放剂NS -1619干预下BREC胞浆[Ca2 +]i水平的改变。结果次声暴露导致细胞内钙库释放Ca2 +,同时观察到NS-1619外钙依赖性地增加[Ca2 +]i。结论次声引起[Ca2 +]i升高 ,通过细胞收缩成份引起内皮细胞主动收缩 ,从而达到对血 -视网膜屏障的调节效应。

地塞米松快速抑制气道平滑肌内游离钙升高实验初探

目的 通过对平滑肌细胞行地塞米松快速预处理,拟证实糖皮质激素对平滑肌细胞内游离钙离子浓度[Ca^2＋]i升高有快速抑制作用.方法 原代培养的大鼠平滑肌细胞,比较不同浓度地塞米松预处理后10 min与对照组之间游离钙上升情况的区别.利用Fura-2/AM显微荧光检测技术,检测肌细胞内[Ca^2＋]i在受到激动剂刺激后的浓度变化;同时设立RU486及CHX对照组,排除基因组作用在该反应中的影响.结果 地塞米松温浴10 min,能够明显降低Ach引起的气道平滑肌细胞内[Ca^2＋]i峰值.以上反应均不能被RU486和CHX影响或者逆转.结果 地塞米松能够通过非基因组作用快速抑制Ach引起的气道平滑肌细胞内[Ca^2＋]i浓度升高.

地塞米松与胰岛素合用促进去甲肾上腺素合成及其释放机制研究

胰岛素和地塞米松近来被证实可能在胰岛素抵抗过程中与交感神经系统兴奋有关。将以PC12细胞为研究对象,探讨地塞米松与胰岛素及两者合用对于PC12细胞去甲肾上腺素合成及释放的影响及其机制。在给予相应药物孵育24h后,使用荧光分光光度计检测胞内游离钙离子和去甲肾上腺素含量等指标变化。胰岛素与地塞米松共同作用时,PC12细胞合成及释放的NE较两者单用有显著性上升,胞内多巴胺含量较单用胰岛素时有明显下降;α-甲基-对位酪氨酸和米非司酮可明显拮抗地塞米松在此过程中的作用;尼莫地平和肝素可分别明显阻断胰岛素和地塞米松对胞内游离钙离子的影响。结果表明:地塞米松可以与胰岛素分别通过电压门控型钙通道的IP3受体两种不同途径进一步增加PC12细胞内游离钙离子,并通过酪氨酸羟化酶、多巴胺β-羟化酶和糖皮质激素核受体途径来促进去甲肾上腺素合成及释放。

雾化吸入氯胺酮及地塞米松对哮喘大鼠白细胞介素-13的影响

支气管哮喘是一种由肥大细胞、嗜酸粒细胞、巨噬细胞、Th2型细胞等多种细胞介导的慢性变态反应性气道炎性疾病。哮喘的发病机制复杂，其中气道炎症导致气道反应性增高及气道通气受限是其主要发病机制。有研究表明，氯胺酮可以防止重症哮喘的恶化，改善哮喘患者的肺功能。白细胞介素-13（IL-13）由活化的肥大细胞、Th2型细胞和自杀伤细胞分泌，在哮喘气道炎症和气道高反应发病机制中起着重要作用。钙离子是重要的细胞信号转导分子，细胞内游离钙离子浓度（[Ca^2＋]i）升高可激活T淋巴细胞。吸入糖皮质激素是治疗哮喘的主要方法。本研究拟通过比较哮喘大鼠雾化吸入氯胺酮、地塞米松后IL-13及淋巴细胞[Ca^2＋]i的变化，探讨氯胺酮及地塞米松抗炎效应是否与IL-13有关。

问号钩端螺旋体磷脂酶C鉴定及其诱导巨噬细胞凋亡机制

目的：确定问号钩端螺旋体（简称钩体） LB361基因产物磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C （ phosphatidylinositol phospholipase C ，L-PI-PLC）功能及其诱导巨噬细胞凋亡的作用与机制。方法采用生物信息学技术分析问号钩体赖型赖株LB361基因序列中PI-PLC结构功能域。采用原核表达系统表达该基因产物（ rL-PI-PLC）。采用IP3荧光偏振试验了解rL-PI-PLC水解PIP2底物产生IP3的活性。采用实时荧光定量RT-PCR及Western blot法分别检测问号钩体赖株感染人THP-1巨噬细胞时LB361基因转录、表达及分泌情况。构建LB361基因转染THP-1细胞株，分别采用激光共聚焦显微镜法和流式细胞术，检测LB361基因产物THP-1通过IP3引起内质网钙释放，从而导致细胞胞内游离钙离子浓度（[ Ca2＋] i）升高并诱导细胞凋亡的作用。结果 rL-PI-PLC能水解PIP2产生IP3，其Km和Kcat值分别为199μmol/L和8．566×10-5 S-1。问号钩体赖株感染THP-1细胞后，LB361-mRNA及L-PI-PLC蛋白表达水平显著升高并外分泌。与未转染正常细胞比较，LB361基因转染THP -1细胞中IP3浓度及[ Ca2＋] i明显升高，从而引起部分 THP-1细胞发生[ Ca2＋] i 依赖性凋亡。结论问号钩体LB361基因产物是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，该酶在问号钩体感染巨噬细胞过程中可引起[ Ca2＋] i升高而导致细胞凋亡。

三(2-氯乙基)磷酸酯诱导肝细胞线粒体毒性的研究

[目的]研究三(2-氯乙基)磷酸酯[tris(2-chloroethyl)phosphate,TCEP]对肝细胞线粒体功能的影响。[方法]用0.00(溶剂对照组)、3.12、12.50、50.00和200.00 mg/L TCEP分别处理人正常肝细胞(L02细胞)和人肝癌细胞(Hep G2细胞)24 h和48 h。测定细胞活力、线粒体内活性氧水平、线粒体DNA拷贝数、线粒体膜电位和胞内游离钙(Ca2+)水平以及胞内ATP的浓度。[结果]与相应溶剂对照组相比,在24 h,200.00 mg/L TCEP处理组L02细胞活力降低(P<0.05),≥12.50 mg/L TCEP处理组Hep G2细胞活力降低(P<0.05);在48 h,50.00 mg/L和200.00 mg/L TCEP处理组两种细胞活力降低(P<0.05)。所有TCEP处理组两种细胞的线粒体DNA拷贝数均减少(P<0.05或P<0.01)。在24 h,所有TCEP处理组两种细胞的线粒体膜电位均下降(P<0.05或P<0.01)。在24 h,200.00 mg/L TCEP处理组两种细胞胞内游离Ca2+水平均升高(P<0.01);在48 h,50.00 mg/L和200.00 mg/L TCEP处理组两种细胞胞内游离Ca2+均升高(P<0.01)。在24 h和48 h,200.00 mg/L TCEP处理组L02胞内ATP水平降低(P<0.05);在24 h,50.00 mg/L和200.00 mg/L TCEP处理组Hep G2胞内ATP浓度下降(P<0.05或P<0.01)。[结论]一定浓度的TCEP可致肝细胞线粒体损伤和线粒体功能指标异常,提示TCEP有肝细胞线粒体毒性。

地塞米松快速抑制气道平滑肌细胞收缩的机制初探

目的通过对平滑肌细胞进行地塞米松快速预处理，拟证实糖皮质激素（glucocorticoids，GC）对气道平滑肌细胞内三磷酸肌醇（trisphosphate，IP3）和细胞内游离钙离子（[Ca^2＋]i）浓度升高有快速抑制作用。方法原代培养的大鼠气道平滑肌细胞，比较不同浓度地塞米松预处理后10min与对照组之间游离钙上升情况的区别。利用离子交换层析液闪法和Fura-2／AM显微荧光检测技术，分别检测肌IP3和[Ca^2＋]i在受到激动剂刺激后的浓度变化；同时设米非司酮（mifepristone，Ru486）及放线菌酮（cycloheximide，CHX）对照组，排除基因组作用在该反应中的影响。结果用GC温浴大鼠气道平滑肌细胞10min，能够明显降低刺激物引起的气道平滑肌细胞内IP3和[Ca^2＋]i峰值。以上反应均不能被RU486和CHX影响或者逆转。结论GC能够通过非基因组作用快速抑制刺激物引起的气道平滑肌的收缩反应，使细胞内IP3和[Ca^2＋]i浓度降低。GC对于气道平滑肌的收缩可能存在着快速抑制作用，并且这一作用是通过非基因组机制实现的。

电磁脉冲对海马神经元的损伤效应及其对[Ca^(2+)]_i的影响

目的 观察电磁脉冲(EMP)对海马神经元的损伤效应及其对[Ca2+ ]i的影响,以深入探讨EMP致脑损伤的机制。方法 EMP辐射条件为6×104V/m,脉冲上升时间为20ns,脉宽为30μs,频率为2. 5脉冲/min,作用2min。原代培养的海马神经元经EMP辐射后,采用MTT法对细胞活力进行测定;FACS法检测细胞凋亡和坏死;Fluo 3 AM荧光探针负载、激光共聚焦显微镜扫描测定神经元胞内游离钙离子浓度,即[Ca2+ ]i。结果 细胞被EMP辐射后0~6h活力明显下降(P<0. 05), 12h开始回升, 24h基本接近正常水平;EMP辐射后0~12h细胞凋亡率显著升高,坏死也有增加;EMP辐射后即刻引起神经元内的Ca2+荧光强度明显增加。结论 EMP致海马神经元活力下降、凋亡增加、胞内钙超载。