婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统的构建

目的 构建婴儿双歧杆菌 /胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统。方法 PCR扩增胞嘧啶脱氨酶 (CD)基因 ,TSS法在大肠杆菌JM 10 9中扩增 pGEX 1LambdaT质粒 ,EcoRⅠ和BamHⅠ对CD基因和pGEX 1LambdaT质粒分别进行双酶酶切。琼脂糖电泳凝胶分离并切取其中 4.9kb和 1.3kb两个片段长度的凝胶。凝胶DNA提取试剂盒提取其中所含的DNA片段 ,T4DNA连接酶连接这两个片段 ,最后用电穿孔法将重组片段转染婴儿双歧杆菌 ,并挑选阳性菌落 ,提取质粒双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果 应用电穿孔法转染婴儿双歧杆菌 ,获得含 6.2kbp重组质粒的阳性转染婴儿双歧杆菌。 结论 成功构建婴儿双歧杆菌 /胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统。

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因联合黄连素对直肠癌细胞的杀伤作用

目的：探讨黄连素联合腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因（A＆CD）对直肠癌细胞的体外杀伤作用。方法：用重组腺病毒介导外源CD基因转染到人直肠癌细胞株HR-8348，检测病毒的转导效率和CD基因表达。用四甲基偶氮唑盐（MTT法）检测黄连素联合Ad-CD基因对HR-8348细胞存活率及体外旁观者效应的影响。结果：在250μg／ml5-氟胞嘧啶（5-FC）浓度下，0．1、0．3、3．0、30．0μmol／L浓度的黄连素联合5-FC对直肠癌细胞生长抑制率分别为27．70%、42．4％、52．3％、56．3％。3．0μmol／L浓度的黄连素可作为参考用药浓度。在转染和未转染CD基因的HR-8348混合体系中，黄连素联合CD／5-FC对直肠癌细胞具有更强的抑制作用。结论：黄连素可以增强自杀基因系统对直肠癌细胞的杀伤作用，可作为一种增效剂应用于直肠癌的治疗。

胞嘧啶脱氨酶基因修饰神经干细胞及其表达的离体实验研究

目的 探讨胞嘧啶脱氨酶 (Cytimidinedeaminase ,CD)基因修饰神经干细胞及其基因表达。方法 通过构建真核表达质粒pCMVCD ,限制性内切酶消化鉴定后 ,采用Lipofectamine 2 0 0 0脂质体介导法转染新生大鼠室管膜下区神经干细胞 (Neuralstemcells ,NSCs) ,G418筛选阳性克隆 ,加入不同浓度的 5 氟胞嘧啶 ( 5 Flourocytosine ,5 FC) ,MTT比色法测定NSCs的生存率。结果 本实验成功地培养并鉴定了神经干细胞 ,并将CD基因成功地转染了神经干细胞 ,G418阳性NSCs对低浓度 5 FC高度敏感。

胞嘧啶脱氨酶基因旁观者效应与宿主免疫状态关系

目的 :研究胞嘧啶脱氨酶自杀基因 (E .Coli.cytosingedeaminasegene ,EC CD)旁观者效应与宿主免疫状态的关系。方法 :CT2 6细胞分别接种于Balb/c小鼠及Balb/cnu/nu裸鼠皮下 ,每只动物接种相互分离的两处 ,在其中一处瘤体内接种AdCMVCD ,腹腔给予氟胞嘧啶 (5 fluorocytosine ,5 FC) ,观察肿瘤体积的变化。并用FCM检测肿瘤浸润淋巴细胞CD3、CD4、CD8的表达情况。结果 :Balb/c小鼠中 ,治疗组接种病毒侧瘤体积为 2 4 95 2± 898 6 5mm3 ,其对侧为 2 5 74 8± 339 0 5mm3 ,均明显小于对照组 (P =0 0 0 9,P =0 0 12 )。Balb/cnu/nu裸鼠中 ,治疗组接种病毒侧瘤体积为 2 4 32 6± 36 8 5 3mm3 ,明显小于对照组(P =0 0 15 ) ,而其对侧为 396 0 9± 12 80 76mm3 ,明显大于治疗组接种侧 (P =0 0 4 9) ,但与对照组两侧间均无差异。FCM显示Balb/cnu/nu裸鼠体内肿瘤浸润淋巴细胞主要是CD3+、CD4 +的淋巴细胞 ,而Balb/c小鼠体内肿瘤主要是CD3+、CD8+的淋巴细胞。结论 :EC CD/ 5 FC系统的旁观者效应特别是远距离旁观者效应与宿主免疫状况有关 ,在免疫健全宿主中旁观者效应较强。

癌胚抗原启动子控制胞嘧啶脱氨酶基因体外对结肠癌细胞专一性杀伤

目的 :研究癌胚抗原 (CEA)启动子是否能控制大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (EC CD)基因在CEA阳性结肠癌细胞中专一性表达和杀伤结肠癌细胞。方法 :构建由CEA启动子驱动的含EC CD基因的重组腺病毒载体AdCEACD与由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的含EC CD基因的腺病毒载体AdCMVCD ,分别感染CEA阳性的人结肠癌细胞株Lovo细胞和CEA阴性的Hela细胞 ,用RT PCR法检测受染细胞中EC CD基因的表达 ,并用MTT法检测感染后细胞对 5 氟胞嘧啶 (5 FC)的敏感性。结果 :Lovo细胞在AdCMVCD及AdCEACD感染后均有EC CDmRNA表达 ,且对 5 FC的敏感性明显增强 ,Hela细胞在AdCMVCD感染后有EC CDmRNA表达 ,对 5 FC的敏感性增强 ,而在AdCEACD感染后则没有EC CDmRNA表达 ,5 FC对其亦无杀伤作用。结论 :CEA启动子能够控制EC CD基因专一性地在CEA阳性的结肠癌细胞中表达 ,从而实现EC

构建携带胞嘧啶脱氨酶基因骨髓间充质干细胞及其对胶质瘤细胞的体外抑制作用

背景:转染胞嘧啶脱氨酶基因的骨髓间充质干细胞能有效地将化疗前药5-氟尿嘧啶转化成具有细胞毒性的化疗药物5-氟尿嘧啶,并在体外对胶质瘤细胞有显著的生长抑制作用。目的:探讨以骨髓间充质干细胞为基因治疗载体表达外源基因胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤C6细胞增殖的影响。方法:分离、培养小鼠间充质干细胞,构建胞嘧啶脱氨酶基因与GFP联合的慢病毒载体,通过慢病毒包装法将胞嘧啶脱氨酶基因及GFP转染至小鼠骨髓间充质干细胞,获得稳定表达胞嘧啶脱氨酶基因及GFP的骨髓间充质干细胞,使其与胶质瘤C6细胞共培养,在培养液中加入5-氟胞嘧啶后应用流式细胞仪检测胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤细胞的增殖影响。结果与结论:慢病毒介导的胞嘧啶脱氨酶基因及GFP基因成功转染小鼠骨髓间充质干细胞形成C57BL/6mMSC-codA/eGFP细胞,C57BL/6mMSC-codA/eGFP在5-氟胞嘧啶的作用下可引起胶质瘤C6细胞的明显凋亡,在5-氟胞嘧啶浓度为1×106μg/L条件下C6胶质瘤细胞凋亡率为60%(P<0.05)。提示,C57BL/6mMSC-codA/eGFP可将5-氟胞嘧啶转化成5-氟尿嘧啶并对C6胶质瘤细胞生长有显著的限制作用甚至是致死效应。

胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞体外杀伤作用

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞的杀伤作用。方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒感染膀胱癌细胞株Mb49细胞,RT-PCR检测CD及TK表达,MTT法测定感染病毒Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性及旁观者效应。结果RT-PCR可检测到腺病毒感染的Mb49细胞中CD及TK表达,腺病毒感染的Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性增强,且细胞存活率随前药浓度增加而明显降低,联合应用杀伤效果更强。在混合培养细胞中转染细胞为10%时,GCV组、5-FC组、GCV+5-FC组细胞存活率分别为(79.55±0.88)%、(77.17±3.38)%、(49.21±1.78)%,有较强的旁观者效应。结论腺病毒载体能有效转导CD-TK融合双自杀基因在膀胱癌细胞中表达,CD-TK融合双基因系统对膀胱癌细胞有更强杀伤效果和更明显的旁观者效应,优于单基因系统,值得进一步研究。

mdrl启动子调控胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因对卵巢癌裸鼠耐药移植瘤的抑制作用

目的：观察人多药耐药基因mdr1启动子调控的胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合自杀基因（CD：：upp）对紫杉醇耐药卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及对荷瘤裸鼠生存时间的影响。方法：建立卵巢癌耐药及非耐药细胞的裸鼠模型，将含mdr1-CD：：upp的重组腺病毒0．1ml（1×10^9pfu／ml）注入裸鼠皮下移植瘤体内，腹腔内注射5-氟胞嘧啶（5-FC），观察各组裸鼠肿瘤生长速度及存活时间。结果：实验组裸鼠移植瘤明显受到抑制，与对照组的差异有统计学意义（P〈0．05）。实验组荷瘤裸鼠的生存时间明显延长，对照组在69天内全部死亡，差异有统计学意义（P〈0．001）。结论：mdr1启动子调控的CD：：upp基因能特异性地抑制卵巢癌裸鼠耐药移植瘤的生长并延长生存时间。

Survivin启动子介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的抗肿瘤研究

目的探讨Survivin启动子介导的CD/5-FC自杀系统的抗肿瘤效果。方法利用Survivin启动子替换p EGFP-N1载体上的巨细胞病毒(CMV)启动子,构建重组表达载体p Sur P-EGFP,通过报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达确定Survivin启动子的特异性;将酿酒酵母的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因克隆在p Sur P-EGFP中,构建成重组载体p Sur P-CD,转染肿瘤细胞后利用毛细管电泳仪检测前药5-氟胞嘧啶(5-FC)的转化效率,同时分析肿瘤细胞的凋亡。结果 GFP的表达表明Survivin启动子具有较好的肿瘤靶向性;毛细管电泳检测表明CD能够有效地将5-FC转化为5-FU,显微镜观察和流式分析表明了Survivin启动子介导的CD的抗肿瘤效果。结论 Survivin启动子能有效地介导CD自杀基因的表达,具有较好的靶向性抗肿瘤效果。

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因联合α-IFN治疗肾癌的实验观察

目的:探讨腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因联合α-IFN对肾癌的治疗作用.方法:含CD基因重组腺病毒感染人肾癌细胞株786-0,用噻唑蓝(MTT)方法观察加用5-氟胞嘧啶(5-Fc)或联用α-IFN后的杀伤效应.建立786-0裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射腺病毒,腹腔注射5-Fc(500mg/kg),联合应用α-IFN时行瘤内注射,观察肿瘤生长情况.结果:在对感染腺病毒的786-0细胞的体外杀伤实验中,CD+5-Fc组的细胞存活率为(67.40±1.27)%,α-IFN组的细胞存活率为(68.65±1.45)%,CD+5-Fc+α-IFN组细胞存活率为(34.67±2.38)%,(P=0.000),两者之间有协同效应.在786-0裸鼠移植瘤模型中,CD+5-Fc联合α-IFN能够显著抑制肿瘤的生长.结论:腺病毒为载体的自杀基因CD加前体药5-Fc联合α-IFN可以明显增强抗肾癌效果.

胞嘧啶脱氨酶对表达不同水平癌胚抗原的大肠癌细胞株的杀伤作用

目的:探讨特异性胞嘧啶脱氨基酶(cytosine deaminase,CD)/5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)系统对表达不同水平癌胚抗原(CEA)的大肠癌细胞株的选择性杀伤作用。方法:用脂质体法将逆转录病毒载体G1CEACDNa和pCD2分别转导入大肠癌LoVo和SW480细胞株。将转染成功pCD2、G1CEACDNa及未转基因之LoVo和SW480细胞分别接种到BALB/c裸鼠皮下。成瘤2周后,每天腹腔注射500mg/kg的5-FC,观察治疗效果。治疗21d后处死动物,肿瘤标本称重后,以RT-PCR法检测目的基因在肿瘤组织中的表达;显微镜下观察肿瘤病理学变化。结果:目的基因在肿瘤组织中获稳定表达。治疗21d后,在LoVo细胞肿瘤中,G1CEACDNa阳性组和pCD2阳性组肿瘤分别重(60.8±15.3)mg和(410.5±56.3)mg,与未转基因组[(3018.5±453.5)mg]比较均有明显差异(p<0.01,t=4.512; P<0.01,t=3.320);G1CEACDNa阳性组与pCD2阳性组比较,亦有显著差异(P<0.05,t=2.375)。在SW480肿瘤细胞中,G1CEACDNa阳性组和pCD2基因阳性组肿瘤分别重(356.5±23.5)mg和(463.5±56.9)mg,与对照组[(3263.5±450.6)mg]比较有显著差异(P<0.01,t=4.547;P<0.01,t=4.475),但G1CEACDNa阳性组与pCD2基因阳性组之间无明显差异(P>0.05)。

含胞嘧啶脱氨酶基因的靶向腺病毒载体的构建及应用

目的 建立癌胚抗原 (CEA )启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶基因 (CD )自杀基因的腺病毒载体AdCEACD ,使CD基因只能在CEA阳性的细胞中表达。方法 采用同源重组法在人胚肾细胞株 2 93细胞中重组腺病毒 ,用点杂交、PCR法进行鉴定 ,并进行纯化和滴度测定 ,分别感染CEA阳性和CEA阴性的细胞 ,采用MTT法检测感染细胞对 5 Fc的敏感性。结果 重组腺病毒中含有CEA基因及CD基因 ,纯化后滴度可以达到 5 .0× 10 11pfu/ml ,CEA阴性的Hela细胞感染AdCMVCD后对 5 Fc很敏感 ,而感染AdCEACD后不能被 5 Fc杀伤 ,与之相反 ,CEA阳性的Lovo细胞感染AdCMVCD和AdCEACD后有相似的表达活性 ,均对5 Fc敏感。AdCEACD/ 5 Fc系统有明显的“旁观者”效应。结论 本实验建立的CEA启动子驱动的含CD自杀基因的腺病毒载体AdCEACD ,能使CD基因专一性地在CEA阳性细胞中表达 ,有助于对CEA阳性的肿瘤细胞靶向性自杀基因治疗。

胞嘧啶脱氨酶基因突变体D314A对人结肠癌细胞的抑制作用

目的:构建大肠埃希菌胞嘧啶脱氨酶(E.colicytosine deaminase,EC-CD)基因突变体D314A(即EC-CD基因开放阅读框第314位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸)并研究其抗肿瘤作用。方法:构建含EC-CD基因的真核表达质粒pcDNA3.1-CDwt,应用点突变技术将pcDNA3.1-CD中EC-CD基因开放阅读框第314位氨基酸的碱基由A突变为C,即构成pcDNA3.1-CDD314A。用LipofectamineTM2000将EC-CD基因或D314A基因转入人结肠癌细胞系LoVo细胞,以G418筛选出稳定表达的阳性克隆LoVo-CDwt及LoVo-CDD314A。应用MTT法检测EC-CD基因及D314A基因对LoVo细胞的直接杀伤作用及旁观者效应。结果:成功构建EC-CD基因突变体D314A并经测序确认。LoVo细胞转染EC-CD基因及D314A基因后均能表达相应的mRNA,Lovo-CDD314A细胞对5-FC的IC50为(85.13±0.60)mmol/L,显著低于LoVo-CDwt细胞的(689.76±0.45)μmol/L,(P=0.000);在旁观者试验中,当LoVo-CDwt细胞和LoVo-CDD314A细胞比例均为30%时,细胞存活率分别为(48.5±0.49)%与(17.3±0.40)%(P=0.000)。结论:EC-CD基因突变体D314A的抗LoVo细胞作用显著强于野生型EC-CD基因,有望成为新的肿瘤基因治疗候选基因。

胞嘧啶脱氨酶基因联合干扰素-酌基因治疗大肠癌的实验研究

目的:研究胞嘧啶脱氨酶基因(EC鄄CD)联合干扰素-酌(INF鄄酌)基因对大肠癌的治疗作用。方法:以重组腺病毒载体AdCMVCD转导EC鄄CD基因;AdCMVINF鄄γ转导鼠INF鄄γ基因。采用体外培养和小鼠移植瘤实验,研究EC鄄CD基因联合INF鄄γ基因对CT26大肠癌细胞的杀伤作用。结果:AdCMVIFN鄄γ感染对CT26细胞生长有明显的抑制作用。AdCMVCD/5鄄FC联合AdCMVINF鄄γ可以增强对CT26细胞的杀伤作用,IC50明显变小(P<0.01),肿瘤生长明显抑制(P<0.01)。组织学检查显示,EC鄄CD基因与INF鄄γ基因联合治疗后肿瘤内有大量淋巴细胞浸润。结论:EC鄄CD基因联合INF鄄γ基因可以明显增强抗肿瘤效应,局部淋巴细胞浸润增加可能起到一定作用。

含胞嘧啶脱氨酶基因重组腺病毒的构建及其对肺癌抑制作用的研究

目的:构建含胞嘧啶脱氨酶基因(CD基因)重组腺病毒(AdE1CMVCD),并鉴定;用自杀基因治疗系统(AdE1CMVCD/5-FC)对肺癌进行抑瘤作用的实验研究。方法:体外实验:用不同稀释度的AdE1CMVCD转染人肺癌细胞H460后分别加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法测OD570nm值,按公式计算细胞生长抑制率;体内实验:建立T739鼠肺腺癌荷瘤模型,瘤体内导入AdE1CMVCD,腹腔注射5-FC,观察实验组及各对照组瘤体及生存期差异。结果:该系统转染的人肺癌H460细胞生长抑制率随前药5-FC浓度及感染重组病毒剂量的增加而增加,最大抑制率达61.29%,同时观察到了明显的旁杀伤作用;在体内实验中观察到AdE1CMVCD/5-FC对小鼠肺癌有明显的生长抑制作用,明显延长荷瘤小鼠生存期。结论:本文建立的AdE1CMVCD/5-FC系统体内外对肺癌均有明显的抑制作用,为临床肺癌基因治疗的应用奠定了基础。

Lipofectamine介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞(英文)

背景:自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷。胞嘧啶脱氨酶即可产生强大的旁观者效应。目的:观察脂质体介导真核表达载体胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达。设计、时间及地点:细胞学基因水平体外实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。材料:SPF级C57BL纯系小鼠6只,体质量18～20g,用于骨髓间充质干细胞的分离培养。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供。LipofectamineTM 2000脂质体为Invitrogen产品。方法:取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,提取质粒DNA,对质粒plRES2-cGFP1-CD进行XhoI和BamHI双酶切,用于转染。取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用LipofectamineTM 2000介导法转染第3代鼠骨髓间充质干细胞。主要观察指标:重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测鼠骨髓间充质干细胞表面标记表达,荧光倒置显微镜观察细胞转染36,48h后胞嘧啶脱氨酶基因的表达。结果:质粒plRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0～1.5kb处有1条带出现,符合胞嘧啶脱氨酶基因长度。流式细胞仪检测显示细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性。plRES2-AcGFP1-CD基因转染36h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白表达,48h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强。结论:脂质体介导的胞嘧啶脱氨酶基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48h后达峰值。

胞嘧啶脱氨酶基因对移植静脉平滑肌增生的抑制作用

目的 研究胞嘧啶脱氨酶基因 / 5 -氟胞嘧啶自杀基因系统对移植静脉平滑肌增生的抑制作用 .方法 将含 Ad-CMVCD(CMV为启动子、含胞嘧啶脱氨酶基因的腺病毒载体 )的病毒上清加压注入兔颈外静脉管腔 (两端及分支结扎 ) ,半小时后剪下该静脉并用 Cuff技术移植于兔颈动脉上 ,以单纯移植组和 Ad CMVL acz(含 β-半乳糖苷酶基因的重组腺病毒载体 )为对照 ,4 wk后取静脉桥行 RT- PCR以确定转染效率 .通过光镜和电镜观察平滑肌细胞的形态变化 ,并对血管桥外径、管腔、内膜、中膜面积和外弹力膜周长及管腔相对丧失率进行定量分析 ,统计学处理以观察抑制内膜增生、防治血管再狭窄的效果 .结果 治疗组的内膜平滑肌增生明显 <两个对照组 .管腔丧失率亦明显减少 ,Ad CMVCD组为 (3.6 8±0 .4 2 ) % ,单纯移植组为 (9.6 8± 0 .4 1) % ,(P<0 .0 1) .结论 Ad CMVCD自杀基因系统对移植静脉平滑肌的增生有抑制作用 .

胞嘧啶脱氨酶自杀基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞及其表达研究

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞的方法及其表达效果。方法采用脂质体法将CD基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞,G418筛选阳性克隆(U251-CD),采用RT-PCR、免疫细胞化学染色、流式细胞仪(FCM)凋亡分析和高效液相色谱(HPLC)等方法检测CD基因的表达及其功能。结果CD基因成功转染U251细胞,G418筛选获得阳性克隆,RT-PCR证实阳性细胞有CD基因表达,抗-CD-抗体免疫细胞化学法显示细胞浆染色阳性,U251-CD细胞加入5-氟胞嘧啶(5-FC)后,FCM显示细胞凋亡峰,HPLC可检测到5-FC培养液内有5-氟尿嘧啶(5-FU)产生。结论CD基因能够在U251细胞表达,并具备将5-FC转变为5-FU的功能,造成肿瘤细胞凋亡,CD-5-FC系统可作为恶性脑胶质瘤辅助治疗手段之一。

酵母菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶基因治疗系统对K562B细胞杀伤效应的初步研究

目的 :克隆酵母菌胞嘧啶脱氨酶 (YCD)基因 ,观察 YCD/ 5氟胞嘧啶 (YCD/ 5 - FC)系统对转基因肿瘤细胞的杀伤效应。 方法 :扩增 YCD基因并构建 YCD基因重组逆转录病毒载体 ;载体转染包装细胞获得高滴度病毒并转染高致瘤细胞K5 6 2 B,筛选并鉴定阳性转基因克隆 ;以 MTT法检测 5 - FC对 YCD转基因细胞的杀伤效应 ,测定转基因细胞裂解产物对5 - FC→ 5 - FU的转化。结果 :PCR法扩增出全长 YCD基因 ,经测序证实序列正确 ;构建了 MSCV - YCD- IRES- EGFP逆转录病毒载体 ,载体转染包装细胞Ф NX- A,获得滴度为 3.5× 10 6 CFU / m l的逆转录病毒 ;病毒转染 K5 6 2 B,转染率为 30 % ,经筛选获得转基因阳性克隆 YCD- K 5 6 2 B,RT- PCR检测显示 YCD- K5 6 2 B有 YCD基因的 m RNA表达 ,其细胞裂解产物可使 5 - FC转化为 5 - FU,表明其有 CD酶活性 ;MTT法检测低浓度 5 - FC(15μmol/ L )作用 96 h对 YCD- K5 6 2 B有明显的杀伤效应。 结论 :YCD/ 5 - FC系统对转基因肿瘤细胞有明显的杀伤效应。

携带重组胞嘧啶脱氨酶基因的婴儿双歧杆菌对鼠黑色素瘤B16-F10细胞的杀伤效应研究

目的 将携带胞嘧啶脱氨酶 (CD)基因的重组婴儿双歧杆菌应用于肿瘤的基因导向酶前药物疗法 ,利用厌氧菌趋低氧代谢的特性构建一种全新的肿瘤靶向基因治疗系统。方法 PCR扩增CD目的基因、酶切后连接目的基因与质粒片段 ,电穿孔法将重组体转染婴儿双歧杆菌 ,筛选阳性克隆抽提质粒 ,酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,并体外检测CD基因的表达。结果 携带自杀基因CD的重组载体成功地被转染进婴儿双歧杆菌 ,并能表达CD酶活性 ,当加入CD酶底物 5 -FC后 ,显示出对小鼠黑色素瘤B16 -F10细胞明显的杀伤效应。结论 成功构建了携带自杀基因CD的重组婴儿双歧杆菌 ,重组菌在体外显示出对B16