构建携带胞嘧啶脱氨酶基因骨髓间充质干细胞及其对胶质瘤细胞的体外抑制作用

背景:转染胞嘧啶脱氨酶基因的骨髓间充质干细胞能有效地将化疗前药5-氟尿嘧啶转化成具有细胞毒性的化疗药物5-氟尿嘧啶,并在体外对胶质瘤细胞有显著的生长抑制作用。目的:探讨以骨髓间充质干细胞为基因治疗载体表达外源基因胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤C6细胞增殖的影响。方法:分离、培养小鼠间充质干细胞,构建胞嘧啶脱氨酶基因与GFP联合的慢病毒载体,通过慢病毒包装法将胞嘧啶脱氨酶基因及GFP转染至小鼠骨髓间充质干细胞,获得稳定表达胞嘧啶脱氨酶基因及GFP的骨髓间充质干细胞,使其与胶质瘤C6细胞共培养,在培养液中加入5-氟胞嘧啶后应用流式细胞仪检测胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤细胞的增殖影响。结果与结论:慢病毒介导的胞嘧啶脱氨酶基因及GFP基因成功转染小鼠骨髓间充质干细胞形成C57BL/6mMSC-codA/eGFP细胞,C57BL/6mMSC-codA/eGFP在5-氟胞嘧啶的作用下可引起胶质瘤C6细胞的明显凋亡,在5-氟胞嘧啶浓度为1×106μg/L条件下C6胶质瘤细胞凋亡率为60%(P<0.05)。提示,C57BL/6mMSC-codA/eGFP可将5-氟胞嘧啶转化成5-氟尿嘧啶并对C6胶质瘤细胞生长有显著的限制作用甚至是致死效应。

含胞嘧啶脱氨酶基因的靶向腺病毒载体的构建及应用

目的 建立癌胚抗原 (CEA )启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶基因 (CD )自杀基因的腺病毒载体AdCEACD ,使CD基因只能在CEA阳性的细胞中表达。方法 采用同源重组法在人胚肾细胞株 2 93细胞中重组腺病毒 ,用点杂交、PCR法进行鉴定 ,并进行纯化和滴度测定 ,分别感染CEA阳性和CEA阴性的细胞 ,采用MTT法检测感染细胞对 5 Fc的敏感性。结果 重组腺病毒中含有CEA基因及CD基因 ,纯化后滴度可以达到 5 .0× 10 11pfu/ml ,CEA阴性的Hela细胞感染AdCMVCD后对 5 Fc很敏感 ,而感染AdCEACD后不能被 5 Fc杀伤 ,与之相反 ,CEA阳性的Lovo细胞感染AdCMVCD和AdCEACD后有相似的表达活性 ,均对5 Fc敏感。AdCEACD/ 5 Fc系统有明显的“旁观者”效应。结论 本实验建立的CEA启动子驱动的含CD自杀基因的腺病毒载体AdCEACD ,能使CD基因专一性地在CEA阳性细胞中表达 ,有助于对CEA阳性的肿瘤细胞靶向性自杀基因治疗。

胞嘧啶脱氨酶基因联合干扰素-酌基因治疗大肠癌的实验研究

目的:研究胞嘧啶脱氨酶基因(EC鄄CD)联合干扰素-酌(INF鄄酌)基因对大肠癌的治疗作用。方法:以重组腺病毒载体AdCMVCD转导EC鄄CD基因;AdCMVINF鄄γ转导鼠INF鄄γ基因。采用体外培养和小鼠移植瘤实验,研究EC鄄CD基因联合INF鄄γ基因对CT26大肠癌细胞的杀伤作用。结果:AdCMVIFN鄄γ感染对CT26细胞生长有明显的抑制作用。AdCMVCD/5鄄FC联合AdCMVINF鄄γ可以增强对CT26细胞的杀伤作用,IC50明显变小(P<0.01),肿瘤生长明显抑制(P<0.01)。组织学检查显示,EC鄄CD基因与INF鄄γ基因联合治疗后肿瘤内有大量淋巴细胞浸润。结论:EC鄄CD基因联合INF鄄γ基因可以明显增强抗肿瘤效应,局部淋巴细胞浸润增加可能起到一定作用。

胞嘧啶脱氨酶基因突变体D314A对人结肠癌细胞的抑制作用

目的:构建大肠埃希菌胞嘧啶脱氨酶(E.colicytosine deaminase,EC-CD)基因突变体D314A(即EC-CD基因开放阅读框第314位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸)并研究其抗肿瘤作用。方法:构建含EC-CD基因的真核表达质粒pcDNA3.1-CDwt,应用点突变技术将pcDNA3.1-CD中EC-CD基因开放阅读框第314位氨基酸的碱基由A突变为C,即构成pcDNA3.1-CDD314A。用LipofectamineTM2000将EC-CD基因或D314A基因转入人结肠癌细胞系LoVo细胞,以G418筛选出稳定表达的阳性克隆LoVo-CDwt及LoVo-CDD314A。应用MTT法检测EC-CD基因及D314A基因对LoVo细胞的直接杀伤作用及旁观者效应。结果:成功构建EC-CD基因突变体D314A并经测序确认。LoVo细胞转染EC-CD基因及D314A基因后均能表达相应的mRNA,Lovo-CDD314A细胞对5-FC的IC50为(85.13±0.60)mmol/L,显著低于LoVo-CDwt细胞的(689.76±0.45)μmol/L,(P=0.000);在旁观者试验中,当LoVo-CDwt细胞和LoVo-CDD314A细胞比例均为30%时,细胞存活率分别为(48.5±0.49)%与(17.3±0.40)%(P=0.000)。结论:EC-CD基因突变体D314A的抗LoVo细胞作用显著强于野生型EC-CD基因,有望成为新的肿瘤基因治疗候选基因。

含胞嘧啶脱氨酶基因重组腺病毒的构建及其对肺癌抑制作用的研究

目的:构建含胞嘧啶脱氨酶基因(CD基因)重组腺病毒(AdE1CMVCD),并鉴定;用自杀基因治疗系统(AdE1CMVCD/5-FC)对肺癌进行抑瘤作用的实验研究。方法:体外实验:用不同稀释度的AdE1CMVCD转染人肺癌细胞H460后分别加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法测OD570nm值,按公式计算细胞生长抑制率;体内实验:建立T739鼠肺腺癌荷瘤模型,瘤体内导入AdE1CMVCD,腹腔注射5-FC,观察实验组及各对照组瘤体及生存期差异。结果:该系统转染的人肺癌H460细胞生长抑制率随前药5-FC浓度及感染重组病毒剂量的增加而增加,最大抑制率达61.29%,同时观察到了明显的旁杀伤作用;在体内实验中观察到AdE1CMVCD/5-FC对小鼠肺癌有明显的生长抑制作用,明显延长荷瘤小鼠生存期。结论:本文建立的AdE1CMVCD/5-FC系统体内外对肺癌均有明显的抑制作用,为临床肺癌基因治疗的应用奠定了基础。

胞嘧啶脱氨酶基因对移植静脉平滑肌增生的抑制作用

目的 研究胞嘧啶脱氨酶基因 / 5 -氟胞嘧啶自杀基因系统对移植静脉平滑肌增生的抑制作用 .方法 将含 Ad-CMVCD(CMV为启动子、含胞嘧啶脱氨酶基因的腺病毒载体 )的病毒上清加压注入兔颈外静脉管腔 (两端及分支结扎 ) ,半小时后剪下该静脉并用 Cuff技术移植于兔颈动脉上 ,以单纯移植组和 Ad CMVL acz(含 β-半乳糖苷酶基因的重组腺病毒载体 )为对照 ,4 wk后取静脉桥行 RT- PCR以确定转染效率 .通过光镜和电镜观察平滑肌细胞的形态变化 ,并对血管桥外径、管腔、内膜、中膜面积和外弹力膜周长及管腔相对丧失率进行定量分析 ,统计学处理以观察抑制内膜增生、防治血管再狭窄的效果 .结果 治疗组的内膜平滑肌增生明显 <两个对照组 .管腔丧失率亦明显减少 ,Ad CMVCD组为 (3.6 8±0 .4 2 ) % ,单纯移植组为 (9.6 8± 0 .4 1) % ,(P<0 .0 1) .结论 Ad CMVCD自杀基因系统对移植静脉平滑肌的增生有抑制作用 .

携带重组胞嘧啶脱氨酶基因的婴儿双歧杆菌对鼠黑色素瘤B16-F10细胞的杀伤效应研究

目的 将携带胞嘧啶脱氨酶 (CD)基因的重组婴儿双歧杆菌应用于肿瘤的基因导向酶前药物疗法 ,利用厌氧菌趋低氧代谢的特性构建一种全新的肿瘤靶向基因治疗系统。方法 PCR扩增CD目的基因、酶切后连接目的基因与质粒片段 ,电穿孔法将重组体转染婴儿双歧杆菌 ,筛选阳性克隆抽提质粒 ,酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,并体外检测CD基因的表达。结果 携带自杀基因CD的重组载体成功地被转染进婴儿双歧杆菌 ,并能表达CD酶活性 ,当加入CD酶底物 5 -FC后 ,显示出对小鼠黑色素瘤B16 -F10细胞明显的杀伤效应。结论 成功构建了携带自杀基因CD的重组婴儿双歧杆菌 ,重组菌在体外显示出对B16

胞嘧啶脱氨酶基因联合放射治疗恶性肿瘤的研究进展(文献综述)

以胞嘧啶脱氨酶基因为主的自杀基因治疗已日渐引起肿瘤研究者的兴趣 ,近几年出现的基因联合放疗对恶性肿瘤的治疗 ,使两者之间的优势得以互补 ,大大增强了对肿瘤治疗的效果。本文就胞嘧啶脱氨酶基因联合放疗对恶性肿瘤治疗的作用机制、基因转导方法、靶向性表达、基因显像、治疗效果等方面予以综述。

含胞嘧啶脱氨酶基因重组腺病毒体内抑瘤作用的研究

目的 :构建含胞嘧啶脱氨酶基因 (CD基因 )重组腺病毒AdE1CMVCD ,用自杀基因治疗系统AdE1CMVCD/5_氟胞嘧啶 (5_FC)对小鼠肺腺癌进行体内抑瘤作用的实验研究。方法 :建立T739小鼠肺腺癌荷瘤模型 ,瘤体内导入AdE1CMVCD ,腹腔注射5_FC ,观察各组小鼠瘤体和生存期差异以及瘤体组织切片病理变化。结果 :从实验中观察到AdE1CMVCD/5_FC系统对小鼠肺腺癌有明显的抑制生长作用 ,与对照组荷瘤小鼠相比 ,治疗组荷瘤小鼠生存期明显延长。结论 :AdE1CMVCD与5_FC联合在体内对肺癌有明显的抑制作用 。

胞嘧啶脱氨酶基因联合放射对食管癌细胞株的杀伤作用

目的:观察大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶/5 氟胞嘧啶(CD/5- FC)自杀基因系统对食管癌细胞株(EC109细胞)的杀伤效应以及与放射联合应用时对食管癌肿瘤细胞协同杀伤效应。方法:采用PCR方法,从大肠杆菌基因组DNA中扩增出CD基因;构建重组真核载体pcDNA3. 1 CD;用脂质体转染法转染食管癌EC109细胞,观察CD/5-FC体系对EC109细胞的杀伤效应和杀伤时的旁观者效应以及对放射的增敏效应。结果:RTP-CR分析结果表明CD基因已转入EC109细胞并开始转录。体外实验证实, 5-FC对转CD基因后的食管癌细胞株有明显的细胞毒作用,CD/5 FC体系对肿瘤细胞对放射增敏效果明显,加5-FC及放射治疗组细胞存活曲线低于单纯加前药5-FC对照组或单纯放射对照组。结论:CD/5-FC体系对肿瘤细胞的自杀效应具有旁观者效应和放射增敏效果。

X线联合胞嘧啶脱氨酶基因对结肠直肠肿瘤细胞的杀伤作用

目的 提高基因疗法对结肠直肠肿瘤的疗效。 方法 以绿色荧光蛋白 (GFP)基因作为报告基因 ,观察在X线作用下GFP基因对结肠直肠肿瘤细胞的转染效率及表达时间 ;用克隆形成试验观察X线对胞嘧啶脱氨酶 (CD)基因转染的影响 ;同时用细胞存活率测定试验检测X线联合CD和 5 氟胞嘧啶对结肠直肠肿瘤细胞的杀伤作用。 结果 X线提高超螺旋质粒对结肠直肠肿瘤细胞的转染效率 2～ 4倍 ,可提高线性质粒转染效率 3 0倍。肿瘤细胞的存活率 :转染CD基因组LoVo细胞为 85 % ,83 4 8细胞为 88% ;剂量X线联合空载体组为 10 % ;LD90 剂量X线联合CD基因组 ,LoVo细胞为 9% ,83 4 8细胞为 11% ,加上X线作用 ,细胞总体存活率仅为 1%。 结论 X线联合自杀基因可有效地杀伤结肠直肠肿瘤细胞 。

联合应用胸苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因对MCF-7细胞的杀伤作用

目的 研究双自杀基因 (胞嘧啶脱氨酶基因CD和胸苷激酶基因HSV tk)的应用对乳腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法 脂质体法将CD和HSV tk双自杀基因转染入PA3 17细胞 ,用其病毒上清转染乳腺癌细胞MCF 7,G418筛选出阳性细胞MCF 7/CD +tk ,然后加入不同浓度的 5 氟胞嘧啶 (5 Fc)或 /和丙氧鸟苷 (GCV ) ,MTT法观察其杀伤作用 ;将不同比例的MCF 7/CD +tk和MCF 7细胞混合 ,联合应用 5 Fc和GCV杀伤 ,观察其旁观者效应。结果 单独应用 5 Fc或GCV均能对MCF 7/CD +tk细胞产生明显的杀伤效应 ,联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用 ;当阳性细胞比例达到 2 0 %时即可对半数混合细胞产生杀伤作用。结论 双自杀基因的应用对乳腺癌细胞具有明显的杀伤作用 ,其旁观者效应明显。

白介素-2基因增强胞嘧啶脱氨酶基因的抗结肠癌效应

目的探讨联合应用白介素(IL)-2基因与胞嘧啶脱氨酶基因(EC-CD)对结肠癌的治疗效应。方法分别以重组腺病毒载体AdCMVCD、AdCEACD转导EC-CD基因;AdCMVIL-2转导人IL-2基因。分别在体外、内(Balb/cnu/nu裸鼠)研究EC-CD基因联合人IL-2基因对LOVO细胞肿瘤的治疗作用。结果LOVO细胞受AdCMVIL-2感染后,细胞生长有比较明显的抑制。AdCEACD/氟胞嘧啶(5-FC)联合AdCMVIL-2可增强对LOVO细胞的细胞毒作用(P=0.001),肿瘤生长明显抑制(P=0.000),联合治疗的效果与单用AdCMVCD/5-FC接近(P=0.815)。结论联合IL-2基因可明显增强EC-CD基因抗肿瘤效应,且可弥补靶向性载体治疗效率较差的缺点。

联合应用胸苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因对胆囊癌细胞的杀伤作用

目的 研究双自杀基因的应用对胆囊癌细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法 脂质体 法将CD和HSV tk双自杀基因转染入PA317细胞,用其病毒上清转染胆囊癌细胞GBC SD,G418筛 选出阳性细胞GBC SD/CD+tk,应用不同浓度的5 FC或(和)GCV,MTT法观察其杀伤作用;将不 同比例的GBC SD/CD+tk和GBC SD细胞混合,联合应用5 FC和GCV杀伤,观察其旁观者效应。 结果 单独应用5 FC或GCV均能对转染阳性的GBC SD/CD+tk细胞产生明显的杀伤效应,联合 应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用;当阳性细胞比例达到20%时即可对半数细胞产生杀 伤作用。结论 双自杀基因的应用对胆囊癌细胞具有明显的杀伤作用,其旁观者效应明显。

腺病毒转导的胞嘧啶脱氨酶基因联合5-氟胞嘧啶对人视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用

目的 研究毒性基因联合前体药物对人视网膜色素上皮 ( human retinal pigment epithelium,HRPE)细胞增殖的抑制作用 ,探讨防治增生性玻璃体视网膜病变 ( proliferative vitreoretinopathy,PVR)的有效方法。 方法 分别将不同浓度胞嘧啶脱氨酶 ( cytosine deaminase,CD)基因、5 -氟胞嘧啶 ( 5 -fluorocytosine,5 - FC)加入第 3代体外培养的 HRPE培养液中 ,以 x-半乳糖甘酶 ( x- galactosidae,X- gal)与基因乳糖操纵子 ( lac operon,L ac Z)标记 CD基因 ,通过检测 HRPE阳性感染率衡量腺病毒的转导效率。甲基四唑盐比色法 ( methylthiazolyl- terazollium,MTT)检测细胞的增殖抑制率。 结果 CD基因对 HRPE的转染率呈剂量依赖性。 CD基因转染阳性的 HRPE细胞可将 5 - FC转变为 5 -氟尿嘧啶 ( 5 - fluorouracil,5 -FU) ,有效抑制体外培养的 HRPE细胞增殖。本研究中所用的毒性基因联合前体药物治疗系统对 RPE细胞生长无明显的旁观效应。 结论 腺病毒载体作为高效载体 ,可选择性将目的基因转入细胞中。为药物防治 PVR形成提供了新思路。

酵母菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因系统对人原代T细胞的作用

目的:酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因(YCD)是新型自杀基因,利用重组逆转录病毒载体(RV),将YCD高效导入人原代T细胞,并在体内外探讨转基因T细胞的功能及"自杀"效应。方法:构建RV载体MSCV-YCD-puroR,瞬时质粒共转染法制备RV,流动感染法或Retronectin+离心法感染人原代T细胞,嘌呤霉素筛选获得T-YCD-puroR,检测转基因T细胞对肿瘤细胞的杀伤及细胞因子分泌功能,在体外和SCID小鼠体内,探讨前体药物5氟胞嘧啶(5-FC)对T-YCD-puroR细胞的杀伤效应等。结果:病毒滴度为(5.0±3.7)×106TU/mL。流动转染法对人原代T细胞的基因导入率46.0%±9.6%,2轮离心+Retronectin法的基因导入率为60.3%±7.6%(n=3)。经嘌呤霉素筛选48h获得T-YCD-puroR细胞,其基因阳性率96.7%±1.5%,并可大量扩增。与野生T细胞比较,T-YCD-puroR细胞杀伤K562肿瘤细胞的能力及细胞因子分泌功能无统计学意义。体外实验显示,与野生T细胞比较,T-YCD-puroR细胞对puromycin的IC50上升了304.9倍(0.071mg/Lvs22.3mg/L),对5-FC的IC50下降了133.3倍(656.0μmoL/Lvs4.9μmoL/L)。T-YCD-puroR细胞静脉接种于SCID小鼠,7d后每只小鼠腹腔注射5μmoL的5-FC,连续7d,首次给药24h后即可观察到SCID小鼠外周血中CD45+细胞显著下降(P<0.01)。结论:YCD自杀基因导入对人原代T细胞功能无显著影响,T-YCD-puroR细胞可以在体内外被5-FC有效杀伤。本研究为进一步研究打下了良好的基础。

热化疗对结肠癌LOVO细胞胞嘧啶脱氨酶基因表达的影响

目的:探讨温热疗法对转染胞嘧啶脱氨酶基因的基因表达有无影响。方法:脂质体法将质粒G1CEACDNa转染结肠癌LOVO细胞,G418筛选抗体克隆并扩增,给予前药5-氟胞嘧啶(5-FC)进行热化疗;以beta-actin为内参照用实时荧光定量PCR检测热化疗前后CD基因表达量有无变化。结果:实时荧光定量PCR(Real-TimeRT-PCR)检测得到热化疗前CD基因表达的ct值29.53±1.1974,beta-actinct值20.82±2.7385;热化疗后CD基因表达的ct值30.285±1.201,beta-actinct值21.225±2.237;行△△Ct法进行相对定量比较无明显差异(P>0.05,t=1.4521,ν=38)。结论:温热疗法对转染G1CEACDNa的LOVO细胞CD基因的表达无明显影响。

胞嘧啶脱氨酶基因联合5-Fc治疗结肠癌的实验研究

目的 研究胞嘧啶脱氨酶基因 (CD)联合前体药物 5 氟胞嘧啶 (5 Fc)对结肠癌细胞的生长抑制作用。方法 应用逆转录病毒介导的方法 ,将逆转录病毒载体pLXSN中含有大肠杆菌CD基因的重组质粒pCD2 转染到病毒包装细胞PA317后 ,感染人结肠癌细胞株SW1116。对转基因的细胞进行RT PCR检测和体内外药物敏感实验。结果 获得了稳定表达EC CD基因的结肠癌细胞株SWCD2 ,与野生型SW1116细胞相比 ,SWCD2 细胞对基本无毒性的原药 5 Fc的敏感性增加 ,5 0 %细胞生长抑制率 (IC50 )浓度由野生型SW1116细胞的 16 0 0 0 μmol/L降低到SWCD2 的 6 6 μmol/L。经 5 Fc治疗后 ,SWCD2 细胞的裸鼠移植瘤生长明显缩小。结论 CD基因联合 5 Fc对人结肠癌细胞具有实验性基因治疗作用。

人端粒酶逆转录酶启动子调控的携带胞嘧啶脱氨酶基因腺病毒载体的构建

目的构建由人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶自杀基因(cytosine deaminase gene,CD)的复制缺陷型腺病毒载体。方法首先构建带有hTERT启动子及CD基因的穿梭质粒pSU-TP-CD,然后与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转染到293细胞,通过细胞内同源重组法获得复制缺陷性病毒。结果经PCR鉴定证明,成功构建了含有hTERT启动子及CD基因的重组腺病毒。结论成功构建了携带hTERT启动子和CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,为下一步进行基因治疗研究奠定了基础。

人端粒酶逆转录酶启动子调控的胞嘧啶脱氨酶基因对宫颈癌细胞株的选择性杀伤作用研究

目的探讨由人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因的复制缺陷型腺病毒,对宫颈癌细胞的选择性杀伤作用。方法将自行构建复制的缺陷型腺病毒载体Ad-hTERTp-CD,由端粒酶逆转录酶启动子调控的携带胞嘧啶脱氨酶基因的重组腺病毒,分别感染人宫颈癌细胞株Hela(研究组)及人胚肺成纤维细胞(humanembryo lung fibroblast cells,hELF)(对照组),采用不同滴度重组腺病毒及不同浓度氟胞嘧啶(5-flurocy-tosine,5-FC)作用于Hela细胞(研究组)后,通过MTT法,检测研究组和对照组受染细胞的存活率,观察分析腺病毒载体对两种细胞的杀伤作用。结果 MTT法检测到研究组细胞存活率随病毒滴度和氟胞嘧啶浓度的增加,不断降低;而同样处理,对人胚肺成纤维细胞(对照组)也有部分杀伤作用,但远较Hela细胞(研究组)弱,两组比较,差异有显著意义(P<0.01)。结论本实验构建的复制缺陷型腺病毒Ad-hTER-Tp-CD对Hela细胞具有靶向杀伤作用。