YebF作为载体蛋白所引导的重组蛋白胞外分泌表达途径的研究进展

大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主菌之一,但是由于它大多将重组蛋白分泌到菌体内部,导致重组蛋白不能正确折叠或者被降解而失去活性,使得目的蛋白的提取和纯化过程较为繁琐。解决这些问题的方法之一就是将重组蛋白分泌到胞外培养基中,这样不仅有利于蛋白的正确折叠,也会极大地简化目的蛋白的提取和纯化过程。近年发现的YebF蛋白是由大肠杆菌分泌到胞外培养基中的可溶内源性短肽,大小为10.8kDa;虽然其功能未知,但是YebF可作为载体蛋白与重组蛋白融合从而引导异源蛋白的胞外分泌表达。综述了YebF蛋白的结构及其胞外分泌表达的机理,总结了应用YebF分泌途径成功胞外表达异源蛋白的例子,阐述了利用YebF胞外分泌途径提高目的蛋白表达量的策略,为更多重组蛋白的高效分泌表达提供了理论基础。

雷珠单抗的大肠埃希菌胞外分泌表达、纯化及结构表征

抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体可抑制新生血管的形成和生长,在年龄相关性黄斑变性眼科疾病的临床治疗中具有重要应用价值,特别是已上市的商品名为雷珠单抗的VEGF抗体Fab片段,在市场上取得巨大成功。本研究探索了雷珠单抗在大肠埃希菌中的胞外分泌表达技术,所表达的产品利用SDS-PAGE、Western Blot、肽谱图全序列分析和纳米差示扫描量热法(Nano DSC)等手段进行了初步的结构表征。结果显示,本研究成功实现了雷珠单抗的大肠埃希菌胞外分泌表达,经过进一步的Capto L亲和色谱获得了有正确氨基酸序列的Fab产品,经质谱分析具有正确的二硫键配对,且具有与标准品相似的热稳定性,为其进一步的工业生产奠定了基础。

利用α-溶血素系统分泌表达重组人白介素-6

目的构建基于大肠杆菌α-溶血素(HlyA)分泌机制的原核胞外分泌表达载体系统,将重组人白介素6(rhIL-6)分泌至胞外培养基中。方法利用分子克隆手段,从引起人泌尿道感染的大肠杆菌UPECJ96菌株染色体上获得了α-溶血素(HlyA)系统的分泌功能基因,与外源基因片段hIL-6一起克隆至pQE30骨架载体,构建了胞外分泌表达质粒pISQ,转化E.coliTop10,诱导表达后通过Western blot检测培养上清中hIL-6的表达。结果获得了与设计完全一致的pISU载体,Western blot结果显示,可以在pISQ/E.coli Top10培养液上清中检测到与His-hIL6-HlyAs融合蛋白相对分子质量大小一致的特异条带。结论大肠杆菌HlyA分泌系统操纵子能够在染色体和质粒间传递,rhIL-6能够通过该系统被特异地分泌至胞外培养基中,以可溶形式存在,为后续生物学研究奠定了基础。