小鼠抗寨卡病毒包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体的制备

目的制备小鼠抗寨卡病毒(ZIKV)包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体。方法首先构建ZIKV Eecto的原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,将其转化至大肠杆菌感受态BL21后,利用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。重组Eecto蛋白以包涵体形式表达,经过变性、复性和超滤获得纯化的蛋白。将Eecto蛋白3次免疫后,获得多克隆抗体血清,进行效价测定,并利用ZIKV prME真核表达质粒转染的HEK293T细胞进行Western blot法和免疫荧光法分析。取效价较高的小鼠脾脏制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法获取分泌抗体的杂交瘤细胞,并进一步制备腹水。对腹水进行抗体效价测定、亚类分析。以ZIKV同属病毒日本脑炎病毒(JEV)、黄热病病毒(YFV)、登革病毒1-4(DENV1-4)、蜱传脑炎病毒(TBEV)的Eecto为包被抗原,利用ELISA分析ZIKV单克隆抗体的交叉反应性,进一步对效价高、特异性强的抗体进行特异性分析。结果成功构建了原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,并获得纯化的Eecto蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性;制备筛选得到1D6、4F11、4H7、4F8四株单克隆抗体,其中三株(1D6、4H7、4F8)为IgGκ型抗体,一株(4F11)为IgMκ,1D6腹水效价大于1∶108;其中1D6和4H7为ZIKV特异性抗体,与其他黄病毒无交叉反应。结论成功制备了小鼠抗ZIKV Eecto单克隆抗体,为后续建立ZIKV检测方法及致病机制研究提供了实验材料。

小鼠抗西方马脑炎病毒E2蛋白胞外区(E2ecto)单克隆抗体的制备

目的制备针对西方马脑炎病毒(WEEV)E2包膜糖蛋白胞外区(E2ecto)的小鼠特异性单克隆抗体(mAb)。方法构建表达WEEV E2ecto的原核表达质粒pET-28a-WEEV E2ecto,转化BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达,主要为包涵体形式。包涵体纯化后,通过变性、复性、超滤等制备得到E2ecto蛋白;以QuickAntibody-Mouse5W为佐剂,将E2ecto蛋白肌肉免疫BALB/c小鼠,间隔21 d加强1次。免疫后35 d,取效价超过1×104的小鼠腹腔接种1次E2ecto蛋白,3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。通过有限稀释法筛选稳定分泌特异性mAb的杂交瘤细胞,接种小鼠腹腔后制备腹水;利用ELISA检测抗体亚型及腹水中抗体效价的水平;将真核表达质粒pCAGGS-WEEV-CE3E2E1转染BHK-21细胞,通过免疫荧光法(IFA)鉴定上述mAb的生物学活性;利用东方马脑炎病毒(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的E2ecto蛋白进行ELISA鉴定上述抗体的特异性。结果成功表达及复性获得了纯化的WEEV E2ecto蛋白;制备了3G6G10、3D7G2、3B9E8、3D5B7四株mAb,其亚型分别为IgG2c(κ)、IgM(κ)、IgM(κ)、IgG1(κ);3G6G10、3B9E8、3D7G2腹水抗体效价均为105,3D5B7达到107;该4株抗体与VEEV和EEEV等其他脑炎甲病毒无交叉反应。结论成功制备了4株特异性结合WEEVE2ecto的小鼠mAb。

森林脑炎病毒包膜糖蛋白胞外区的表达、纯化及免疫原性分析

目的构建森林脑炎病毒(TBEV)森张株包膜糖蛋白E胞外区的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中诱导表达、纯化及初步分析其免疫原性。方法从GenBank下载TBEV森张株E蛋白胞外区基因序列(Eecto),密码子优化后交由公司合成,通过双酶切的方法克隆至pET28a载体,获得重组质粒pET28a-TBEV-Eecto。经过酶切和测序分析后,将正确的重组质粒转化BL21(DE3)感受态,用1 mmol/L异丙基-β-D-硫化半乳糖苷诱导表达后通过SDS-PAGE分析重组E蛋白胞外区的表达形式。纯化的包涵体用6 mol/L盐酸胍进行变性溶解,用含有非表面活性剂NDSB-201的缓冲液进行复性,之后超滤浓缩、镍柱亲和层析纯化及蛋白印迹鉴定。将获得的纯化TBEV-Eecto蛋白免疫BALB/c小鼠,利用免疫血清进行蛋白印迹、免疫荧光实验分析其特异性。结果重组质粒pET28a-TBEV-Eecto经酶切后的片段与预期大小一致,测序分析正确。重组蛋白TBEV-Eecto主要以包涵体形式表达,经过盐酸胍变性溶解、NDSB-201复性、超滤及镍柱亲和纯化后获得纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blotting分析均显示其与预期大小一致。纯化的TBEV-Eecto蛋白免疫小鼠血清可特异性识别真核表达的TBEV-PrME蛋白,提示TBEV-Eecto具有良好的免疫原性。结论成功构建TBEV森张株E蛋白胞外区的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达。纯化的TBEV-Eecto蛋白具有较好的免疫原性,为森林脑炎的血清学诊断方法和亚单位疫苗研制提供了基础。

EB病毒潜伏膜蛋白1胞外区融合蛋白的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中表达EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)胞外肽段与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,并用该融合表达蛋白检测EB病毒相关鼻咽癌(NPC)患者血清中的特异性抗体。方法:用BamHⅠ和EcoRⅠ将含LMP1胞外区重组基因的质粒pMD18-LMP1双酶切后,克隆到pGEX-4T-2中。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列分析后转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,表达的蛋白经谷胱甘肽S-转移酶柱亲和层析纯化,纯化的蛋白经Westernblot法检测鉴定。结果:重组表达质粒经酶切鉴定为阳性,核酸序列分析正确。SDS-PAGE和Western blot结果显示表达的重组蛋白分子质量约为32.2ku,此抗原能够与鼻咽癌患者血清中抗体特异性结合。结论:成功获得了LMP1胞外区重组基因表达的蛋白,并证明原核表达的LMP1胞外肽段保持了原有的抗原性,能够与EBV相关鼻咽癌患者血清中的抗体特异性结合。

肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段的原核表达与免疫学活性分析

目的 :利用大肠杆菌高效表达肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段 ,并分析其与相应抗体的结合活性 ,进而明确表达产物用于筛选基因工程抗体的可行性 .方法 :用PCR技术扩增出HAb18G胞外区基因片段 ,克隆入原核表达载体pGEX 4T 3中 ,筛选及鉴定阳性重组子 ,IPTGv诱导表达后对表达产物进行纯化及复性等处理 ,同时利用SDS PAGE ,Western Blot以及ELISA等方法检测蛋白表达情况及其免疫学特性 .结果 :成功构建了肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段的原核表达载体 pGEX 4T 3/HAb18GE ,并在大肠杆菌中成功实现高效融合表达 .表达蛋白Mr 4 6 0 0 0 ,表达量约占菌体总蛋白量的 4 3% ,表达产物主要以包涵体形式为主 .另外 ,表达蛋白在变性和非变性的条件下均可以与HAb18GmAb特异性结合 .结论 :原核融合表达的HAb18G胞外区片段可以替代天然的HAb18G蛋白 ,以用做抗原来筛选新型的基因工程抗体 .

FSHR胞外区抗原的二级结构预测和B细胞表位预测

目的:分析卵泡刺激素受体(Follicle stimulating hormone receptor,FSHR)胞外区蛋白的二级结构,在线预测FSHR胞外区潜在的B细胞表位。方法:利用DNAStarProtein软件对FSHR胞外区蛋白的二级结构和表面特性进行分析,联合在线B细胞表位预测,预测FSHR胞外区蛋白可能的抗原表位。合成预测的B细胞表位肽,对其抗原性进行鉴定。结果:FSHR胞外区蛋白可能的抗原表位区域为17～34、42～44、116～122、142～147、179～193、239～241、266～270、279～282、288～307。选择4个区域合成肽段表位区域能与免疫抗血清发生抗原特异性反应。结论:应用多参数成功预测了FSHR胞外区蛋白抗原的B细胞表位。

牛IgG2Fc受体(boFcγ2R)胞外区基因原核表达载体的构建及其表达

目的:构建牛Fcγ2R胞外区基因的原核表达载体,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法:提取健康成年牛的白细胞总RNA,经RT-PCR扩增牛Fcγ2R胞外区基因片段,并将其克隆到载体pGEM-TEasy,经限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切鉴定及序列测定后,再将其亚克隆入原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET-2R,转化E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果:获得682bp的编码牛Fcγ2R胞外区基因片段。以构建的重组质粒pET-2R转化E.coliBL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为30000的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21(DE3)的胞质中,Western blot检测表明该蛋白能和牛IgG2结合。结论:成功地构建了原核表达载体pET-2R,并表达出重组蛋白。为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。

犬CTLA-4胞外区的分子克隆、表达和对犬细小病毒VP2的免疫佐剂作用

【目的】探索犬细胞毒性T细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)胞外区作为免疫佐剂的可行性。【方法】根据已发表序列设计引物,用RT-PCR扩增CTLA-4胞外区编码序列,用PCR扩增犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2蛋白主要抗原表位基因片段VP2S,将VP2S克隆入含和不含CTLA-4胞外区基因片段的原核表达质粒pQE-31;用获得的重组质粒pQE-CTLA-4-VP2S和pQE-VP2S转化大肠杆菌,并进行诱导表达;用相同剂量的重组蛋白VP2S和CTLA-4-VP2S免疫小鼠,用间接ELISA和血凝抑制试验比较两个免疫组的抗体水平。【结果】经过30次循环PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳显示预期大小的扩增产物;序列测定结果显示,克隆的毕格犬CTLA-4胞外区与已发表序列的核苷酸同源性为99.2%,氨基酸序列同源性为98.4%,结合B7分子的六肽基序(MYPPPY)无变化;VP2S与已发表CPV VP2的核苷酸序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为98.6%;经IPTG诱导后,两种重组大肠杆菌表达预期的29kDa VP2S和42kDa CTLA-4-VP2S重组蛋白,两者均能被CPV抗血清识别;间接ELISA和血凝抑制试验结果显示,CTLA-4-VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第2周,抗体高峰期为初免后第4周,而VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第4周,抗体高峰期为初免后第5周,两个试验组高峰期ELISA抗体效价和血凝抑制抗体效价分别相差100倍和10倍。【结论】犬CTLA-4胞外区可作为分子佐剂促进CPV VP2蛋白抗体的产生。

CTLA4胞外区蛋白在GS115酵母中的表达和活性鉴定

目的 获取具有生物学活性的CTLA4胞外区蛋白。方法 构建CTLA4胞外区 (CTLA412 5)蛋白的酵母表达载体 ,在GS115酵母细胞中表达。通过硫酸铵粗分离和离子交换层析等 ,获取纯化的目的蛋白 ,并在CTLL2细胞中鉴定活性。结果 质粒在GS115酵母中可较高水平地表达CTLA4胞外区蛋白。经纯化后的蛋白可抑制IL 2刺激的CTLL2细胞的增殖。结论 GS115酵母可高效表达具有生物学活性的CTLA4胞外区蛋白。

1人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体。方法以pUCm-TLR4质粒为模板,运用PCR技术扩增TLR4胞外区目的基因片段,片段回收后经酶切连接穿梭质粒pAdTrack-CMV上,获得重组腺病毒质粒pAdTrack-CMV-TLR4.通过KpnⅠ和HindⅢ双酶切,测序鉴定后,将鉴定正确的质粒经PmeI酶切线性化后,转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态细菌BJ5183中,进行同源重组,卡那抗性筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR技术,Western blot等方法鉴定重组腺病毒,并进行病毒滴度测定。结果人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体构建正确,病毒滴度为3.2×109pfu/mL。结论成功构建了人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体,为下一步实验奠定基础。

FSHR胞外区基因片段的原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建人卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)胞外区的原核表达载体,并用纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备抗血清。方法采用RT-PCR克隆人FSHR胞外区,将其克隆到原核表达载体pET32a(+),并通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达,所获得的包涵体蛋白通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化重组蛋白,并用SDS-PAGE和蛋白印迹法鉴定。结果PCR扩增出1 047 bp目的基因片段,测序证实克隆的基因序列与GenBank中的FSHR序列相符。工程菌pET32 a(+)/FSHR胞外区经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr约为58 000,与预期的一致。其表达形式为不溶性包涵体,此包涵体蛋白通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化,纯化的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带。该蛋白免疫小鼠制备抗血清,抗体效价为1∶12 800,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论获得了人FSHR胞外区融合蛋白及特异性多克隆抗体,为进一步研究FSHR蛋白的功能奠定了基础。

狂犬病病毒糖蛋白胞外区基因的原核表达、纯化及鉴定

利用RT-PCR技术,将狂犬病病毒株ERA株糖蛋白胞外区基因分两段进行扩增,经克隆与序列分析,两片段大小分别为523,381 bp,各编码174,127个氨基酸,分子量分别为19.7,14.5 kDa。在原核表达载体pET-43a中分别克隆了这两段糖蛋白基因,将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为94,89kDa处分别出现新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。两重组蛋白主要以可溶形式表达,利用Ni2+亲和层析柱纯化了蛋白,纯度大于95%。Western-Blot分析结果显示,两种重组融合蛋白均可与兔抗RBV多抗血清反应,具有良好的反应原性。

人ICOS胞外区腺病毒载体的构建与鉴定

目的利用细菌内同源重组法构建含ICOS胞外区基因的重组腺病毒。方法用基因工程的方法将ICOS胞外区的cDNA片段插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdtrack-cmv-ICOS,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,同源重组质粒PacⅠ酶切鉴定后用脂质体转染293细胞,包装成重组体腺病毒颗粒Ad-ICOS。采用PCR方法对重组腺病毒颗粒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。通过Western Blot检测重组腺病毒感染后的293细胞上清中的ICOS胞外区蛋白。结果获得了重组人ICOS胞外区腺病毒载体颗粒。PCR检测表明重组腺病毒颗粒含有目的基因,滴度为2.1×1010pfu/ml。Western Blot检测到阳性目的条带。结论细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法。所制备的重组体腺病毒Ad-ICOS在体外能有效表达相应的基因产物,为今后对ICOS胞外区的深入研究奠定了基础。

编码人B7-2胞外区cDNA的克隆、表达及生物活性鉴定

B7 2分子是共刺激信号系统B7/CD2 8/CTLA 4中的重要成员之一 ,为了更深入地探讨B7 2分子在调控T细胞增殖、分化及相关信号传导过程中的作用 ,本研究通过聚合酶链式反应 (PCR)扩增编码人B7 2分子胞外区的cDNA ,测序后定向插入多个原核表达载体并诱导目的蛋白表达 ,用Western印迹和MTT鉴定生物活性。结果表明 :通过pGEX 4T 2载体实现了在宿主菌BL 2 1 (DE3) codenplus RIL中较高水平的表达 ,蛋白表达量为 2 0 %。经Western印迹和MTT鉴定 ,所表达及初步纯化的B7 2胞外区重组蛋白能与抗人B7 2单抗发生特异性结合 ;在抗人CD3单抗的协同下 ,B7 2胞外区重组蛋白能有效地促进外周血单核细胞的增殖。结论 :B7 2胞外区重组蛋白的获得为进一步研究B7

人CD20胞外区片段原核表达质粒的构建

ＣＤ20是Ｂ细胞表面特有的抗原结构,为一种跨膜的非糖基化蛋白。它通过参与Ｃａ2+离子通道而对Ｂ细胞的分化和成熟进行调控,同时还通过参与细胞内的酪氨酸激酶信号转导途径而对细胞周期进行调控,促进细胞通过Ｇ1期进入Ｓ期。研究发现,ＣＤ20的过度表达与细胞癌变有关,尤其...

表皮生长因子受体胞外区在哺乳动物细胞HEK293T中的分泌表达和鉴定

目的:融合表达表皮生长因子受体(EGFR)胞外功能区,为制备针对该分子的特异性抗体提供可用的靶标抗原。方法:通过PCR扩增EGFR胞外区基因,将其克隆入真核表达载体pABhFc中,重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,进行EGFR的瞬时分泌表达,纯化获得电泳纯级的分泌蛋白,并通过ELISA、Western印迹、Biacore3000系统对融合蛋白进行鉴定。结果:经测序证实扩增得到了正确的EGFR胞外区基因序列,SDS-PAGE初步确认获得了单、双体的EGFR胞外区,ELISA检测证实双体融合蛋白hFc-EGFR可与商业化的EGF特异性结合,Western印迹检测证实单体融合蛋白His-EGFR可与商业化抗体特异性结合;经Biacore3000蛋白分子相互作用系统测定,双体融合蛋白hFc-EGFR与商业化抗体爱必妥的亲和力达0.5 nmol/L。结论:利用哺乳动物细胞HEK293T分泌表达系统获得了结构正确的单、双体2种类型的EGFR胞外区融合蛋白纯品,将用于抗EGFR特异性抗体的筛选。

牛IgG Fc受体Ⅱ胞外区在大肠杆菌中的表达及特性鉴定

从牛肺巨噬细胞cDNA文库中扩增编码牛IgGFc受体Ⅱ(boFcγRⅡ)胞外区基因,PCR产物经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后,插入原核表达载体pET28a的T7启动子下游,构建重组表达质粒pETboRⅡ。以pETboRⅡ转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析诱导表达菌体可见分子量约为27kDa的蛋白条带,该表达蛋白在细胞质中主要以不溶性包涵体形式存在。Westernblotting和Dotblot检测表明,boFcγRⅡ重组蛋白在变性条件下可与牛IgG特异结合,提示牛FcγRⅡ胞外区可能存在IgG线性结合表位。

人CD_(40)L胞外区和人CTLA_4Ig双基因共表达腺病毒载体的克隆和鉴定

目的 :构建人CD40 L胞外区和CTLA4Ig双基因共表达重组腺病毒载体并鉴定。方法 :RT -PCR扩增人CD40 L胞外区片段 ,与致瘤素信号肽连接后构建穿梭质粒 ,经酶切、插入、同源重组 ,获质粒pAdshCD40 L -IRES2 -CTLA4Ig ,经 2 93细胞包装 ,获共表达双基因的腺病毒pAdvshCD40 L -IRES2 -CTLA4Ig ,并行凝胶电泳、PCR、共聚焦显微镜检测。结果 :电泳、PCR扩增出了 6 0 0bp和 4 0 0bp的特异性片段、共聚焦显微镜观察到CD40 L绿色荧光和CTLA4Ig红色荧光的共表达。结论 :成功构建了人CD40 L胞外区和CTLA4Ig共表达双基因重组腺病毒载体。