胞外表达L-天冬酰胺酶发酵条件的研究

[目的]优化胞外表达L-天冬酰胺酶工程菌的发酵条件。[方法]用正交试验研究培养基的组成,用单因素试验研究诱导条件以及通气量对酶产量的影响。[结果]发酵培养基采用8.0%玉米浆和1.0%甘油组成;诱导剂采用终浓度为0.5g/L的乳糖,扩大培养后10h加入,诱导时间为12h,通气量为0.83VVM。[结论]该研究为胞外表达L-天冬酰胺酶的工业化生产提供了参考。

信号肽对浸麻类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中胞外表达的影响

为了筛选得到利于浸麻类芽孢杆菌Paenibacillus macerans α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT酶)分泌表达的信号肽,提高α-CGT酶的分泌表达量,本研究考察了大肠杆菌中外源蛋白分泌表达常用的OmpA、PelB、OmpT和Endoxylanase四个信号肽对重组α-CGT酶在大肠杆菌中胞外表达的影响。在相同的发酵条件下,OmpA信号肽介导的分泌效果最好,发酵72 h,胞外酶活达到了32 U/mL,分别是PelB、OmpT介导效率的2.4倍和4.3倍。Endoxylanase信号肽介导的分泌效果相对较差,在胞外只能检测到很低的α-CGT酶活性,大量α-CGT酶以不可溶性的包涵体形式存在。OmpA信号肽能够有效地介导Paenibacillus macerans α-CGT酶在重组大肠杆菌中的分泌表达。

黑曲霉木聚糖酶在大肠杆菌中的胞外表达和酶学性质研究

木聚糖酶能催化木聚糖分解为低聚木糖和木单糖,对于木聚糖高效利用具有重要意义。该研究将黑曲霉(Aspergillus niger)AG11来源的β-D-1,4内切木聚糖酶(β-D-1,4 endoxylanase,xynA)分泌表达于大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),并进行了表达条件优化和酶学性质研究。最终确定xynA最佳表达条件为:诱导剂(异丙基硫代半乳糖苷)浓度0.1 mmol/L、诱导温度20℃、诱导起始OD_(600)值0.5。在该条件下,胞外xynA活力达到15.8 U/mL,较初始条件提高85.9%。重组xynA经镍柱纯化至单一条带后进行酶学性质分析。酶学性质分析表明,重组xynA比酶活力、最适反应温度及最适反应pH分别为175.1 U/mg、50℃和4.0。重组xynA在40℃半衰期为182 min,且在pH为2.0~9.0内孵育1 h保持在70%以上活性。以桦木木聚糖为底物,重组xynA的K_(m)和k_(cat)分别为3.45 g/L和58.51 s^(-1)。研究结果为xynA优良突变体的筛选和在工业生产中的应用奠定了基础。

共表达磷脂酶C促进葡萄糖异构酶在大肠杆菌中的胞外表达

磷脂酶C(PLC)能够水解细胞膜主要成分磷脂,使细胞膜通透性增强,从而能够释放出胞内物质。作者构建了PLC与天然胞内定位蛋白葡萄糖异构酶(GI)共表达的重组大肠杆菌,摇瓶发酵胞外上清液中GIC酶活达到3.4 U/m L,占胞外和胞内总酶活的93%,表明GIC成功实现了胞外表达。将胞外上清液中的GIC进行分离纯化和酶学定性,发现其比活为12.1 U/mg,最适反应温度为80℃,最适pH为10,均与对照菌单独表达的GIO性质基本一致。在此基础上,对上述重组菌进行3 L发酵罐培养,发酵周期为24 h,酶活达到17.7 U/m L,表明其良好的工业化放大生产前景。

两阶段温度控制策略以及助剂促进淀粉分支酶的胞外表达

为了促进重组淀粉分支酶在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis WB600）中的胞外表达，对重组淀粉分支酶在摇瓶水平上进行了发酵优化。首先，以胞外酶活力为指标，先后考察了初始培养基、pH、培养温度和培养时间4种因素对胞外表达的影响；然后，通过两阶段温度策略和助剂的添加进一步提高胞外表达水平。结果表明，当发酵培养基为TB、pH为7．5时，25℃培养24h后胞外酶活力达到19．9U／mL；同时，菌体生长最适温度和酶分泌的最适温度是不一致的，通过两阶段温度控制策略（即0—12h控制温度30℃，12h后温度调至25℃），胞外酶活力与单一温度条件下的最高水平（25℃）相比提高了1．4倍，达到了47．1U／mL；在此基础上，进一步添加0．05％的吐温-80，将胞外酶活进一步提高40％，达到65．8U／mL。

天冬酰胺酶胞外表达的初步研究

[目的]为降低L-天冬酰胺酶Ⅱ的生产成本提供依据。[方法]通过PCR反应扩增大肠杆菌JM109成熟区的L-天冬酰胺酶II基因(ansB),将扩增片段与pMD18-T载体连接,构建重组质粒pMD18-T-asp。对pMD18-T-asp与质粒pET-22b进行双酶切后,将它们连接起来,转化感受态细胞,筛选重组表达载体pET-22b-asp。利用重组表达载体pET-22b-asp转化BL21(DE3),并对其发酵条件以及分离、纯化工艺进行了初步研究。[结果]成功克隆长度为960 bp的L-天冬酰胺酶II基因。重组表达载体pET-22b-asp也构建成功,并在BL21中得到表达。在重组菌接入TB培养基后2 h加入IPTG、培养基的初始pH值为7.2、装液量为12%,L-天冬酰胺酶Ⅱ酶活最高。重组天冬酰胺酶的纯化收率为82%,比活力达196 U/mg。[结论]重组天冬酰胺酶的胞外表达大大简化了其分离步骤。

短小芽孢杆菌LC01漆酶基因在毕赤酵母中的胞外表达及重组漆酶酶学性质研究

为了获得表达量高、稳定性好及染料脱色效率高的细菌漆酶,通过PCR扩增出短小芽孢杆菌LC01的漆酶基因并构建重组表达载体pPICZαA-lac,转化毕赤酵母菌株SMD1168H后利用甲醇诱导培养重组菌获得重组漆酶,纯化并分析了重组漆酶的性质。重组菌株产漆酶活性在第7天达到最高,为1 390 U/L。纯化的重组漆酶分子量为65 kD,以丁香醛连氮为底物的最适反应温度和pH分别为70℃和6.8。在pH 9.0放置10 d活性没有下降,在70℃保温10 h后仍保留36%的酶活。Al^(3+)、Fe^(3+)和Mn^(2+)完全抑制漆酶活性。在介体乙酰丁香酮参与下该漆酶能够有效脱色RB亮蓝、活性黑5和靛红,在pH 9.0时6 h的脱色率达到了90%以上,表明该重组漆酶能有效应用于染料废水的脱色处理。

耐有机溶剂果糖苷酶的胞外表达、纯化和结晶

【目的】克隆表达一种Arthrobacter arilaitensis NJEM01来源的耐有机溶剂β-呋喃果糖苷酶(β-FFase),纯化并进行结晶条件的研究。【方法】构建pel B信号肽与β-FFase融合表达质粒p ET22b-pel B-bff,将其导入Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达,硫酸铵沉淀、DEAE阴离子交换色谱两步纯化重组蛋白,采用坐滴式气相扩散法对β-FFase进行结晶条件筛选和优化。【结果】构建重组质粒p ET22b-pel B-bff,通过优化诱导表达条件,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导温度30°C,诱导时间10 h,比活力高达108 U/mg,实现了果糖苷酶的胞外可溶性表达,纯化获得达到结晶纯度的β-FFase。结晶条件初筛和优化后获得可培养β-FFase晶体的条件为0.15 mol/L氯化钙,0.1 mol/L HEPES p H 6.7,26%聚乙二醇400。晶体衍射分辨率可以达到2.1?。【结论】高糖苷合成能力β-FFase表达纯化体系的构建和结晶条件的初步研究,为从结构生物学角度进一步研究果糖苷酶结构与功能的关系,定向进化提高糖苷酶转糖基活性奠定了基础。

厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达

里氏木霉(Trichoderm reesei)是重要的纤维素酶生产菌,为了显著提高其产酶性能,拟利用分子生物学技术构建高产的基因工程菌株。将前期优化后的瘤胃厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因af 2置于里氏木霉纤维二糖水解酶I强启动子Pcbh1(及其信号肽)和终止子Tcbh1之间,并进一步以pCAMBIA1300为载体骨架,构建成含潮霉素B抗性标记的重组质粒pCB-hF。以里氏木霉ZU-02为宿主,采用优化的根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒转入经萌发处理的分生孢子。以潮霉素B为抗性标记初筛到318个阳性转化子,进一步接种到以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的筛选培养基上,复筛到8株生长较快的转化子。以重组转化子基因组DNA为模板,分别进行PCR检测,均可获得目的基因片段,表明厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因已整合到里氏木霉的染色体DNA上。在摇瓶条件下,分别对8个重组转化子进行产酶试验,获得3个高产内切-β-葡聚糖酶活力的转化子。发酵培养96 h时,发酵液的内切-β-葡聚糖酶活力最高可达到126.3 IU?mL-1左右,是出发菌株的4.23倍。研究结果表明:厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因已在里氏木霉细胞中得到高效表达并实现了胞外分泌。

大黄鱼生长激素在毕赤酵母中的表达

为大量获得具有生物活性的大黄鱼生长激素(Pseucdosciaena crocea,Growth Hormone,pcGH),利用本实验室分离的天然大黄鱼生长激素基因在毕赤酵母表达系统中的表达进行了研究。把pcGH克隆到酵母整合型质粒载体中构建重组表达载体pPIC9K-pcGH,电击转化将pcGH转化进his4缺陷型毕赤酵母GSll5菌株染色体上,经甲醇诱导得以高效表达,SDS-PAGE证实了表达产物为大黄鱼生长激素,表达量约为62.5mg/L。

谷氨酸棒杆菌漆酶基因NCgl0908的克隆、表达及功能

漆酶(Laccase)是多铜氧化酶家族中的主要成员,能够催化多种酚类和芳香类化合物的氧化,因此具有很大的工业应用潜力。虽然对漆酶的研究及应用已获得一定进展,但主要集中在植物和真菌漆酶,对细菌漆酶的研究较少。研究从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中分离到一个漆酶基因NCgl0908,其全长1542 bp,编码513个氨基酸。将其氨基酸序列与几种已鉴定的细菌和真菌漆酶进行序列比对,发现它们的4个铜离子结合位点的氨基酸高度保守,推测NCgl0908是一个新的漆酶基因。把NCgl0908基因克隆入表达载体pColdⅡ,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。利用镍柱亲和层析法纯化表达产物,并以2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)作为底物检测其漆酶活性以及酶动力学参数,发现其漆酶活性为25.4 U/mL,K m为2.22×10^(-4) mol/L,V max为2.432×10^(-6) mol/(L·min)。

Alcaligenes sp.腈水解酶组成型毕赤酵母表达条件的优化

以实验室前期构建的组成型胞外表达Alcaligenes sp.腈水解酶重组菌株Pichia pastoris X33/pGAPza-rDNA-NIT为研究对象,对该菌株的发酵培养基进行筛选,以最适发酵培养基为基础,通过对发酵培养基组分和表达条件进行优化,提高腈水解酶的表达量并检测其催化性能。结果表明,甘油培养基d效果最佳,腈水解酶体积酶活可达1.03 U/L,OD600为18.36。经发酵表达条件优化后,在蛋白胨25 g/L、酵母粉10 g/L、甘油20 g/L、MgSO41 g/L、磷酸盐20 mmol/L、培养基初始pH 8.0、装液量20%、诱导温度26℃、发酵时间72 h条件下,腈水解酶体积酶活达1.75 U/L,OD600为45.7,分别是优化前的1.7倍和2.5倍。在此基础上,利用腈水解酶进行扁桃腈催化形成R-扁桃酸的进程研究,反应2h产率可达95.1%,e.e.值达100%,此结果可为工业化应用提供参考,可为腈水解酶的研究进一步奠定基础。

大肠杆菌Ⅰ型分泌表达系统研究进展及提高蛋白表达量的策略

大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主之一。利用大肠杆菌分泌途径胞外表达重组蛋白具有可促进蛋白正确折叠,有效减少包涵体形成,简化纯化工序等诸多优势,近年来备受关注。其中,大肠杆菌Ⅰ型分泌途径具有分泌表达速度快,蛋白活性高,对宿主代谢无影响等特点,是目前应用最广泛的分泌途径之一。综述了大肠杆菌Ⅰ型分泌系统的元件组成和分泌机理及提高Ⅰ型分泌系统蛋白表达量的有效策略,为重组蛋白生产应用提供了理论依据。