临床铜绿假单胞菌多重耐药株外排泵机制研究

目的研究临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌MexA-MexB-OprM外排泵的外膜蛋白OprM的表达及泵调节基因mexR突变情况。方法筛选铜绿假单胞菌多重耐药株13株和敏感菌株5株进行外膜蛋白SDS-PAGE分析,比较OprM的表达差异。聚合酶链反应(PCR)法扩增mexR基因,鉴定产物,测序。结果多重耐药菌株组OprM蛋白在相对分子量为49 kD处的各电泳条带较敏感菌株和质控菌株铜绿假单胞菌ATCC 27853的灰度明显增强,其光密度值多重耐药菌株组为157.79,敏感菌株组为132.03,两组比较,差异有显著性(t=19.345,P<0.01);多重耐药菌株mexR基因产物测序,除个别碱基插入外,以A-96→G,G-411→A,C-308→G,T-377→A 4个核苷酸点突变为主,后二者还导致了其编码的氨基酸发生改变,分别为Ala-103→Gly,Val-126→Glu。结论OprM表达增强提示MexA-MexB-OprM外排泵耐药机制参与多重耐药形成。多重耐药菌株的mexR基因均存在点突变,提示mexR基因突变引起MexA-MexB-OprM外排泵表达增强。

3所综合性医院分离的多重耐药铜绿假单胞菌外排泵MexAB-OprM的表达分析

目的分析多重耐药铜绿假单胞菌(PA)外排泵MexAB-OprM的表达,并探讨MexAB-OprM高表达与调控基因mexR、nalC和nalD突变的关系。方法利用肉汤稀释法进行头孢他啶、头孢哌酮舒巴坦、亚胺培南、环丙沙星、阿米卡星和氨曲南的敏感性试验,联合外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺(PAβN)进行外排泵的表型筛选试验;在表型筛选为阳性的PA中随机挑选7株,实时荧光定量-PCR(RT-PCR)法检测膜融合蛋白基因mexA的相对表达量;PCR扩增调控基因mexR、nalC和nalD,将扩增结果测序比对。结果耐环丙沙星、头孢他啶、氨曲南、头孢哌酮舒巴坦、亚胺培南和阿米卡星PA外排泵的表型筛选阳性率分别为96.8%、44.8%、41.4%、41.4%、40.0%、10.0%;以野生型铜绿假单胞菌(PAO1)为对照菌,mexA的相对表达量范围为1.56~10.03(2.29±0.60),属于外排泵的高表达;高表达菌株均发生mexR、nalC和nalD基因突变和氨基酸替换。结论环丙沙星的耐药以外排泵耐药机制为主,调控基因mexR、nalC和nalD的碱基突变导致了外排泵MexAB-OprM高表达,外排泵的高表达导致了铜绿假单胞菌的耐药。

铜绿假单胞菌耐药机制及治疗进展概况

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种机会性病原菌,其对抗生素的耐药性随抗生素使用的增加而增强。新型抗生素研发面临资金和技术难度,使其进度滞后于耐药性的增长。铜绿耐药机制涉及内源性、获得性和适应性因素。现有研究正探索噬菌体疗法、益生菌疗法和纳米技术等非传统治疗策略来应对此问题。本文回顾了铜绿假单胞菌的十数篇文献资料,以期能为临床工作与研究提供一些参考。

光动力抗菌疗法对多重耐药铜绿假单胞菌体外杀伤作用的研究

目的研究甲苯胺蓝O(toluidine blue O,TBO)介导的光动力抗菌疗法(antimicrobial photodynamic therapy, APDT)对多重耐药铜绿假单胞菌的杀伤作用。方法以烧伤患者创面分离的多重耐药铜绿假单胞菌和标准铜绿假单胞菌为研究对象。实验组采用不同浓度TBO(2.5、5.0、7.5、10.0μmol/L)和不同剂量(10、20、30、40 J/cm2)光照处理[红光,波长为(635±5)nm];设单纯TBO组、单纯光照组和空白(不处理)3个对照组。采用菌落计数法计算细菌存活率。采用激光共聚焦电子显微镜、透射电镜、扫描电镜观察细菌形态学改变。采用Vitek-2 Compact型全自动药敏分析系统检测亚致死量APDT(TBO浓度2.5μmol/L、光照剂量10 J/cm2)处理前后细菌对哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南等抗生素最低抑菌浓度的变化。采用RT-qPCR测定多重耐药铜绿假单胞菌APDT处理前后耐药基因表达。结果随TBO浓度和光照剂量的增加,APDT对细菌的杀伤效应随之增加(P<0.05)。亚致死量APDT处理后,扫描电镜观察发现细菌出现皱缩、凹陷、穿孔等改变,透射电镜观察发现菌毛消失、细胞壁连续性中断、胞质电子密度降低、拟核区紊乱等变化。亚致死量APDT治疗后,多重耐药铜绿假单胞菌对上述抗生素敏感度升高,外排泵耐药基因表达下调(P<0.05)。结论 TBO介导的APDT在体外对多重耐药铜绿假单胞菌有良好的杀伤作用,并且通过对拟核DNA作用降低耐药基因表达,提升了耐药菌对抗生素的敏感性。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特征及其耐药机制的研究

目的分析临床分离耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药特征及其对亚胺培南耐药机制。方法应用BD Phoenix100全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和药物敏感试验,头孢哌酮/舒巴坦采用K-B法;应用聚合酶链反应（PCR）方法检测碳青酶烯酶相关基因（IMP、VIM、GIM、SPM、OXA、GES）、膜微孔蛋白基因oprD2,采用Etest试验观察氰氯苯腙（CCCP）对亚胺培南最低抑菌浓度（MIC）的影响,以研究细胞内主动外排机制。结果耐亚胺培南铜绿假单胞菌除对阿米卡星100%敏感外,对哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦敏感率为48.0%~54.0%,对三代、四代头孢菌素、氨曲南、喹诺酮类等抗菌药物抗菌活性差,敏感率为3.0%~29.0%;对美罗培南29.0%敏感,对氨苄西林/舒巴坦、氯霉素、四环素、复方新诺明全部耐药;检测到IMP阳性率17.6%,oprD2阳性率2.9%,其余耐药基因未检测到;当CCCP存在时,亚胺培南的MIC值下降4个浓度梯度,提示存在主动外排机制的菌株占11.8%。结论耐亚胺培南铜绿假单胞菌除阿米卡星外,对其他常用抗菌药物耐药严重;产IMP型金属β-内酰胺酶、细胞内主动外排机制以及膜微孔蛋白基因oprD2缺失,是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的原因,但膜微孔蛋白基因oprD2缺失,不是铜绿假单胞对亚胺培南耐药的主要机制。

CIP耐药的铜绿假单胞菌两种分子耐药机制关系的研究

目的探讨环丙沙星(CIP)耐药的铜绿假单胞菌临床分离株主动外排药物与gyrA、parC基因突变的关系。方法联合碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)和CIP对CIP耐药的铜绿假单胞菌株进行主动外排阳性株和阴性株的筛选,并对这些菌株的gyrA、parC基因进行聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)。结果57%(55/97)的CIP耐药菌株最小抑菌浓度(MIC)可被逆转,gyrA单基因突变率为65%,gyrA和parC双基因突变率为35%,未发现parC单基因突变的菌株。主动外排阳性组与阴性组gyrA、parC基因突变情况差异无显著性。结论在本地区铜绿假单胞菌对CIP的耐药机制中,主动外排系统表达上调与抗菌药物作用靶位的改变均占有重要的地位,两者可能是并存的两种相对独立的机制。

多重耐药铜绿假单胞菌耐药机制研究进展

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,Pa）是临床常见的革兰阴性杆菌之一。近年来,随着耐药菌株的出现,特别是多重耐药菌株、耐氨基糖苷类菌株及耐亚胺培南铜绿假单胞菌株的相继报道,耐药铜绿假单胞菌感染已经成为临床治疗的难点。

铜绿假单胞菌亚胺培南异质性耐药的机制

目的:探讨铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)亚胺培南异质性耐药的机制。方法:分别采用常规的KB法和MIC法检测310株铜绿假单胞菌对亚胺培南的敏感性,双纸片协同试验检测金属β-内酰胺酶,实时定量PCR实验检测外排泵基因Mex AB和Mex CD的表达水平,半定量结晶紫染色法检测生物膜的形成量,PCR扩增法检测细菌膜孔蛋白OPRD2基因是否缺失。结果:在临床分离的310株铜绿假单胞菌中,检出244株亚胺培南敏感菌株和66株非敏感菌株,244株中有36株铜绿假单胞菌对亚胺培南具有异质性耐药,总体检出率为11.6%。36株异质性耐药铜绿假单胞菌均不产生金属β-内酰胺酶,但高表达Mex AB外排泵,且生物膜的形成量也较高,其中6株检出膜孔蛋白OPRD2基因缺失。结论:临床存在部分异质性耐药的铜绿假单胞菌,它们通过形成生物膜、高表达多重耐药外排泵基因和基因缺失等机制介导耐药。

经头孢他啶诱导产生亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌的耐药表型及其耐药机制研究

目的探讨经头孢他啶诱导产生亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌(Imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa,IRPA)的耐药表型及其耐药机制,旨在为临床有效治疗铜绿假单胞菌感染提供理论依据。方法收集2016年7月-12月从临床送检标本中分离的抗菌药物全敏的铜绿假单胞菌PA株共计20株,以头孢他啶为诱导剂,诱导25代后,对诱导后产生亚胺培南耐药的菌株采用PCR方法进行金属β-内酰胺酶(MBLs)基因(IMP、VIM、SIM、GIM、SPM)和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因(TEM、VEB、SHV、PER、OXA-2以及OXA-10),AmpC酶基因(PDC、DHA),整合酶基因(intIl、intI2和intI3)的基因检测,采用RT-PCR方法对膜孔蛋白OprD2的表达量及主动外排系统MexAB-OprM、MexXY-OprM的超表达和MexCD-OprJ、MexEF-OprN的表达进行检测,分析比较各耐药相关表型在其中的作用。结果经人工诱导25代后,获得10株对亚胺培南产生耐药的菌株,其中产TEM的IMP耐药PA(IRPA)有7株,占70%;产PDC的IRPA10株,占100%;产intIl的IRPA10株,占100%;OprD2的表达量降低的有8株,占80%,主动外排系统表型阳性IRPA 3株,占30%。结论经头孢他啶诱导的PA产生IMP耐药性涉及ESBLs,AmpC酶,整合子的存在,膜孔蛋白的缺失和主动外排系统激活等多种耐药机制。

天津市中心城区集中供应管网末梢水的抗生素耐药基因污染特征研究

为了研究天津市中心城区集中供应管网末梢水的抗生素耐药基因(antibiotic resistance genes,ARGs)污染特征,采集了天津市中心城区6个采样点的管网末梢水样,分别采用微孔滤膜正压过滤法及核酸吸附-洗脱法富集水中细菌和胞外核酸后,利用实时定量PCR技术对15种胞内ARGs和胞外ARGs进行定量检测。结果表明,在待检的15种ARGs中,除了耐碳青霉烯类bla KPC未被发现外,其余ARGs(mcr-1、van A、bla NDM-1、aad A、bla TEM、sul1、tet M、tet A、dfr A1、rpo B1、cat A1、erm B、kat G和qnr A)均在天津市中心城区所有管网末梢水样中检出,其中,mcr-1、van A、aad A、bla TEM、sul1、tet M、tet A和dfr A1等8种在细胞内外含量均较高,分别占待检的胞内ARGs和胞外ARGs总量的97.25%和99.18%,以aad A最高,其次为bla TEM和sul1;细胞内ARGs总绝对浓度高于细胞外(P<0.05),前者为后者的3.8倍。天津市中心城区集中供应管网末梢普遍存在胞内ARGs和胞外ARGs污染,且细胞内外超级耐药基因均有检出。

75株碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌ERIC-PCR菌种分型及其主要耐药机制研究

目的探讨碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌同源性及其主要耐药机制。方法收集临床标本946份,分离出碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌,采用琼脂稀释法进行体外药物敏感性试验;采用肠杆菌基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)进行耐药菌株同源性分析;筛选其金属β-内酰胺酶并测定主动外排系统表型来分析碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌的耐药性。结果共检测出75株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌;ERIC-PCR同源性分析显示75株菌株共分为8个型别,其中A型占34.7%(26株)、B型占22.7%(17株);75株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌中有13株为产酶株,产酶率为17.3%;外排泵抑制剂MC207110可以使34株美罗培南耐药株的最低抑菌浓度(MIC)较单药时下降4倍或以上,占63.0%。结论本院分离的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌主要有两种类型,产生碳青霉烯水解酶和外排泵机制是碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌耐药的重要机制。

聚苯乙烯微塑料对污水中胞外耐药基因的影响及其机制

微塑料(MPs)和抗生素耐药基因(ARGs)是共存于污水处理厂中的典型新污染物.MPs已被证明能够改变污泥中ARGs的分布模式,但其对污水中胞外ARGs(fe ARGs)的影响及机制仍不清楚.采用荧光定量PCR技术探究了典型MPs(聚苯乙烯PS)暴露60 d后污水中fe ARGs(包括tet C、tet O、sul1和sul2)的动态变化特征及机制.结果表明,四环素类fe ARGs绝对丰度在nm级和mm级PS暴露下分别降低了28.4%~76.0%和35.2%~96.2%,在μm级PS暴露下变化了-55.4%~122.4%.PS对磺胺类sul1的促进效果呈nm级>μm级>mm级趋势,且ρ(PS)为50 mg·L^(-1)对sul1丰度扰动幅度更大.磺胺类sul2的相对丰度在μm级和mm级PS暴露后分别削减了25.4%~42.6%和46.1%~90.3%,在nm级PS暴露后增加了1.9~3.9倍;ρ(PS)为50 mg·L^(-1)对sul2的削减作用高于ρ(PS)为0.5 mg·L^(-1).Pearson相关性分析显示,PS暴露下fe ARGs相对丰度与细胞膜通透性和典型可移动遗传元件(int I1)丰度成正相关,与活性氧水平成负相关.研究结果阐明了PS对污水中fe ARGs的影响及其机制,可为污水中MPs与ARGs复合污染的防治提供科学依据.

天津某小区生活饮用水中胞外耐药基因污染分析

目的研究天津某小区生活饮用水中胞外耐药基因的污染特征,阐明生活饮用水中胞外耐药基因污染规律。方法于2015年12月至2016年11月,利用自行研制的核酸吸附柱富集生活饮用水中的游离核酸,采用实时荧光定量PCR技术检测tetC、ermB、ampC、sul1、qnrA、aadA、catA1和katG 8种胞外耐药基因的浓度。结果与结论在12份水样中,tet C的检出率最高,约为66.7%;其次为sul1和qnr A(41.7%)、ampC(33.3%)、aadA(16.7%)、cat A1和kat G(均为8.33%),erm B未检测出。生活饮用水中以sul1胞外耐药基因的污染最严重,达(1.27±0.04)×10~5GC/L。各胞外耐药基因出现最大浓度的时间主要集中在6月,且3月和6月检测出的胞外耐药基因种类最多,达5种。天津某小区生活饮用水中存在多种胞外耐药基因的污染。

多重耐药铜绿假单胞菌群体感应系统与主动外排基因表达的研究

目的研究临床多重耐药铜绿假单胞菌群体感应(QS)系统与主动外排泵MexAB-OprM系统基因表达水平与抗生素耐药关系。方法收集苏州市立医院和上海市江湾医院2011年2月至6月间临床标本中分离的铜绿假单胞菌,定量分析细菌生物被膜形成能力;MIC法检测细菌抗生素耐药性,用多重聚合酶链反应(PCR)扩增群体感应系统lasI、lasR及主动外排泵系统mexA基因,实时定量逆转录RT-PCR检测lasI、lasR和mexA基因的相对表达量。结果临床样本分离出84株铜绿假单胞菌,其中产生物被膜菌58株,占比69%;多重耐药菌共24株,占比28.6%;多重耐药菌株中产生物被膜有11株,占45.8%;多重耐药菌中mexA基因表达上调有18株,占75%;lasI基因表达上调有8株,占33.3%。结论多重耐药菌株的生物被膜形成率显著低于非多重耐药组,多重耐药铜绿假单胞菌的主动外排泵MexAB-OprM系统基因表达出现显著上调,生物被膜菌的lasI基因表达显著上调而lasR基因的表达无明显变化。

ICU多重耐药铜绿假单胞菌外排泵基因表达分子流行趋势及其危险因素

目的探讨ICU患者中多重耐药铜绿假单胞菌(MDRPA)多药物外排泵基因Mex AB-Opr M、Mex CD-Opr J、MexEF-Opr N表达的分子流行趋势及其危险因素。方法收集2012年4月-2014年2月本院ICU病房收治的56例确诊感染MDRPA患者的痰、血或创面分泌物标本,分离培养MDRPA菌共56株,应用聚合酶链式反应(PCR)及实时荧光定量PCR(real-time PCR)等方法分析上述标本中3种外排泵基因表达的情况。结果 56株MDRPA菌中,Mex ABOpr M、Mex CD-Opr J及Mex EF-Opr N阳性菌株数分别为55(98.2%)、10(17.9%)和23(41.1%);Mex AB-Opr M、MexCD-Opr J及Mex EF-Opr N阳性菌株中高表达者分别为23例(23/55)、4例(4/10)和14例(14/23);Logistic回归分析显示,碳青酶烯类抗生素应用、留置深静脉导管及糖皮质激素应用超过1周是Mex AB-Opr M、Mex CD-Opr J及Mex EFOpr N高表达的独立危险因素。结论多重耐药铜绿假单胞菌多药物外排泵基因Mex AB-Opr M阳性率较高,其高表达与碳青酶烯类抗生素应用、留置深静脉导管及激素应用超过1周有关。

ClO_(2)消毒工艺对污水处理厂出水超级耐药基因的影响

为了研究二氧化氯(chlorine dioxide,ClO_(2))消毒工艺对污水处理厂出水中超级耐药基因(super antibiotic resistance genes,SARGs)的去除效果,对污水处理厂出水消毒前后的水样进行了全年采集,并采用微孔滤膜正压过滤法及核酸吸附柱-洗脱法分别富集水中细菌和胞外核酸后,利用荧光定量PCR技术对其中的9种SARGs进行定量检测.结果表明,无论是胞内还是胞外核酸,均有NDM-1、MCR-1和MEC-A被检测出;同时,ClO_(2)消毒后上述3种SARGs的胞内相对总浓度明显上升(P<0.05),且ClO_(2)消毒对胞内SARGs相对浓度的影响与季节有关,其中春季、夏季和秋季均发生上升,且春季升高最为明显,达2倍,而冬季出水在消毒前后均未测出胞内SARGs;胞外SARGs则在ClO_(2)消毒前后没有明显浓度变化.因此,ClO_(2)消毒不能有效去除污水处理厂出水中胞内和胞外SARGs污染.

外排泵系统介导的铜绿假单胞菌多重耐药性研究

目的调查镇江地区临床分离的铜绿假单胞菌的耐药性率,检测外排泵系统M exAB-OprM和M exXY-OprM的调控基因mexR和mexZ的表达情况。方法纸片扩散法（K-B法）测定其对12种常用抗菌药物的耐药性,用PCR扩增mexR和mexZ全长基因。结果药敏结果显示该菌对头孢类抗生素耐药情况严重,铜绿假单胞菌对复方新诺明、头孢唑林、头孢西丁完全耐药,对头孢他啶、头孢吡肟的耐药率在40.0%-60.0%之间。对亚胺培南、阿米卡星、美罗培南的耐药率达到40.0%。对左氧氟沙星、哌拉西林、头孢噻肟的耐药率均在60%以上。多重耐药率达75.0%。但98.0%的铜绿假单胞菌（71株）对多粘菌素B敏感。72株铜绿假单胞菌中91.0%（65株）同时表达mexR和mexZ基因,5.8%（4株）单独表达mexR基因,4.0%（3株）单独表达mexZ基因。结论mexR和mexZ基因与铜绿假单胞菌多重耐药密切相关。

铜绿假单胞菌耐药性在生物被膜形成过程中的变化

目的 研究铜绿假单胞菌遗传性耐药(gyrA基因突变和MexAB OprM主动外排)在生物被膜形成过程中对药物抗性的作用。方法 通过PCR技术鉴定gyrA基因突变株和MexAB OprM主动外排株,利用三亲杂交的方法将绿色荧光蛋白(GFP)基因转到铜绿假单胞菌药物敏感株中,测定gyrA基因突变株、MexAB OprM主动外排株以及带有绿色荧光蛋白的铜绿假单胞菌在特氟隆上产生生物被膜耐药的规律。结果 筛选出gyrA基因突变株和MexAB OprM主动外排株。通过三亲杂交成功构建了带有pGFPuv质粒的铜绿假单胞菌。将突变株和敏感株培养在最低杀菌浓度(MBC)的环丙沙星溶液中形成生物被膜使菌株的存活率均在50%以上。结论 比较遗传性耐药和生物被膜耐药的作用表明gyrA基因突变和主动外排在生物被膜耐药形成前期发挥主要作用,当生物被膜完全形成之后,铜绿假单胞菌的耐药性有可能是由生物被膜介导的。