胞外酸化经ASIC1/RIP1途径抑制TFEB介导的巨噬细胞脂噬

目的 探讨胞外酸化对巨噬细胞脂噬的影响及其作用机制。方法 采用RAW264.7巨噬细胞,以pH 6.5培养液与25 mg/L氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共孵育24 h构建胞外酸化诱导的泡沫细胞模型。分别以ASIC1特异性阻断剂PcTx-1和RIP1抑制剂Nec-1干预胞外酸化诱导的RAW264.7巨噬细胞24 h,油红O染色检测细胞内脂质蓄积;蛋白质印迹(Western blot)检测总ASIC1、膜ASIC1、p-RIP1 Ser166、p-TFEB Ser142、LC3和p62蛋白的表达;激光共聚焦显微镜观察脂滴(Bodipy示踪)与自噬标志物LC3II和LAMP1共定位;透射电镜观察细胞内脂滴和脂噬泡的数量变化;胆固醇荧光试剂盒检测ABCA1介导的胆固醇流出。结果 与pH 7.4组相比较,pH 6.5胞外酸化组胞内的脂质蓄积和细胞质膜上的ASIC1蛋白表达显著增加,p-RIP1Ser166、p-TFEB Ser142水平升高,LC3II蛋白减少和p62蛋白增加,脂滴与LC3II和LAMP1的共定位都分别减少,细胞内的脂滴数量显著增加,自噬体和脂噬泡的数量则明显减少,ABCA1介导的巨噬细胞内胆固醇流出显著减少。然而,胞外酸化对RAW264.7巨噬细胞的上述效应能被ASIC1特异性阻断剂PcTx-1和RIP1抑制剂Nec-1所取消。结论 胞外酸化经激活ASIC1/RIP1途径促进TFEB磷酸化抑制巨噬细胞脂噬,ASIC1可能是防治动脉粥样硬化等脂质蓄积疾病的新靶点。

钙络合剂BAPTA-AM对胞外酸化诱导大鼠关节软骨细胞自噬作用的影响及其可能机制

目的观察BAPTA-AM对胞外酸化诱导大鼠关节软骨细胞自噬作用的影响,探讨其可能的作用机制。方法体外使用胰酶-Ⅱ型胶原酶消化法分离提取大鼠关节软骨细胞,分为正常组(p H 7.4)、酸化组(p H 6.0)、以及分别经BAPTA-AM处理的正常组和酸化组,激光共聚焦技术检测软骨细胞胞内钙离子变化,实时荧光定量PCR法检测细胞自噬基因Beclin-1、ULK1 mRNA的表达,Western blot法检测自噬蛋白LC3的表达,吖啶橙染色分析细胞自噬溶酶体形成情况。结果与p H 7.4正常组比较,p H 6.0酸化刺激明显增加大鼠关节软骨细胞内Ca2+的浓度,且自噬标志物Beclin-1、ULK1 mRNA及LC3Ⅱ蛋白表达均明显升高,酸性自噬溶酶体形成增多,同时酸化刺激能引起Ca MKKβ及pAMPK蛋白表达水平增高,磷酸化蛋白p-m TOR水平明显降低。BAPTA-AM酸化组自噬水平和Ca MKKβ及p-AMPK表达明显降低,p-m TOR表达明显升高。结论 BAPTA-AM能明显减弱胞外酸化诱导软骨细胞自噬作用,其机制可能与抑制胞内Ca2+有关。

胞外酸化对体外培养大鼠关节软骨细胞增殖与凋亡及组织蛋白酶K mRNA表达的影响

目的:探讨不同胞外pH环境对体外培养的大鼠关节软骨细胞增殖、凋亡的影响,以及大鼠关节软骨细胞中组织蛋白酶K的表达与胞外酸化的关系。方法:Ⅱ型胶原酶消化法从大鼠关节软骨中分离软骨细胞;细胞传代培养后分为4组分别在pH 7.4、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5不同的胞外酸化环境下培养3h,MTT法检测软骨细胞活力,Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态,Annexin-V/PI双染法检测软骨细胞的凋亡率,实时荧光定量PCR检测组织蛋白酶K基因的表达。结果:与pH 7.4组比较其他各组软骨细胞增殖均受到抑制,其中pH 5.5、pH 6.0与pH 7.4相比差异有重要的统计学意义(P<0.01),pH5.5和pH 6.0组可见较多的凋亡细胞,且流式细胞仪检测的凋亡率明显高于pH 7.4组(P<0.01);组织蛋白酶K的表达与酸性程度成正相关。结论:胞外酸化环境下能明显抑制体外培养软骨细胞增殖、促进软骨细胞凋亡,并且酸性环境能增加组织蛋白酶K的表达,这为类风湿关节炎中关节软骨的破坏发生机制提供了实验依据。

胞外酸性与肿瘤的浸润转移

组织缺氧是实体瘤的一个主要特征,它引起肿瘤细胞胞外酸性环境的形成.肿瘤细胞通过质子感知的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)或质子感知的离子通道感知其胞外的酸性环境,并激活多条细胞内信号通路,影响细胞功能.肿瘤最致命的方面在于其转移能力,肿瘤转移程度与肿瘤细胞迁移能力呈正相关.因此,对胞外酸性与肿瘤细胞迁移扩散之间关系的深入研究将有助于发现更多新的抗肿瘤转移药物.本文就肿瘤酸性微环境的形成、肿瘤细胞的质子感知机制、胞外酸性环境对肿瘤浸润转移的影响及如何将肿瘤pH调节应用于癌症治疗等方面的内容予以综述.

酸敏感离子通道1a在酸诱导的大鼠关节软骨细胞自噬的作用及其机制研究

目的研究酸敏感离子通道1a(acid-sensing ion chan-nel 1a)在体外培养的酸诱导的大鼠关节软骨细胞自噬的作用及其可能机制。方法Ⅱ型胶原酶消化法分离大鼠关节软骨细胞,鉴定后传代培养,观察在不同pH条件下诱导的细胞自噬情况以确定胞外酸化条件;将软骨细胞分为pH7.4环境下培养的正常组、pH 6.0的酸化组、以及经ASIC1a非特异性阻断剂Amiloride和特异性阻断剂PcTX1处理的酸化组,RT-PCR法检测细胞自噬基因Beclin-1 mRNA的表达,Western blot法检测自噬蛋白LC3及ERK1/2、p38MAPK磷酸化蛋白的表达,透射电子显微镜法(TEM)观察自噬小体数量的变化;通过使用ERK1/2、p38MAPK磷酸化抑制剂(PD98059、SB203580),采用RT-PCR和Western blot法观察ERK1/2及p38MAPK对酸诱导的软骨细胞自噬的影响。结果 pH 5.5和pH 6.0胞外酸化刺激均能明显升高软骨细胞自噬水平(P<0.01);与pH 7.4组比较,酸化组软骨细胞Beclin-1 mRNA及LC3、磷酸化的ERK1/2和p38MAPK蛋白表达水平均明显升高(P<0.01),且自噬小体数量增多,ASIC1a阻断剂组自噬水平及ERK1/2、p38磷酸化蛋白表达水平较酸化组明显降低(P<0.01),且自噬体数量减少;与pH 6.0组相比,ERK1/2磷酸化抑制剂处理后,Beclin-1 mR-NA和LC3蛋白的表达均下调(P<0.05,P<0.01),而p38磷酸化抑制剂组自噬水平则无明显变化。结论胞外酸化环境下能诱发软骨细胞自噬,阻断ASIC1a能明显减弱酸化诱导的软骨细胞自噬,其机制可能与抑制ERK1/2磷酸化有关。

细胞外氢离子浓度对HERG通道功能的影响

背景:HERG基因在心肌细胞高度表达,编码钾离子通道,形成延迟整流钾电流的快速激活成分,在复极化过程中发挥重要作用,它是维持2和3相动作电位的主要因素。最近有研究显示HERG基因突变可引起长QT综合征(LQTS),而且许多抗心律失常药物的作用靶点为HERG通道。本研究的目的是探讨不同胞外氢离子浓度对HERG通道的影响。 方法和结果: 本研究将HERG基因亚克隆到pSP64和pcDNA3.1表达载体,用T7 RNA聚合酶体外合成cR-NA,经Ribogreen荧光定量和变性胶电泳鉴定后,将相应的cRNA注入卵母细胞,在18℃培养箱中培养3天后,用标准双电极电压钳测量卵母细胞的表达电流。所有数据均采用pCLAMP软件采集,并应用Kaleidagraph 3.5和Igor软件进行数据处理。研究表明胞外酸化作用(pH8.5,7.5,6.5)时,HERG通道灭活加速,激活曲线右移,而其它门控动力学无明显影响。 结论: 本研究表明胞外酸化(pH 8.5,7.5,6.5)作用时,HERG通道灭活加速,激活曲线右移。酸中毒时,HERG通道灭活加速可能是引起心律失常的一种机制。

酸敏感离子通道在肾小管上皮细胞损伤中的作用

目的观察不同条件下酸敏感离子通道(ASICs)在肾小管上皮细胞表达情况,探讨其在肾小管上皮细胞损伤中的作用。方法先采用免疫组化法分析紫癜性肾炎患儿肾组织中ASIC1a、ASIC2a、ASIC3的表达水平。将肾小管上皮细胞在pH7.4、pH7.0、pH6.5、pH6.0、pH5.5的不同胞外环境下分别培养;将肾小管上皮细胞分组进行培养:正常组(pH7.4),对照组(pH6.5),试验组1(pH6.5+ASICs非特异性的阻滞剂Amiloride)、试验组2(pH6.5+ASICs特异性阻滞剂Pc Tx-1)。采用western blot法测定ASICs及角蛋白(K7,K18,K19)的表达。结果免疫组化显示ASIC1a、ASIC2a、ASIC3在紫癜性肾炎肾小管上皮的表达较对照组明显增多(P<0.01)。ASIC1a、ASIC2a、ASIC3在pH7.0、pH6.5、pH6.0、pH5.5中肾小管上皮的表达较pH7.4明显增多,差异有统计学意义(P<0.01);ASICs及Keratins蛋白(K7、K18和K19)在pH6.5+Amiloride组及pH6.5+Pc Tx-1组较pH6.5组在肾小管上皮上的表达减少,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 ASICs可能参与了紫癜性肾炎肾小管的损伤过程。胞外酸化可诱导下ASICs在肾小管上皮的表达,而阻断ASICs可以减少肾损伤。