依托咪酯通过下调含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2表达抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖并诱导其凋亡的实验研究

目的探讨依托咪酯(ETO)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增殖和凋亡的影响及含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)在其中发挥的作用机制。方法分别采用0、1、2和3 mg/L的ETO处理人正常肺上皮细胞系BESA-2B和人NSCLC细胞系A549,细胞计数试剂盒法检测细胞活力;将A549细胞随机分为对照组、ETO(3 mg/L)组、ETO+NC组和ETO+WWP2-OE组,后2组分别于ETO处理后转染空载体pcDNA3.1-NC或WWP2过表达载体pcDNA3.1-WWP2,集落形成试验检测细胞增殖能力;TUNEL染色检测细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞中WWP2的mRNA表达;STITCH数据库选择与ETO直接相互作用的蛋白质;蛋白质印迹法检测各组细胞中WWP2、增殖、凋亡和磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路相关蛋白表达。结果ETO以剂量依赖性方式显著降低A549细胞活力(F=147.923,P<0.001);而对正常肺上皮BESA-2B细胞活力无影响(F=1.427,P=0.126)。不同浓度(0、1、2、3 mg/L)ETO处理A549细胞后,集落形成数量逐渐减少[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(898±38)、(785±48)、(635±36)、(388±20)个],细胞凋亡率逐渐升高[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(2.23±0.65)%、(7.63±0.35)%、(13.24±0.47)%、(18.93±0.36)%],呈剂量依赖性(F=218.732、352.786,均P<0.001)。STITCH数据库预测ETO可通过上调WWP2蛋白表达和下调PTEN蛋白表达与WWP2和PTEN相互作用。与对照组相比,ETO组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达降低,集落形成数量减少,细胞凋亡率升高,增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞增殖抗原Ki67、B淋巴细胞瘤基因2(Bcl-2)和PTEN蛋白表达降低,Bcl-2相关X蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)蛋白表达升高,磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K和磷酸化Akt(p-Akt)/Akt比值降低(均P<0.01);与ETO+NC组比较,ETO+WWP2-OE组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达升高,集落形成数量增多,细胞凋亡率降低,PCNA、Ki67、Bcl-2和PTEN蛋白表达增多,Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达减少,p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值升高(均P<0.01)。结论ETO可抑制A549细胞增殖并促进细胞凋亡,其作用机制可能与调控WWP2的下调和PTEN/PI3K/Akt通路的激活有关。

水稻泛素连接酶D3与抗病相关蛋白VOZ2的互作分析

多蘖矮秆基因dwarf-3(D3)是水稻独脚金内酯信号转导过程中的重要节点基因,拟南芥中的MAX2基因与D3同源,且MAX2参与拟南芥的抗病防卫反应。本研究以水稻泛素连接酶D3为诱饵进行酵母双杂筛库,发现水稻抗病相关蛋白维管植物单锌指蛋白VOZ2与D3存在潜在的相互作用。通过酵母双杂交试验证实,D3与VOZ2存在互作。通过荧光定量PCR证实,接种水稻白叶枯病菌后,VOZ2基因在转录水平上的表达受到显著诱导。利用水稻原生质体开展的亚细胞共定位实验发现,D3与VOZ2共定位于细胞核。双分子荧光互补实验发现,D3与VOZ2在烟草叶肉细胞的细胞核和细胞质均产生较强的荧光,进一步证实了D3与VOZ2的相互作用。研究结果为进一步探究D3和VOZ2在水稻抗病防卫反应中的功能与分子机理奠定了基础。

泛素连接酶MuRF2通过抑制线粒体自噬减轻心肌细胞缺氧损伤

目的探讨泛素连接酶肌肉环指状蛋白2(muscle ring finger protein 2,MuRF2)对缺氧心肌细胞活力和自噬的调控作用。方法构建大鼠源MuRF2基因过表达和敲减慢病毒载体,分别感染大鼠心肌细胞H9C2。将H9C2细胞分为阴性对照组(NC)、阳性对照组[MuRF2过表达空载体组(LV-Vector)、MuRF2敲减空载体组(LV-RNAi-Vector)]、Mu RF2过表达组(LV-MuRF2)和MuRF2敲减组(LV-RNAi-MuRF2),缺氧培养(5%CO_(2)、1%O_(2)、94%N_(2))后,采用CCK-8法和ELISA法检测心肌细胞损伤水平,利用透射电子显微镜检测心肌细胞超微结构和自噬水平变化,采用Western blot测定自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和P62的表达水平。结果与对照组相比,缺氧组心肌细胞间隙增大、细胞皱缩、多见漂浮的死亡细胞和细胞碎片,心肌细胞活力下降、肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)含量增加(P均<0.05);电子显微镜下可观察到部分线粒体发生肿胀,并存在嵴断裂、嵴溶解现象,自噬小体散在胞质内;缺氧组LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高,P62蛋白表达水平降低(P均<0.05)。缺氧培养后,与NC组和LV-Vector组相比,LV-MuRF2组细胞活力增加,偶见自噬小体,LC3-Ⅱ蛋白表达水平降低、P62蛋白表达水平增高(P均<0.05);与NC组和LV-RNAi-Vector组相比,LV-RNAi-MuRF2组细胞活力降低,可见大量自噬小体,LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高、P62蛋白表达水平降低(P均<0.05)。结论泛素连接酶MuRF2可减轻缺氧所致的心肌细胞损伤,其机制可能与抑制心肌细胞线粒体自噬有关。

胞浆泛素蛋白连接酶2在大鼠脊髓损伤后星形胶质细胞中的表达及意义

目的研究胞浆泛素蛋白连接酶2(Kip1 ubiquitylation-promoting complex 2,KPC2)在大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)过程中的蛋白表达及细胞定位情况,探讨其在SCI修复过程中的生物学功能。方法将成年SD大鼠随机分为2组,对照组7只仅行单纯T9椎板全切除术,实验组49只采用改良Allen法制作T9节段脊髓撞击损伤模型,实验组于伤后6、12 h及1、3、5、7、14 d分别取7只大鼠进行以下检测。采用Western blot检测p27kip1、KPC2、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和细胞周期蛋白A(Cyclin A)在SCI前后的蛋白表达变化,免疫组织化学染色观察KPC2在SCI后的大体定位及表达,免疫荧光双标记染色观察KPC2在SCI过程中与神经元特异性核蛋白(neuronal nuclei,Neu N)、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和PCNA的共定位情况。细胞水平采用体外培养星形胶质细胞增殖模型,Western blot检测KPC2、P27kip1、PCNA表达;免疫共沉淀分析KPC2、KPC1和p27kip1之间在细胞增殖过程中的相互作用。结果 Western blot结果示SCI后3 d,p27kip1显著下调,伴随KPC2、Cyclin A、PCNA表达明显增加。免疫组织化学染色示KPC2阳性信号广泛分布,包括脊髓灰质和白质,实验组KPC2阳性细胞数显著高于对照组(t=10.982,P=0.000)。免疫荧光双标记染色示在脊髓灰质,对照组和实验组KPC2与Neu N双标记阳性细胞数分别为(0.43±0.53)、(0.57±0.53)个/视野,比较差异无统计学意义(t=0.548,P=0.604);在脊髓白质,对照组和实验组KPC2与GFAP双标记阳性细胞数分别为(3.86±0.90)、(0.71±0.49)个/视野,差异有统计学意义(t=7.778,P=0.000);对照组和实验组KPC2与PCNA标记的星形胶质细胞共定位明显,阳性细胞数分别为(0.57±0.53)、(5.57±1.13)个/视野,差异有统计学意义(t=8.101,P=0.000)。体外培养并模拟星形胶质细胞增殖,提取细胞蛋白行Western blot示PCNA和KPC2蛋白表达在血清刺激增殖后即开始增加,24 h达峰值,而p27kip1表达则逐渐减少。免疫共沉淀示KPC2可沉淀p27kip1、KPC1,p27kip1也可沉淀KPC2、KPC1,且在刺激后相互作用明显增加。结论 SCI后KPC2参与介导的p27kip1表达下调,KPC2与SCI后星形胶质细胞的增殖相关。

喉鳞状细胞癌中泛素结合酶E2C、胞浆磷蛋白-1表达与预后相关性

目的探讨泛素结合酶E2C(UBE2C)、胞浆磷蛋白-1(STMN1)在喉鳞状细胞癌(简称喉鳞癌)中的表达水平及与预后的相关性。方法选取2015年2月至2017年2月在该院进行手术治疗中取得的97例喉鳞癌组织标本作为喉鳞癌组,另外选取对应的癌旁组织标本作为癌旁组。采用免疫组化法检测UBE2C和STMN1在不同组织标本中的表达情况;通过χ^(2)检验分析UBE2C、STMN1表达与喉鳞癌患者临床病理特征的关系;采用多因素Cox回归分析影响喉鳞癌患者预后的相关因素。结果喉鳞癌组UBE2C阳性率高于癌旁组,差异有统计学意义(P<0.05);喉鳞癌组STMN1阳性率高于癌旁组,差异有统计学意义(P<0.05)。临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、T分期为T_(3)~T_(4)期、有淋巴结转移的喉鳞癌患者UBE2C、STMN1阳性率均高于临床分期为Ⅰ~Ⅱ期、T分期为T_(1)~T_(2)期、无淋巴结转移的喉鳞癌患者(P<0.05)。UBE2C阴性的喉鳞癌患者5年生存率明显高于UBE2C阳性的喉鳞癌患者,差异有统计学意义(P<0.05);STMN1阴性的喉鳞癌患者5年生存率明显高于STMN1阳性的喉鳞癌患者,差异有统计学意义(P<0.05)。单因素分析结果显示,临床分期为Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移、UBE2C阴性、STMN1阴性的喉鳞癌患者5年生存率明显高于临床分期分期为Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移、UBE2C阳性、STMN1阳性的喉鳞癌患者(P<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移、UBE2C阳性、STMN1阳性表达是喉鳞癌患者预后的危险因素(P<0.05)。结论UBE2C、STMN1在喉鳞癌患者中主要呈阳性表达,且与喉鳞癌患者预后密切有关,有望成为喉鳞状细胞癌预后评估的指标。

泛素E3连接酶膜相关锌指蛋白2高表达与胃癌临床分期、侵袭性及预后的相关性

目的研究泛素E3连接酶膜相关锌指蛋白2(MARCH2)高表达与胃癌分期、侵袭及预后之间的关系。方法将96例行胃癌根治术的胃癌患者纳为研究对象,免疫组织化学法检测患者胃癌组织及癌旁组织内MARCH2表达情况,分析MARCH2阳性表达与患者临床病理特征之间的关系。术后随访5~47个月,采用Kaplan-Meier法分析胃癌组织内MARCH2表达情况与患者生存时间的关系。结果胃癌组织内MARCH2阳性表达率高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。胃癌组织内MARCH2阳性表达与胃癌浸润深度以及淋巴结转移有关(P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期以及分化程度无关(P>0.05)。将胃癌组织内MARCH2中、强阳性表达者纳为MARCH2强阳性表达组,其余患者纳为对照组,随访5~47个月,平均(34.51±6.16)个月,绘制生存曲线发现,强阳性组患者生存时间短于对照组,差异具有统计学意义(Rank=8.923,P=0.003)。结论胃癌组织内MARCH2阳性表达率明显上升,且MARCH2阳性表达与肿瘤浸润深度及淋巴结转移间存在密切联系,MARCH2高表达者预后生存时间更短,提示MARCH2可能参与胃癌的发生及发展。

淋巴细胞胞浆蛋白2的功能及其在恶性肿瘤中的研究进展

淋巴细胞胞浆蛋白2 (Lymphocyte cytoplasmic protein 2, LCP2,也称SLP-76)参与调控多种免疫细胞的活动,在T细胞激活中发挥着重要作用,介导T细胞生长发育过程中的多个信号转导过程,是多种疾病发展过程中的关键调节因子。其中,SLP-76可能与激活T细胞介导的抗肿瘤活性机制有关,在多种恶性肿瘤的发生和转移中发挥重要作用。本文归纳了SLP-76的结构域所参与免疫系统相关的调控机制以及对在肿瘤中的临床意义作一综述,为后续的研究提供参考。

泛素连接酶RING2对苯并[a]芘染毒人支气管上皮细胞周期和P53蛋白表达的影响

目的:探讨泛素连接酶RING2对苯并[a]芘(Ba P)染毒人支气管上皮16HBE细胞周期和P53蛋白表达的影响。方法:以16HBE未处理组为阴性对照组,二甲基亚砜(DMSO)组为溶剂对照组,MOCK组为序列对照组。在使用RNA干扰技术降低16HBE细胞泛素连接酶RING2基因表达前后,分别采用不同浓度Ba P(1、2、4、8、16、32μmol/L)染毒24 h;或16μmol/L Ba P染毒不同时间(1、2、4、8、12、24 h)。用流式细胞术检测干扰前后两组细胞周期分布情况,用Western-blot法检测干扰前后两组细胞P53蛋白表达水平。结果:流式细胞术检测结果显示,与阴性对照组比较,16HBE细胞染毒后各浓度和各时点组S期细胞所占的比例均增加(P<0.05),而16HBE(si RNA-RING2)各浓度和各时点组S期细胞所占的比例均下降(P<0.05)。协方差分析显示分组因素(是否进行RNAi)和染毒浓度都对S期细胞比例有影响(P均<0.01),16HBE(si RNA-RING2)细胞组的修正均数(17.09%)比16HBE细胞组(31.55%)明显降低(P<0.01)。分组因素和染毒时间都对S期细胞比例有影响(P均<0.01),16HBE(si RNA-RING2)细胞组的修正均数(13.07%)比16HBE细胞组(28.04%)明显下降(P<0.01)。Western-blot结果显示,与阴性对照组比较,16HBE细胞染毒后各浓度和各时点组P53的表达水平均增加(P<0.05),而16HBE(si RNA-RING2)细胞除16μmol/L染毒8 h组外,其余各组P53的表达水平均降低(P<0.05)。协方差分析显示分组因素和染毒浓度都对P53的表达水平有影响,P值分别为0.026和0.028。16HBE(si RNA-RING2)细胞组的修正均数(0.989)比16HBE细胞组(1.375)明显下降(P<0.05);分组因素和染毒时间都对P53的表达水平有影响,P值分别为0.007和0.035。16HBE(si RNA-RING2)细胞组的修正均数(0.857)比16HBE细胞组(1.541)明显下降(P<0.05)。结论:RING2参与的组蛋白泛素化修饰可能通过影响P53表达和细胞周期S期的变化来发挥对DNA损伤修复的调控。

泛素E3连接酶CHIP介导RCC2的泛素化及降解

目的 本课题组前期构建了一种正交泛素传递方法,并发现染色体浓缩调节蛋白2(RCC2)是泛素连接酶CHIP的潜在底物。本实验旨在验证CHIP是否能介导RCC2的泛素化及降解,以期通过CHIP来泛素化调控RCC2的表达和功能。方法 首先构建CHIP及其突变体质粒,验证CHIP与RCC2是否有相互作用;然后构建pLVX-RCC2-FLAG重组质粒并转染进CHIP敲减细胞株(shCHIP)、HEK293细胞株、CHIP过表达细胞株(OE CHIP),通过免疫共沉淀下拉富集RCC2-FLAG并检测其泛素化水平;接下来在HEK293细胞中转染不同量的CHIP,以及设置CHX chase蛋白稳定性实验,检测RCC2的蛋白水平变化;最后利用泛素突变体K48R-Ub及K11R-Ub进行CHIP介导RCC2上形成泛素链的实验检测。结果 在HEK293细胞中,CHIP能够介导RCC2的泛素化,并在RCC2上形成K48和K11多聚泛素链,促进其通过蛋白酶体发生降解。结论 泛素连接酶CHIP能够介导RCC2的泛素化及降解,为实现通过CHIP来泛素化调控RCC2提供了理论基础。

骨髓间充质干细胞来源外泌体对大鼠脊髓损伤的改善作用及对脊髓组织胞浆型磷脂酶A2、水通道蛋白4和水通道蛋白9的影响实验研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源外泌体对大鼠脊髓损伤(SCI)的改善作用及对脊髓组织胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)、水通道蛋白4(AQP4)和AQP9的影响。方法:培养BMSCs,提取外泌体并进行鉴定。选择成年雄性SD大鼠30只,分为假手术组、模型组和外泌体组,各10只。采用Allen法制作大鼠脊髓损伤模型,外泌体组经尾静脉注射外泌体,假手术组和模型组大鼠尾静脉注射等体积PBS缓冲液。各组大鼠每隔2 d注射1次,共注射3次。采用脊髓损伤行为学(BBB)评分评估干预前后各组大鼠四肢运动功能。采用HE染色观察脊髓组织结构。采用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)检测神经细胞凋亡情况。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测脊髓组织PLA2、AQP4、AQP9 mRNA及蛋白表达。结果:BMSCs生长状态良好,外泌体表面标志蛋白CD63、Alix呈阳性表达。干预后3、7 d,外泌体组BBB评分高于模型组(均P<0.05)。假手术组脊髓组织无损伤坏死及出血,结构完整,灰质白质边界清晰,细胞排列有序,细胞核形态正常;模型组大鼠脊髓结构紊乱,大量炎性细胞浸润,伴有囊性腔和空泡,神经元和细胞水肿,神经元数量明显减少;外泌体组脊髓损伤区组织结构紊乱、炎性细胞浸润减轻,脊髓空洞小,损伤恢复较好。假手术组脊髓组织中凋亡细胞较少。模型组细胞凋亡率高于假手术组,而外泌体组细胞凋亡率低于模型组(均P<0.05)。模型组脊髓组织cPLA2、AQP4、AQP9 mRNA及蛋白表达高于假手术组,而外泌体组脊髓组织cPLA2、AQP4、AQP9 mRNA及蛋白表达低于模型组(均P<0.05)。结论:BMSCs来源外泌体对脊髓损伤有一定改善作用,可下调cPLA2、AQP4、AQP9 mRNA及蛋白的表达。

泛素连接酶E4B介导PM20D2、PABPC1和TACO1蛋白质的泛素化验证

泛素连接酶E4B通过U-box基序可将经泛素活化酶(Ubiquitin-activating enzyme, E1)和泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme, E2)传递的泛素(Ubiquitin, UB)标记至底物蛋白质。探究3个蛋白质:金属蛋白酶M20家族蛋白质2(Peptidase M20 domain-containing protein 2,PM20D2)、多腺苷酸结合蛋白质1(Polyadenylate-binding protein 1,PABPC1)、细胞色素C氧化酶Ⅰ翻译激活剂(Translational activator of cytochrome C oxidase Ⅰ,TACO1)是否可被E4B介导泛素化。从HEK293细胞中提取总RNA,反转录为cDNA,以其为模板调取底物基因并构建重组质粒,利用大肠杆菌表达系统表达并纯化泛素化过程所需的各个相关蛋白质,通过蛋白质体外泛素化实验,对3个蛋白质进行泛素化验证。结果表明3个蛋白质均可以在蛋白质水平被E4B泛素化,证明3个蛋白质都是E4B的底物,为进一步在细胞中研究其泛素化的机理奠定基础。

E3泛素连接酶1对SOX2蛋白稳定性的影响

目的探讨WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1(WWP1)和E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)对3种转录因子[八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区Y-box蛋白2(SOX2)和NANOG蛋白]水平的影响。方法通过质粒转染,在HEK 293FT细胞中分别共表达OCT4、SOX2、NANOG和WWP1或WWP2。通过免疫印迹法检测WWP1或WWP2过表达对OCT4、SOX2、NANOG蛋白水平的影响。通过GST pull-down实验和免疫共沉淀实验分析WWP1与SOX2蛋白间的相互作用;运用体外蛋白质泛素化修饰实验证明WWP1是否为SOX2的特异E3泛素连接酶。结果在WWP1与OCT4、WWP1与SOX2及WWP2与OCT4共表达体系中,WWP1或WWP2均呈剂量依赖性地下调对应的共表达蛋白OCT4或SOX2水平,且以WWP1与SOX2共表达体系中SOX2蛋白的表达下调最为明显。在其他共表达体系中,WWP1或WWP2对对应的共表达蛋白均无明显的下调作用。溶酶体抑制剂氯喹可部分阻止SOX2蛋白水平的降低。放线菌酮(CHX)处理24 h后,WWP1与SOX2共表达体系中的SOX2蛋白水平的下降速度快于单独过表达SOX2(P<0.05)。WWP1可以通过与SOX2蛋白的直接相互作用催化SOX2蛋白的泛素化修饰。结论WWP1是SOX2蛋白新的E3泛素连接酶,可促进SOX2蛋白经泛素-溶酶体途径降解,进而下调SOX2蛋白的表达。

E3泛素连接酶WWP2通过蛋白酶体途径调控p21的稳定性

目的 探讨含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2 (WWP2)调控p21稳定性的潜在作用机制。方法 通过免疫共沉淀及Western blotting检测HEK 293T细胞中WWP2与p21的结合情况。用蛋白酶体抑制剂(MG132)和放线菌酮(CHX)处理过表达或敲减WWP2 HEK 293T细胞0、4、8 h,通过Western blotting检测p21的表达情况。结果 WWP2与p21间存在结合。过表达WWP2的293T细胞中,p21的表达水平明显降低,且随WWP2表达量增加逐渐降低。敲减WWP2的293T细胞中,p21表达水平增加。随着CHX作用时间延长,对照组和实验组的p21表达水平均逐渐下降。过表达组p21半衰期较对照组缩短;敲减组p21半衰期较对照组延长。随着MG132作用时间延长,对照组和实验组p21表达水平均逐渐上升。空载组较过表达组、敲减组较对照组p21积累均更显著。结论 E3泛素连接酶WWP2可与p21结合,并通过蛋白酶体途径降解p21。

胞浆Ca^(2+)和某些激酶对NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合的作用

为澄清中性粒细胞胞浆 Ca2 +和某些 O-·2 产生相关激酶对 NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合的作用 ,利用分化为中性粒细胞样的 HL- 60细胞研究了胞浆 Ca2 +螯合剂 BAPTA- AM和激酶抑制剂对这些激酶激活、NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合的影响 .使用 1 0 μmol/L的 Ca2 +螯合剂 BAPTA- AM去除胞浆 Ca2 +后 ,趋化肽 f MLP诱导的 O-·2 产生明显减少 ,但不影响 f MLP诱导的肌动蛋白聚合 ;8μmol/L的 PKC激酶抑制物 GF1 0 92 0 3x几乎完全抑制 O-·2 产生 ;50 μmol/L的p38激酶抑制物 SB2 0 3580、50 μmol/L的 ERK激酶抑制物 PD0 980 59和 0 .1 μmol/L的 PI3激酶抑制物渥曼青霉素 (Wortmannin)使 f MLP诱导的 O-·2 产生大约减少一半 ;其中 Wortmannin还抑制 f MLP诱导的肌动蛋白聚合 ;f MLP刺激细胞后 ,PI3- K、p38和 ERK激酶迅速激活 ,但这些激酶的激活对 Ca2 +是非必需的 .这些结果说明 Ca2 +依赖途径 (PKC)和 Ca2 +非依赖途径 (PI3- K、p38和ERK)对 NADPH氧化酶激活都起着重要作用 ,而 Ca2 +非依赖途径中的 PI3- K激酶还参与中性粒细胞样 HL- 60细胞的肌动蛋白聚合 .

泛素蛋白连接酶复合体KPC的研究进展

泛素蛋白酶体途径是真核生物体内最重要的蛋白质降解途径之一,其中,目标蛋白的泛素化过程涉及泛素激活酶、泛素结合酶和泛素蛋白连接酶(E3)。目标蛋白识别中起关键作用的是E3,Kip1泛素-促进复合体(KPC)是一种E3复合体,由KPC1和KPC2组成,KPC1在C端含有一个环指结构域作为催化亚基,是E3不可缺少的组成部分,KPC2含有一个类泛素结构域和两个泛素相关结构域。KPC广泛存在于真核生物中,在神经系统疾病、血液系统疾病、肿瘤疾病等方面起着重要的调控作用。

蛋白酶体抑制剂PS-341诱导U266细胞凋亡与胞浆内[Ca^(2+)]变化的关系

目的探讨蛋白酶体抑制剂PS-341(Bortezomib)诱导骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡时对其胞浆内[Ca2+]([Ca2+]i)的影响。方法以浓度梯度的PS-341干预U266细胞4h后收集,荧光显微镜观察细胞凋亡,AnnexinV-FITC/PI双参数流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡,Fluo-3/AM荧光素标记FCM检测[Ca2+]i。结果(1)PS-341作用U266细胞4h后荧光显微镜观察到凋亡细胞数随浓度增加而增多;(2)FCM检测凋亡细胞的比例分别为0.56%、7.71%、19.84%、31.10%、40.72%,与PS-341浓度成正比;(3)PS-341作用后U266细胞[Ca2+]i均值分别为403.65nmol/L、418.20nmol/L、378.65nmol/L、356.36nmol/L、349.21nmol/L;(4)PS-341诱导U266细胞凋亡时伴随[Ca2+]i的改变,浓度>50nmol/L时诱导的细胞凋亡伴随[Ca2+]i下降。结论蛋白酶体抑制剂PS-341诱导骨髓瘤细胞凋亡呈浓度依赖性;PS-341浓度>50nmol/L时下调[Ca2+]i,并由此发挥抗骨髓瘤细胞作用。

泛素蛋白连接酶1在大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜中的表达及意义

目的 研究胞质泛素蛋白连接酶1（KPC1）在大鼠颈动脉球囊损伤后的蛋白表达情况,探讨其在新生内膜形成过程中的生物学功能.方法 将成年雄性SD大鼠（450 ～ 500 g）随机分为假手术组和颈动脉球囊损伤模型组,建模后以左侧损伤动脉为实验组,同时以假手术组的左侧正常颈动脉为对照组.实验组大鼠于损伤后1d、3d、7d、14d、28d分别处死并取材,采用Western blot检测KPC1蛋白、内膜增殖细胞核抗原（PCNA）表达情况,以qRT-PCR检测KPC1的mRNA表达,苏木精-伊红（HE）染色后比较内膜增生程度;采用体外培养血管平滑肌细胞（VSMC）建立增殖模型,运用Western blot及qRT-PCR检测其KPC1蛋白、KPC1 mRNA表达特征.结果 Western blot结果显示,颈动脉球囊损伤后实验组KPC1蛋白表达水平明显低于正常对照组（P＜0.05）,而PCNA蛋白表达量明显高于正常对照组（P＜0.05）;qRT-PCR检测结果显示,实验组KPC1的mRNA水平明显低于对照组（P＜0.05）;HE染色结果示颈动脉球囊损伤后1d、3d时光镜下血管内膜增生不明显;7d时光镜下可见新生内膜,增生的VSMC向内膜下迁移,管腔开始狭窄;14d时,可见明显新生内膜,VSMC排列紊乱,内弹力膜断裂,管腔明显狭窄,内膜厚度超过中膜;28d时,血管内膜继续不规则增生,血管腔狭窄程度继续加重,狭窄超过50％.体外培养并模拟VSMC增殖,提取细胞进行Western blot和qRT-PCR检测显示,KPC1蛋白、KPC1 mRNA表达在血小板源性生长因子-BB刺激增殖后开始逐渐减低.结论 抑制KPC1基因表达可促进损伤内膜增生,其作用机制可能与促进VSMC增殖有关.

蛋白酶激活受体-2介导A549细胞胞浆游离钙的释放

目的:研究蛋白酶激活受体(PAR)2激动剂(SLIGKV和tc LIGRLO)、胰蛋白酶及其抑制剂(SBTI、α1AT)对A549肺上皮细胞胞浆内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响。方法:用Fluo3AM荧光标记技术和激光扫描共聚焦显微镜检测不同因素处理的A549肺上皮细胞[Ca2+]i。结果:胰蛋白酶、SLIGKV、tc LIGRLO均能引发A549肺上皮细胞[Ca2+]i的增加,平均荧光强度分别比加入试剂前增加92%,47%和130%。SBTI和α1AT可抑制胰蛋白酶诱导的细胞[Ca2+]i的增加。结论:PAR2可介导A549肺上皮细胞[Ca2+]i的释放增加,SBTI和α1AT可抑制胰蛋白酶诱导的细胞[Ca2+]i的增加。

胞浆型磷脂酶A_2介导弱氧化修饰低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡

探讨弱氧化修饰低密度脂蛋白 (MM LDL)能否诱导人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)凋亡以及胞浆型磷脂酶A2 (cPLA2 )在此过程中的作用 .MTT法测定细胞存活率 ;相差显微镜、荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞凋亡 ;3 H 花生四烯酸 (3 H AA)预标法测定PLA2 活性 ;蛋白质印迹检测cPLA2 磷酸化 ;激光共聚焦显微镜检测单个细胞内钙离子浓度的变化 .结果表明 ,MM LDL (10 0～ 30 0mg/L)作用后的HUVECs呈现凋亡典型的形态特征 ,凋亡率随MM LDL浓度的增加而上升 .MM LDL能引起胞内钙离子浓度增加 ,cPLA2 的活化及磷酸化 .15 μmol/LAACOCF3 和 5mmol/LEGTA在抑制cPLA2 活性的同时 ,部分抑制MM LDL诱导的HUVECs凋亡 .加入外源性AA (5 0 μmol/L)能逆转AACOCF3 引起的凋亡抑制 .结果提示 ,cPLA2 参与了MM LDL诱导HUVECs凋亡的信号传递 .

膜联蛋白Ⅰ和胞浆磷脂酶A2在小鼠腭突融合中的表达

目的观察膜联蛋白Ⅰ(Annexin Ⅰ)和胞浆磷脂酶A2(cPLA2)在地塞米松致畸敏感性小鼠腭胚中的分布情况.方法沿小鼠胚胎头部的冠状平面切取切片,获得10周龄近交系小鼠妊娠的第14～16天的腭胚突.用免疫组化染色检测Annexin Ⅰ和cPLA2的分布情况.结果在小鼠胚胎腭突融合前后,Annexin Ⅰ、cPLA2的免疫组织化学染色在腭突上皮和间充质细胞中都为阳性,并且染色强弱呈时相性变化.结论Annexin Ⅰ和cPLA2在胚胎腭部发育进程中起一定的调节作用,可能是地塞米松诱导发生腭裂的重要介质.