产甘油假丝酵母与酿酒酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因的功能比较

胞浆3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)是酿酒酵母细胞甘油合成过程中的关键限速酶.尽管高产甘油菌株产甘油假丝酵母基因组中编码该酶的基因CgGPD已经被克隆出来,但是具体的功能,特别是与酿酒酵母GPD1和GPD2基因的功能比较值得进一步研究.以酿酒酵母渗透压敏感型的gpd1/gpd2和gpd1突变株为宿主,分别导入CgGPD、GPD1和GPD2基因,比较分析了CgGPD、GPD1和GPD2基因在高渗透压胁迫条件下和厌氧环境中的表达调控,及其对细胞甘油合成能力的影响.研究发现,GPD1基因受到渗透压诱导表达,GPD2基因在细胞厌氧条件下起着氧化还原平衡调节作用,而CgGPD基因不仅能够在渗透压胁迫条件下通过过量快速合成甘油调节渗透压平衡,而且能够在厌氧培养环境中互补GPD2基因的缺失,使gpd1/gpd2缺失突变株能够正常生长,同时提高了突变株的甘油合成能力.结果表明,CgGPD基因在gpd1/gpd2缺失突变株中既具有GPD1基因的功能,又能发挥GPD2基因的功能.

产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因(CgGPD)功能分析

【目的】从高产甘油生产菌株产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)基因组中克隆了NAD^+依赖3-磷酸甘油脱氢酶编码基因(CgGPD),但是该基因及其上游调控序列具体的功能还是未知的。本文研究了CgGPD基因及其上游调控序列的功能。【方法】本文以酿酒酵母(Saccharomyces cere- visiae)及其渗透压敏感型突变株为宿主,构建3种不同的酵母表达载体导人酵母细胞,研究了不同酵母转化子在渗透压胁迫条件下CgGPD基因表达对细胞的耐高渗透压胁迫应答及其细胞的甘油合成能力的影响。【结果】实验结果表明无论是以来源于S.cerevisiae的TPI启动子还是来源于CgGPD基因的启动子,过量表达CgGPD基因的转化子均能够显著加速葡萄糖消耗速度和提高甘油合成能力,在gpd1/gpd2突变株中表达CgGPD基因能够消除细胞对外界高渗透压的敏感性,同时转化子胞内甘油大量积累。【结论】CgGPD基因在野生型酵母S.cerevisiae W303-1A表达显著提高细胞的甘油合成能力,在gpd/1gpd2突变株中能够互补GPD1基因的功能,CgGPD基因表达受渗透压诱导调控。

酿酒酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶的两个同工酶

酿酒酵母细胞中的NAD+ 依赖性胞浆 3 磷酸甘油脱氢酶是甘油代谢途径中的关键酶之一 ,催化磷酸二羟丙酮生成 3 磷酸甘油 ,它有两个同工酶。深入研究它们的结构 ,编码基因的表达调控以及它们在细胞中的作用的异同 ,有助于进一步了解酵母细胞对高渗和缺氧环境做出应答的机理。本文对酿酒酵母胞浆 3 磷酸甘油脱氢酶的两个同工酶的上述 3方面进行了综述。

利用荧光蛋白研究产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子

【目的】克隆产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD的启动子(PCggpd),并通过报告基因gfp的差异表达来研究葡萄糖浓度对PCggpd在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的诱导特性。【方法】采用PCR扩增的方法分别从产甘油假丝酵母基因组和pCAMBIA1302载体中克隆出CgGPD的启动序列PCggpd和绿色荧光蛋白基因gfp。将两个基因同时构建到酿酒酵母表达载体pYX212-zeocin中,构建时将绿色荧光蛋白基因gfp置于CgGPD的启动序列下游,获得重组质粒pYX212-zeocin-PCggpd-gfp。通过电击转化酿酒酵母W303-1A。将重组酿酒酵母S.cerevisiae W303-1A-GFP置于不同葡萄糖浓度培养基中进行培养,利用荧光显微技术对其进行荧光检测。【结果】重组酿酒酵母能产生稳定的荧光,当葡萄糖浓度为2%时,重组酿酒酵母在YEPD培养基中产生较弱的荧光,随着葡萄糖浓度的升高,荧光强度有明显的增强。【结论】PCggpd属于环境胁迫诱导型启动子,高浓度的葡萄糖能诱导PCggpd启动绿色荧光蛋白的高水平表达,这对完善产甘油假丝酵母的遗传背景研究,阐明其高产甘油的机理具有重要意义。

马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、序列分析及编码产物B细胞表位预测

根据GenBank中马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(BmG3PD基因)序列设计引物,以马来丝虫mRNA为模板,RT-PCR扩增BmG3PD基因,将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及PCR鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmG3PD,经序列分析及同源性比较,以及对其编码产物进行B细胞表位预测,结果表明PCR扩增的特异性条带为1020bp,与预期相符,与GenBank已知基因序列同源性为99%。编码产物B细胞表位预测,氨基酸区域可能在22～36、242～255、303～318和326～336位。

牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),并将其置于大肠杆菌中作融合表达。方法利用PCR技术,克隆GAPDH,插入克隆载体pMD18-T中得到克隆重组子pMD18-T-GAPDH。克隆重组子与表达载体pET-32a双酶切后连接构建表达质粒pET-32a-GAPDH。重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,以不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果核酸序列测定与分析表明:表达重组子pET-32a-GAPDH与NCBI核酸数据库中收录的GAPDH序列同源性达99.802%;在最佳浓度的IPTG诱导下,GAPDH可高效表达。结论本实验成功克隆了牙龈卟啉单胞菌GAPDH基因,并在大肠杆菌中表达了GAPDH蛋白,为后续实验研究GAPDH的免疫学性能及相应的抗体制备奠定了基础。

环形泰勒虫3-磷酸甘油醛脱氢酶的原核表达、多克隆抗体制备及亚细胞定位

为了研究环形泰勒虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的功能,本试验利用PCR技术从环形泰勒虫裂殖体cDNA中扩增环形泰勒虫GAPDH(TaGAPDH)基因,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合蛋白诱导表达,融合蛋白纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,分别用间接ELISA和Western blotting检测抗体的效价和特异性;利用激光共聚焦荧光显微镜观察TaGAPDH蛋白在环形泰勒虫裂殖体中的亚细胞定位。结果显示,克隆得到了TaGAPDH全长基因,大小为1 020bp;SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白大小约44ku,且以包涵体形式存在。制备的多克隆抗体效价高达1∶12 800,具有很高的特异性;亚细胞定位显示TaGAPDH蛋白主要分布于环形泰勒虫裂殖体细胞质内。以上结果表明本试验成功克隆表达了TaGAPDH基因,并制备了针对TaGAPDH蛋白的兔多克隆抗体,为筛选环形泰勒虫病疫苗、药物靶点及研究环形泰勒虫能量代谢奠定了基础。

胞质3-磷酸甘油醛脱氢酶在ABA与H2O2介导的氧化应激中的潜在作用

【目的】研究胞质3-磷酸甘油醛脱氢酶(cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPC)在植物脱落酸(abscisic acid,ABA)和过氧化氢(hydrogen peroxide,HO)介导的氧化应激中的潜在作用。【方法】通过目前的研究结果对ABA和HO信号转导过程及GAPC的多功能性进行总结。【结果】ABA是响应植物非生物胁迫和气孔关闭的重要激素,HO是ABA介导应激反应的关键信号分子,GAPC因半胱氨酸残基上存在易被氧化修饰的巯基分子,所以在本身的催化功能之外还具有信号转导功能。在氧化胁迫下,GAPC参与了植物HO依赖性信号转导的过程,并作为修饰蛋白发挥其多功能性。【结论】GAPC通过“兼职”或调控初生代谢的转变来响应氧化胁迫。

猪鼻支原体3-磷酸甘油醛脱氢酶表达及黏附细胞功能研究

利用原核表达载体pET-28a(+)构建猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis, Mhr)的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)重组表达菌,研究GAPDH黏附宿主细胞的功能。结果表明:成功构建了表达rMhr-GAPDH的重组工程菌,利用IPTG诱导蛋白表达,镍柱亲和层析纯化,成功获得高纯度的rMhr-GAPDH重组蛋白。用重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,对Mhr液体培养物和固体菌落进行免疫杂交,均可检测到GAPDH,提示其可表达于菌体表面。将rMhr-GAPDH蛋白与人气道上皮细胞NCI-H292共孵育,利用间接免疫荧光试验可检测到黏附在细胞上的重组蛋白,利用微孔板黏附试验进一步证明rMhr-GAPDH蛋白与细胞膜蛋白的结合具有剂量依赖性,并可为其抗体所抑制。该研究构建表达和纯化了Mhr的GAPDH重组蛋白,检测到其在菌体表面的表达,并证明其具有黏附细胞能力,这有助于进一步研究Mhr黏附感染的致病机制。

嗜酸乳杆菌3-磷酸甘油醛脱氢酶的分离纯化

目的分离纯化嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 4356的3-磷酸甘油醛脱氢酶。方法利用硫酸铵分级沉淀法、亲和层析、阴离子交换和分子筛层析对嗜酸乳杆菌GAPDH进行了分离纯化。通过N端测序鉴定了纯化产物;并用分子筛测定了嗜酸乳杆菌GAPDH的相对分子质量(Mr)。结果纯化产物在SDS-PAGE胶上呈现Mr为3.7×104的单一条带,产量为0.9 mg/L(嗜酸乳杆菌培养物)。N端测序结果证明纯化产物为嗜酸乳杆菌GAPDH。分子筛测定的GAPDH的Mr为7.08×104,表明嗜酸乳杆菌GAPDH是二聚体。结论通过该纯化方案,可大量获得电泳纯的嗜酸乳杆菌GAPDH,为进一步研究其免疫功能以及开发为免疫促进剂打下了基础。

盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶不同结构域蛋白的表达纯化及其抗体的制备与分析

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是迄今为止世界上发现的最耐盐的真核光合生物,而甘油是盐藻用于调节细胞内外渗透压变化的关键调渗物质.3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)是盐生杜氏藻甘油合成途径中的关键酶.与已经报道的其它物种的GPDH基因不同,盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶(Ds.GPDH)基因具有两个独立的功能结构域,即丝氨酸磷酸化酶结构域(SGPP domain)和3-磷酸甘油脱氢酶结构域(GPD domain).本实验在已克隆的Ds.GPDH2基因的基础上,以含GPDH2全基因序列的T质粒载体(pMD18-T-GPDH2)为模板,PCR扩增分别得到两个单结构域片段(SGPP与GPD),以及双结构域片段(GPDH),构建了pET32a-SGPP、pET32a-GPD和pET32a-GPDH三种原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达.纯化蛋白制备抗原,制备出3个多克隆抗体.WesternBlot和交叉反应分析显示通过重组蛋白制备的多克隆抗体具有很高的特异性.

谷子3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆与结构分析

3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)在谷子盐旱胁迫早期高频率表达,为研究该基因在胁迫反应及其他代谢中的详细功能,本研究利用RACE技术克隆了谷子的GAPDH基因。该基因cDNA全长1 328 bp,包括1 008 bp的开放阅读框,共编码338个氨基酸,肽段的分子量为35 911.03 Da,极性氨基酸占29.12%。序列比较分析发现,谷子的GAPDH同玉米的同源序列表现了最高的相似性,同水稻和小麦同源序列的相似性次之,同双子叶植物的同源序列则相差较远。

植物3-磷酸甘油醛脱氢酶的多维本质(英文)

3-磷酸甘油醛脱氢酶 GAPDH 作为一种糖酵解蛋白在糖酵解的能量产生中发挥着重要作用 .它通常作为一种模式蛋白用于蛋白和酶的分析 ,也可以用作研究基因表达量的内在对照 .然而 ,最近的相关研究表明 ,真核及原核生物的 3-磷酸甘油醛脱氢酶实际上存在着一种多维本质 ,研究证明它在 DNA修复、细胞凋亡、核 RNA输出、及其在细胞周期中都发挥着重要的作用 .尽管该酶在植物中的研究不如在哺乳动物中的深入 ,但研究已经陆续证明 ,3-磷酸甘油醛脱氢酶在植物中同样具有许多未被发现的功能 ,目前已经报道该酶在厌氧、热激、伤害以及能量供应中可能发挥着重要作用 .本文旨在就国内外对于该酶在植物中的研究作一总结论述 ,以期推进科学界对它的更深入认识和研究 .

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.

不同胁迫下盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因表达及其与甘油合成的响应

在已克隆的盐藻(Dunaliella salina)3-磷酸甘油脱氢酶GPD基因的基础上,利用实时荧光定量PCR的方法,研究了经高盐、厌氧、磷酸盐以及氧化等不同外界胁迫条件下该基因的表达情况,并同时监测了盐藻细胞甘油合成的动态变化.对比酿酒酵母的GPD基因,发现D.salina GPD基因受高渗诱导,同时D.salina细胞内可能存在多个形式的GPD基因.

日本血吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶的克隆 表达及结构预测

目的 克隆、表达日本血吸虫（大陆株）3-磷酸甘油醛脱氢酶（SjcGAPDH）编码基因并作结构预测。方法 将编码SjeGAPDH的pBlueseript质粒用限制性内切酶XhoⅠ和SacⅠ消化后，收集目的片段，与经同样酶切的原核表达载体pET28b连接，筛选重组克隆并测序，将正确的重组质粒转化入BL21（DE3）感受态细菌，异丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白。用GeneRunner软件对该蛋白的结构及抗原表位进行预测。结果 十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）观察到大小约42．7kDa的特异性蛋白条带，与预计一致。免疫印迹试验（Western blot）结果表明致弱尾蚴免疫兔血清可识别该重组蛋白。结构预测表明SjcGAPDH的第50～70、102～122、135～148、165～175、187-205、254-272、278-285位氨基酸区域可能为蛋白质的抗原优势区域。结论 SjcGAPDH编码基因克隆、表达获得成功，为开展该分子功能和免疫原性研究奠定了基础，对GAPDH的结构和性质预测为探索该蛋白的抗原优势表位提供了理论依据。

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白的纯化、酶学活性及免疫学研究

目的体外制备华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白(CsGAPDH),分析其酶学活性及免疫学特性。方法常规表达重组质粒pGEX-4T-1-GAPDH,用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和纯化试剂盒纯化重组蛋白,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),用凝血酶和纯化柱酶切、纯化的CsGAPDH免疫BALB/c小鼠,制备抗血清。ELISA检测抗IgG抗体滴度,浓缩型S-P免疫组化3步法检测CsGAPDH抗原在免疫小鼠体内的分布和表达。蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其抗血清的特异性。建立酶反应体系测定重组蛋白CsGAPDH的酶催化活性。结果纯化蛋白样品呈单一条带。免疫动物获取CsGAPDH抗血清,在免疫过程中抗体滴度呈连续上升趋势。CsGAPDH抗原分布和表达于小鼠肌细胞膜部位。免疫小鼠血清具有抗CsGAPDH特异性抗体。重组蛋白CsGAPDH具有酶生理活性,其酶活力单位为2 872 U min-1.ml-1。结论制备的重组蛋白CsGAPD H具有较好的酶活性和免疫原性。

多发性硬化患者CSF3-磷酸甘油醛脱氢酶反应性抗体水平的改变及其临床意义

目的探讨多发性硬化(MS)患者CSF 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)反应性抗体水平的改变及其临床意义。方法采用ELISA法检测23例MS及17例其他炎症性神经系统疾病(OIND)、13例其他非炎症性中枢神经系统疾病(ONIND)患者的CSF GAPDH反应性抗体水平。分析MS患者CSF GAPDH反应性抗体水平与其性别、年龄和扩展残疾状况量表(EDSS)评分的关系。结果 MS组CSF GAPDH反应性抗体水平显著高于OIND组和ONIND组(P<0.01,P<0.05);男性与女性MS患者CSF GAPDH反应性抗体水平的差异无统计学意义。Spearman相关分析显示,MS患者的CSF GAPDH反应性抗体水平与其年龄、EDSS评分均无关(rs=-0.197,rs=0.327;均P>0.05)。结论 MS患者的CSF GAPDH反应性抗体水平显著升高,并且与患者的性别、年龄及病情无明显关系。

日本血吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶的抗原性和保护性免疫力的研究

３－磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡＰＤＨ），是血吸虫糖酵解中的重要酶，参与虫体内多种代谢功能，在抗血吸虫疫苗的研制中亦受到重视曼氏血吸虫ＧＡＰＤＨ３７ｋＤａ抗原性与保护性免疫力已被证实［１］，日本血吸虫菲律宾株ＧＡＰＤＨ克隆及具有生物活性重组体的特性与免疫原...